DNA的损伤与修复.ppt

分子生物学作业内容 第五章DNA的损伤与修复 1 第五章DNA的损伤与修复 1 DNA损伤的产生 2 基因的突变 3 DNA损伤的修复 4 损伤跨越 5 DNA修复缺陷与癌症的关系 3 概况 作为遗传物质的DNA具有高度的稳定性 但是 细胞内外环境中各种因素依然可以造成DNA的损伤 如果DNA的损伤得不到有效的修复 就会造成DNA分子上可遗传的永久性结构变化 称为突变 mutation 少数突变有可能对细胞是有利的 但绝大部分突变是有害的 细胞有多种形式的修复系统 使绝大多数损伤能够及时修复 研究DNA损伤与修复的机制 有两个方面的实际意义 其一 防止DNA的损伤 是预防不少疾病的有效途径 其二 在育种工作中 常常要诱发突变再筛选有优良性状的植株或微生物株系 4 5 1DNA损伤的产生 5 DNA损伤指在内外因素的影响下 体内DNA双螺旋结构发生的任何改变 若碱基的改变是两种嘌呤或两种嘧啶之间的互换 称作转换 transitions 若发生了嘌呤和嘧啶之间的互换 则称作颠换 transversions 引起DNA损伤的因素很多 包括DNA分子本身在复制过程中发生的自发性改变 以及细胞内各种代谢物质和外界理化因素引起的损伤 6 5 1 1DNA分子的自发性损伤 DNA的自发性损伤可以发生在复制过程中 也可以由细胞自身产生的活性氧或代谢产物造成 根据DNA损伤的状况 和引起DNA损伤的原因 可以将DNA的自发性损伤分作6种类型 7 5 1 1 1互变异构移位 互变异构移位 tautomericshift 是碱基发生了烯醇式 酮式结构互变 造成碱基配对发生改变 使复制后的子链上出现错误 生理条件下 碱基上的基团主要以酮式和氨基的形式存在 但也可能发生瞬间的互变异构 造成碱基错配 如图所示 若A以稀有的亚氨基形式出现 即可与C配对 经过DNA的两轮复制 在1 4的子代分子中 A T对变成了G C对 因此在DNA复制时 若模板上出现烯醇式或亚氨基异构体时 子链上就可能产生错配的碱基对 8 5 1 1 2自发脱氨基 DNA分子中碱基的环外氨基有时会自发脱落 结果使C变为U A变为I G变为X 黄嘌呤 在DNA复制时 母链的上述变化会在子链中产生错误而导致损伤 A I C 下一轮G C 引起AT GC的变 C U A 下一轮T A 引起GC AT的突变 G X C 下一轮G C 损伤不扩大 9 5 1 1 3DNA复制的打滑 在DNA复制时 有时会出现模板链或新生链碱基的环出 loopingout 现象 被称作DNA聚合酶的 打滑 slippage 如图所示 第一次复制时新生链一个或数个碱基的环出 在第二次复制时 可引起同样数量碱基的插入 第一次复制时模板链一个或数个碱基的环出 在第二次复制时 可引起同样数量碱基的缺失 这种错误易发生在模板上有碱基串联重复的部位 这些部位即使发生碱基的环出 后面的碱甚配对仍然是正确的 10 11 5 1 1 4活性氧引起的DNA损伤 活性氧指反应活性很高的含氧自由基和H2O2 不少含氧自由基可在细胞正常代谢过程中生成 含氧自由基可造成碱基的氧化 如7 8 二氢 8 氧鸟嘌呤 7 8 oxoG GO 就是一种氧化碱基 可与C或A配对 造成G C T A的颠换 DNApolI和DNApolII的校正活性不能校正其错配 故这种损伤可以积累 12 5 1 1 5碱基丢失 DNA在生理条件下可通过自发性水解 使嘌呤碱和嘧啶碱从磷酸脱氧核糖骨架上脱落下来 细胞受热或pH降低 可加剧脱嘌呤反应 强致癌剂黄曲霉毒素B1也能加剧脱嘌呤反应 13 5 1 1 6碱基的烷基化 细胞内一些天然的烷基化试剂 如S 腺苷甲硫氨酸 可使DNA分子中的某些碱基甲基化 造成碱基错配 经DNA复制 形成碱基对的改变 14 5 1 2物理因素引起的DNA损伤 DNA分子容易吸收波长在260nm左右的紫外线 UV 大剂量的UV照射 可以使DNA分子一条链上相邻的两个嘧啶共价结合 形成环丁烷嘧啶二聚体 相邻的两个T或两个C 以及C和T之间均可形成嘧啶二聚体 