乳铁蛋白的分离工艺研究

乳铁蛋白的分离工艺研究乳铁蛋白的分离工艺研究 牛初乳是指奶牛产犊后 3d 内所分泌的乳汁 科学研究证实 牛初乳是自然界因子最 为富集的生物资源之一 包括重要的免疫因子和生长因子 如免疫球蛋白 IgG 乳铁蛋 白 LF 及胰岛素生长因子 IGF 等 含量比常乳高 10 100 倍 这些生理活性成分具 有免疫调节 延缓衰老 促进生长发育 抑制肿瘤等生物功能 不仅可以制造功能保健食 品 而且还具有开发天然活性生物药物的巨大潜力 乳铁蛋白又称 乳转铁蛋白 是一种糖蛋白 属于转铁蛋白家族 LF 的一级结构是一 条多肽链 分子量为 70 80kD LF 上结合有两条糖链 含量为 7 左右 其组成包括有 半乳糖 甘露糖 N 乙酰半乳糖胺 藻糖等 LF 具有多种生物活性 如促进铁的吸收 抑菌抗病毒 促进细胞增殖 调节骨髓细胞生成 调节补体系统 刺激溶菌酶再生 防止 脂质过氧化等 在牛初乳中 乳铁蛋白的含量为 1 00mg ml 比常乳高近 50 倍 我国约有乳牛近 430 万头 其中成年母牛 260 万头 以每头乳牛年产初乳 50kg 计算 每年可产近 130t 乳铁蛋 白 因此生产乳铁蛋白的原料极为丰富 它的开发利用将带来可观的经济效益和社会效益 但牛初乳具有异味及粘稠度大 难于加工处理的特点 除喂养牛犊之外 利用率非常低 初乳本身所具备的潜在价值得不到充分的反映 因此 高效综合利用牛初乳资源 开发出 合理的分离技术路线以提取高纯度 高活性的天然活性蛋白质 特别是开发生物药原料有 十分重要的现实意义 本实验室通过离子交换色谱技术 成功地从初乳中分离出了高纯度 的乳铁蛋白 并对此分离过程做了适当的优化 达到了低成本分离高纯度乳铁蛋白的目的 1 原料与器材原料与器材 1 1 原料与试剂 牛初乳 乳牛产犊 3 内收集的样品 CM Sephadex C 50 进口分装 BMK Shanghai Sci Tech Ltd CM SEPHAROSE FAST FLOW LF 标准样品 电泳级丙 稀酰胺 Acr 电泳级甲叉双丙稀酰胺 Bis 分析纯 Tris 碱 三羟甲基氨基甲烷 化学纯 SDS 十二烷基磺酸钠 分析纯 TEMED 四甲基乙二胺 过硫酸胺 Ap 分析纯甘氨酸 考马斯亮蓝 R 250 等 1 2 实验仪器 SBS 100 数控计滴自动部分收集器 HD 21 88 核酸蛋白检测仪 3057 PORTABLE RECORDER BT01 100 兰格恒流泵 TH 500 梯度混合器 PHS 25 型 pH 计 DYY 8B 型 稳压稳流电泳仪 DY 28A 型电泳槽 751G 分光光度计 TDL 5000B 冷冻离心机 2 实验方法实验方法 2 1 分离方法 2 1 1 凝胶的预处理 取液体