但最易形成的是T T二聚体和6 4光产物 15 电离辐射如X射线和 射线等 可以引起DNA的直接损伤和间接损伤 DNA链的断裂会随着照射剂量的增大而加剧 若DNA双链中只有一条链断裂 称为单链断裂 若两条链在同一处或紧密相邻处同时断裂 则为双链断裂 16 5 1 3化学因素引起的DNA损伤 许多天然的或合成的有机和无机化学物质均可与DNA发生反应 改变其结构 能诱发DNA损伤的化学物质称化学诱变剂 mutagen 常见的化学诱变剂可以大致分为3类 17 5 1 3 1碱基类似物 碱基类似物 baseanalog 能在DNA复制时取代正常碱基与模板链的碱基配对 从而掺人DNA 2 氨基嘌呤 AP 是腺嘌呤的类似物 通常与胸腺嘧啶配对 以罕见的亚氨基状态存在时 可以与胞嘧啶配对 使A T变为G C 相反情况下 则可将G C变为A T 18 5 1 3 2碱基的修饰剂 某些化学物质通过对DNA分子上碱基的修饰 basemodification 改变其配对性质 例如 亚硝酸能脱去连接在碱基环上的氨基 使腺嘌呤脱氨基形成次黄嘌呤 I 后者与胞嘧啶配对 而不与胸腺嘧啶配对 胞嘧啶脱氨基后成为尿嘧啶 与腺嘌呤配对 羟胺 NH2OH 与DNA分子上碱基的作用特异性很强 它只与胞嘧啶作用 生成4 羟胺胞嘧啶 HC 后者与腺嘌呤配对 结果使G C对变为A T对 19 20 烷化剂 alkylatingagent 能使DNA碱基上的氮原子烷基化 最常见的是鸟嘌呤第6位氮原子的烷基化 改变碱基配对性质 如6 甲基鸟嘌呤 MG 与胸腺嘧啶配对 如果直接与配对有关的基团被烷化 则可完全阻断复制时的碱基配对 较常见的烷化剂有亚硝胺化合物 包括二甲基亚硝胺和二乙基亚硝胺 亚硝基胍 NTG 化合物如N N 硝基 N 甲基亚硝基胍 亚硝基脲化合物如乙基亚硝基脲 烷基硫酸盐化合物 包括二甲基硫酸盐 乙基甲基硫酸盐 EMS 和乙基乙基硫酸盐 EES 此外 还有氮芥和硫芥等 21 5 1 3 3嵌入染料 一些扁平的稠环分子 如吖啶橙 acridineorange 原黄素 proflavin 溴化乙锭 ethiduiumbromide EB 等染料 可插入到DNA分子碱基对之间 故称为嵌入染料 intercalateddye 这些扁平分子插入DNA后正好占据了一个碱基的位置 将碱基对间的距离加大约1倍 可造成DNA两条链的错位 22 细胞内存在完善的DNA损伤修复系统 以保障遗传物质的稳定性 不同类型的DNA损伤 由不同的途径进行修复 根据修复的机理 DNA损伤的修复一般可分为直接修复 切除修复 双链断裂修复 易错修复和重组修复等 23 1 点突变点突变指DNA单位分子上所发生的碱基对改变 也称为简单突变或单一位点突变 其最主要形式为碱基对置换 分为转换和颠换两种类型 有时 发生在单个位点上的少数核苷酸缺失或插入也被认为点突变 点突变带来的后果取决于其发生 5 2基因的突变 24 基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的可遗传的变异 从分子水平上看 基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变 基因虽然十分稳定 能在细胞分裂时精确地复制自己 但这种隐定性是相对的 在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式 就是在一个位点上 突然出现了一个新基因 代替了原有基因 这个基因叫做突变基因 于是后代的表现中也就突然的祖先从未有的新性状 25 尽管细胞内的修复系统能及时修复绝大多数的DNA损伤 但修复系统并不是万无一失的 如果损伤在下一轮DNA复制之前还没有被修复 有的会被固定下来传给子代细胞 有的则通过易错的跨损伤合成产生新的错误 并最终也被保留下来 因此 生物体难免会发生这样那样的突变 并带有一定的基因 基因组 细胞或个体被称为突变体 单细胞生物能够将新产生的突变基因直接传给其后代 而多细胞生物能否将突变传给后代则取决于突变四发生在生殖细胞还是体细胞 如果突变发生在生殖细胞 则可以传给后代 如果是发生在体细胞 则一般不会传给后代 除非后代是由突变的体细胞克隆而成的 26 突变的类型5 2 1突变的类型5 2 2突变的回复和校正5 2 3诱变剂和致癌剂的检测 27 点突变也称作单碱基替换 singlebasesubstitution 指由单个碱基改变发生的突变 可以分为转换和颠换两类 转换 嘌呤和嘌呤之间的替换 或嘧啶和嘧啶之间的替换 颠换 嘌呤和嘧啶之间的替换 点突变带来的后果取决于其发生的位置和具体的突变方式 如果是发生在基因组的垃圾DNA上 因为其碱基序列缺乏编码和调节基因表达的功能 就不可能产生任何的后果 如果发生在一个基因的启动子或其他基因表达的调控区 则可能会影响基因表达的 28 1 沉默突变 由于遗传密码又兼性 若突变的密码子编码同样的氨酸一般对蛋白质的结构和功能没有影响同义突变因此被称为沉默突变或同义突变 2 错义突变 missensemutation 碱基对的置换使mRNA的某一个密码子变成编码另一种氨基酸的密码子的突变称为错义突变 错义突变可导致机体内某种蛋白质或酶在结构及功能发生异常 从而引起疾病 如人类正常血红蛋白 链的第六位是谷氨酸 其密码子为GAA或GAG 如果第二个碱基A被U替代 就变成GUA或GUG 谷氨酸则被缬氨酸所替代 形成异常血红蛋白HbS 导致个体产生镰形细胞贫血 产生了突变效应 29 3 无义突变和通读突变无义突变 若突变使为氨基酸编码的密码子变为终止密码子 导致多肽链的合成被中断 如Cys的密码子变成TGC突变成终止密码子TGA 通读突变 若突变使终止密码子变成了为氨基酸编码的密码子 会使mRNA在翻译的时候发生通读 从而使肽链加长 也称加长突变 如果突变发生在蛋白质基因的内含子序列 一般对表达产物没影响 但有时可影响到个别基因的转录 转录后加工或翻译等 如果突变发生在基因表达的调控区 则可能影响记忆表达的效率 甚至完全关闭基因的表达 从而引起生物体表现型的变化 30 移码突变 在正常地DNA分子中 碱基缺失或增加非3地倍数 造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变 这种现象称移码突变 例如原来的mRNA是GAA GAA GAA GAA 按照密码子所合成的肽链是一个谷氨酸的多肽 如果开头增加一个G 那么mRNA就变成了GGA AGA AGA AGA 按照这些密码子合成的肽链就是一个一甘氨酸开头的精氨酸的多肽 移码突变的结果将引起该段肽链的改变 而肽链的改变将引起蛋白质性质的改变 最终引起性状的变异 严重是会导致个体的死亡 隐性突变和显性突变隐形突变 在真核生物中 如果只发生在同源染色体其中的一条上 另一条同源染色体上正常基因的产物能够抵消或中和突变基因对细胞功能的可能的改变 如果突变发生在同源染色体上的两个等位基因都发生突变 才能改变生物的表现型 显性突变 在真核生物中有一些基因 只要同源染色体任意一个等位基因发生突变 就引起生物的表现型的改变 31 校正突变的分类1 基因内校正2 基因间校正3 迂回校正5 2 3诱变剂和致癌剂的检测 32 由于基因突变而是生物体的性状由野生型变为突变型 则这样的突变称作正向突变 回复突变 reversemutation 突变体 mutant 经过第二次突变又完全地或部分地恢复为原来的基因型和表现型 完全恢复是由于突变的碱基顺序经第二次突变后又变为原来的碱基顺序 故亦称真正的回复突变 部分恢复是由于第二次突变发生在另一部位上 其结果是部分恢复原来的表现型 亦称为第二位点突变 secondsitemutation 或基因内校正 intragenicsuppression 校正突变 指发生在另外一个位点上 且能够中和或抵消起始突变的第二次突变 33 诱变剂和致癌剂的检测自然条件下发生的突变称为自发突变 其发生的频率非常低 大肠杆菌和果蝇的自发突变率都在10左右 能够提高突变率的诱变剂主要有物理诱变剂和化学诱变剂两类 物理诱变剂通过离子辐射如吸收X射线和r射线 引起目标分子的电子转移 造成DNA发生广泛的损伤 化学诱变剂主要是通过对碱基的修饰 碱基对的插入或缺失起作用 原癌基因 控制细胞分裂的基因发生突变继而引发癌变 这样的基因称为原癌基因 抑癌基因 表达的产物有抑制癌症的作用的基因 34 Ames试验污染物对人体的潜在危害 引起人们的普遍关注 世界上已发展了百余种短期快速测试法 检测污染物的遗传毒性效应 目的和原理鼠伤寒沙门氏菌 Salmonellatyphimurium 的组氨酸营养缺陷型 his 菌株 在含微量组氨酸的培养基中 除极少数自发回复突变的细胞外 一般只能分裂几次 形成在显微镜下才能见到的微菌落 受诱变剂作用后 大量细胞发生回复突变 自行合成组氨酸 发育成肉眼可见的菌落 某些化学物质需经代谢活化才有致变作用 在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶 可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足 鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关 故此法现广泛应用于致癌物的筛选 35 步骤和方法Ames试验的常规方法有斑点试验和平板掺入试验 1 菌株鉴定用于测试的菌株 需经基因型和生物学性状鉴定 符合要求才能投入使用 目前推荐使用的一套菌株是TA97 TA98 TA100和TA102自发回变相似 为阴性 鉴定前先进行增菌培养 为鉴定结果可靠 需同时培养野生型TV菌株 作为测试菌基因型之对照 增菌培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基 接种后于37 100r min振荡培养12h左右 细菌生长相为对数期末 含菌数应为1 109个 ml 2 109个 ml 2 斑点试验吸取测试菌增菌培养后的菌液0 1ml 注入融化并保温45 左右的上层软琼脂中 需S9活化的再加0 3ml 0 4mlS9mix 立即混匀 倾于底平板上 铺平冷凝 用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘 纸片浸湿受试物溶液 或直接取固态受试物 贴放于上层培养基的表面 同时做溶剂对照和阳性对照 分别贴放于平板上相应位置 平皿倒置于37 温箱培养48h 在纸片外围长出密集菌落圈 为阳性 菌落散布 密度与自发回变相似 为阴性 36 3 平板掺入试验将一定量样液和0 1ml测试菌液均加入上层软琼脂中 需代谢活化的再加0 3ml 0 4mlS9mix 混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝 同时做阴性和阳性对照 每种处理做3个平行 试样通常设4个 5个剂量 选择剂量范围开始应大些 有阳性或可疑阳性结果时 再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系 培养同上 同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比 为致变比 MR MR值 2 且有剂量 反应关系 背景正常 则判为致突变阳性 37 5 3DNA损伤的修复 38 5 3 1直接修复 直接修复也称为损伤逆转 其修复的方式是用特定的化学反应使受损伤的碱基恢复为正常的碱基 是最简单 最直接的修复方式 能被这种机制修复的损伤有嘧啶二聚体 6 烷基鸟嘌呤和某些链的断裂 39 5 3 1 1嘧啶二聚体的直接修复 嘧啶二聚体是一种常见的DNA损伤 可导致双螺旋发生扭曲 而影响DNA复制和转录 嘧啶二聚体既可被直接修复 也可被切除修复 参与其直接修复的酶是DNA光复活酶或光裂解酶 该酶广泛存在于原核和真核生物的细胞中 是Mr为5 5 104 6 5 104的单体酶 含两个光吸收辅因子和FADH 一旦嘧啶二聚体被直接修复 光裂解酶就与DNA解离 光复活酶广泛存在于细菌 真菌 果蝇 植物和很多脊椎动物中 但在哺乳动物中却没有这种酶 因而不能进行嘧啶二聚体的直接修复 40 5 3 1 2烷基化碱基的直接修复 烷基化碱基的直接修复是在烷基化转移酶的作用下完成的 E coli中的6 烷基鸟嘌呤 4 烷基胸腺嘧啶和甲基化的磷酸二酯键由Ada酶直接修复 Ada酶以活性中心的1个Cys残基为甲基受体 但是一旦它得到甲基 酶就失活 因此是一种自杀酶 可是这个修复途径只需一步反应 此外 这种损伤可以由DNA连接酶直接修复 41 5 3 2切除修复 切除修复 excisionrepair 需要先识别损伤部位 然后切除损伤的碱基或核苷酸 用正常的碱基或核苷酸填补缺口 用连接酶连接切口 切除修复有两种 a 碱基切除修复b 核苷酸切除修复两者识别损伤的机制不同 前者是直接识别具体的受损伤的碱基 后者识别的是损伤对DNA双螺旋结构的扭曲 42 5 3 2 1碱基切除修复 碱基切除修复 baseexcisionrepair BER 首先作用于N 糖苷键 切除受损伤的碱基 比如尿嘧啶 次黄嘌呤 烷基化碱基 被氧化的碱基和其他一些被修饰的碱基等 随后 再进行进一步的修复反应 BER适用范围 较轻的碱基损伤催化碱基切除的酶 DNA糖苷酶几乎所有的DNA糖苷酶都只作用于单个损伤碱基 不过 在T4噬菌体和黄色微球菌中发现了一种对嘧啶二聚体特异性的糖苷酶 DNA糖苷酶的特异性有所差别 但所有的DNA糖苷酶都是沿着DNA双螺旋的小沟进行扫描 发现受损伤的碱基后即与DNA结合 并诱导DNA结构发生扭曲 使损伤碱基被挤出双螺旋 进入酶的活性中心进行切割 43 DNA分子经DNA糖苷酶作用产生无嘌呤或无嘧啶位点 apurinic或apyridimidicsite AP位点 该位点是细胞内专门的AP内切酶 APendonuclease 的有效底物 有两类AP内切酶 a 5 AP内切酶 在AP位点的5 端切割产生3 OH和5 脱氧核糖磷酸 脱氧核糖磷酸随后被DNA脱氧核糖磷酸二酯酶 DNAdeoxyribophosphodiesterase dRPase 切除 b 3 AP内切酶 它们在AP位点的3 端切开磷酸二酯键 产生3 不饱和醛 unsaturatedaldehydes 和5 脱氧核苷酸 3 不饱和醛随后被5 AP内切酶切除 DNA糖苷酶也可分作两类 一类只有N 糖苷酶的活性 另一类除具有N 糖苷酶活性外 还有3 AP裂解内切酶活性 3 APlyaseendonuclease 可作用于无嘌呤或无嘧啶位点 44 在损伤部位形成切口后 可以通过两种途径进行修复合成 a 短修复途径b 长修复途径两种途径的异同点 1 AP内切酶的切口都紧靠AP位点5 端的磷酸二酯键 产生5 脱氧核糖磷酸和3 OH 2 短修补是主要途径 只需合成属于AP 位点的1个正常的核苷酸 长修补时次要途径 是前者的备用途径 要合成1小段寡聚核苷酸 3 短修补用DNApol 长修补用DNApol 或PCNA 45 46 5 3 2 2核苷酸切除修复 核苷酸切除修复 nucleotideexcisionrepair NER 主要用来修复导致DNA结构发生扭曲并影响到DNA复制的损伤 由于NER识别损伤的机制并不是针对损伤本身 而是针对损伤对DNA双螺旋结构造成的扭曲 故许多并不相同的损伤能被相同的机制和几乎同一套修复蛋白修复 47 尽管在真核生物体内参与NER的蛋白质高度保守 但与原核生物的相关蛋白质同源性却很低 不过 原核生物和真核生物NER的基本过程是相似的 主要由5步反应组成 1 由特殊的蛋白质探测损伤 并引发一系列蛋白质与损伤部位的有序结合 2 由特殊的内切酶在损伤部位的两侧切开DNA链 3 去除2个切口之间的带有损伤的DNA片段 形成缺口 4 由DNApol填补缺口 5 由DNA连接酶连接切口 48 全基因组NER和转录偶联性NER 根据识别损伤的机制和修复的范围 可以将NER分为全基因组NER globalgenomeNER GGR 和转录偶联性NER transcription coupledNER TCR 两者的异同点 GGR负责修复整个基因组的DNA损伤 速度慢 效率低 TCR专门修复正在转录的基因模板链上的损伤 速度快 效率高 两类NER的主要差别在于识别损伤的机制上 至于损伤识别后发生的修复反映并无本质上的区别 TCR由RNA聚合酶识别损伤部位 当RNA聚合酶转录到受损伤部位而前进受阻的时候 TCR即被起动 49 1 原核细胞的NER系统 E coli的嘧啶二聚体可以通过GGR系统进行修复 该系统需要的酶和蛋白质如表5 1所示 其基本步骤如图5 11所示 2个UvrA与1个UvrB形成三聚体 此过程需要水解ATP来提供能量 UvrA2 UvrB1复合物与DNA随机结合后受ATP水解驱动 在DNA分子上移动 对DNA的损伤进行监控 一旦发现损伤 则UvrA解离 UvrB与DNA形成稳定的复合物 接着 UvrC与UvrB DNA位点高亲和性结合 诱导UvrB的构象发生变化 使之在损伤部位的3 端 距离损伤点4个核苷酸 产生切口 随后 UvrC催化在DNA损伤部位的5 端 距离损伤点7 8个核苷酸 产生切口 在UvrD解链酶的催化下 释放一个由12nt 13nt组成的寡聚核苷酸片段 由DNApolI填补缺口 连接酶连接切口 50 表5 1原核细胞NER系统蛋白质和酶的功能 51 52 TCR最初是在真核细胞内发现的 后来证明也存在于原核细胞 如果缺乏TCR 则DNA的转录股与非转录股修复的效率应该没有差别 但关于E coli乳糖操纵子DNA损伤修复的研究发现 在诱导物IPTG存在的情况下 其转录股由UV诱发的损伤在5分钟内被全部修复 而非转录股的损伤 或无IPTG诱导的细胞 其损伤约需要40分钟才能被修复 转录股更容易修复 是因为其损伤更容易被识别 在E coli的TCR系统中 一旦RNA聚合酶进入损伤部位 其转录就暂停 并形成一个稳定的复合物 Mfd基因的产物转录修复偶联因子 transcriptionrepaircoupledfactor TRCF 识别这种暂停的复合物 取代RNA聚合酶 同时将UvrA2 UvrB1复合物招募到损伤部位 并促进UvrA与UvrB解离 从而加快UvrB DNA预剪切复合物的形成 随后损伤被切除 以及填补缺口和连接切口的反应与GGR完全相同 图5 12 53 54 2 真核细胞的NER系统 2 真核细胞的NER系统真核细胞的NER系统大概需要30多种蛋白质参与 但是 修复的基本原理和过程与原核细胞非常相似 与原核细胞的NER模型相似 真核细胞的NER涉及多个步骤 虽然各种蛋白质结合的次序还存有一定的争议 哺乳动物GGR系统的基本步骤是比较明确的 55 XPC和HR23B形成二聚体 识别并结合到DNA的伤部位 使双螺旋的扭曲加剧 TFIIH RPA和XPA与双螺旋严重扭曲的损伤部位结合 形成约20bp 30bp的单链区域 RPA作为SSB与已解开的单链区域结合 XPG和XPF ERCCl作为对DNA结构特异性的内切酶 被招募到已解链的损伤部位 XPB XPD的解链酶活性协助2个切点之间包含损伤部位的寡聚核苷酸 平均长度为27nt 脱离复合物 DNApo1 或 与PCNA一起进行修补合成 填补缺口 最后 连接酶连接切口 哺乳动物TCR系统识别损伤的机制与GGR系统不同 首先 RNA聚合酶II延伸复合物暂停在损伤部位 并导致一小部分区域发生解链 随后 CSA和CSB被招募到RNA聚合酶上 进而协助招募TFIIH XPA RPA和XPG到损伤部位 RNA聚合酶 RNA转录物 CSA和CSB则解离下来 于是形成了与GGR一样的复合物 后续的步骤与GGR系统完全相同 图5 13 56 57 5 3 3错配修复 错配修复 MMR 系统主要用来纠正DNA双螺旋上错配的碱基对 此外 还能修复一些因复制打滑而产生的小于4nt的核苷酸插入或缺失 此途径的缺陷可产生所谓的突变子表型 表现为细胞的自发突变率和微卫星不稳定性增高 MMR的过程与其他切除修复途径相似 但与其他修复系统不同的是MMR系统需要区分母链和子链 做到只切除子链上错误的核苷酸 而不会切除母链中本来就正确的核苷酸 58 E coli的MMR长修补途径需要多种蛋白质 MutS负责识别错配的碱基对 识别效率取决于错配碱基对的类型和所处的环境 此外 长修补途径还需要特殊的核酸外切酶 DNApol 和DNA连接酶 其MMR作用的主要步骤如下 1 MutS识别并结合错配的碱基对 或因碱基插入或缺失在DNA上形成的小环 MutL随后结合 2 MutH与GATC位点结合 在错配碱基对两侧的DNA通过MutS做相向移动 形成双链突环 3 MutHa的核酸内切酶活性被MutS MutL激活 切割非甲基化子链的GATC的5 端 59 4 UvrD作为解链酶 催化呗切开的含有错配碱基的子链与母链分离 5 DNApol 和连接酶分别填补缺口和连接切口 错配修复是一个高耗能的过程 E coli还有另外两条不需要MutS MutL和MutH的短修补MMR途径 依赖于MutY的修复途径 用于取代A G和A C错配碱基对中的A 极短修补途径 用于纠正G T错配碱基对中的T 在哺乳动物细胞中 也存在一种类似的短修补MM途径 用来纠正其甲基化的CpG岛上因脱氨基产生的G T错配碱基对上的T 60 5 3 4双链断裂的修复 DNA断裂特别是双链断裂时一种极为严重的损伤 这种损伤难以彻底修复 双链断裂修复主要有两种机制 其一是同源重组 精确性高 其二为非同源末端连接 能在无同源序列的情况下 让断裂的末端重新连接起来 这种方式精确性低 但却是人类修复双链断裂的主要方式 61 NHEJ是DSBR中最简单和最常用的一种方式 其基本步骤如下 1 2个Ku70 K80异源二聚体与2个DNA断裂末端结合 2 DNA PKcs与Artemis蛋白形成合物 被Ku70 K80招募到DNA末端 并使断裂的DNA相互靠近 3 DNA PKcs与DNA末端结合后 其蛋白质既没的活性被激活 使Artemis蛋白磷酸化 4 Artemis蛋白被磷酸化后 其核酸酶活性被激活 可水解末端突出的单链区域 创造出连接酶的有效底物 5 XRCC4和连接酶 共同催化已加工好的DNA末端之间的连接 62 5 4损伤跨越 63 损伤跨越 damagebypass DNA复制过程中发生的损伤 无法修复时 在暂时保留损伤的情况下 继续复制 复制结束后再进行修复 由于这一机制是事先合成错误率较高的DNA 再对其进行修复 故也可被称作易错修复 特点 保留损伤 先复制 再修复 64 5 4 1重组跨越 重组跨越 recombinationalbypass 又称为重组修复 recombinationrepair 其基本机制是通过对DNA模板的交换 跨越模板链上的损伤部位 在新合成的链上恢复正常的核苷酸序列 重组跨越虽然没有消除模板链上损伤 但也没有在复制过程中扩大损伤 模板链上的损伤可以在复制完成后 用其它途径进行修复 65 E coli重组跨越的两种机制 第一种 在新链合成遇到损伤部位时 通过蛋白质RecA RecF RecO和RecR的作用 使复制叉后退 两条新合成的链回折 形成互补双链 接着 因模板链上的损伤而中断合成的新链 以另一条新链为模板 在DNApolI的催化下进行链的延伸 随后 复制叉向前移动 跨越损伤部位 进行正常的复制 如图5 17 66 第二种 一旦复制叉到达损伤位点如嘧啶二聚体 或模板链断裂 DNApol即停止移动并与模板链解离 另一条模板链在RecA RecF RecO和RecR的作用下断裂 并与受损伤的模板链形成互补双链 在跨越损伤部位后继续合成新链 然后在RuvA RuvB和RuvC的作用下 链的交叉部位迁移 在断裂的模板链上留下的一段缺口 由DNApolI和连接酶修补 其后 DNA复制可按正常机制完成 这一机制形成链交叉 以及交叉点的迁移 是十分复杂的过程 如图5 17 67 5 4 2合成跨越 合成跨越 bypasssynthesis 在模板链遇到损伤部位 负责复制的DNApol 原核细胞是DNApol 真核细胞是聚核酶 或 停滞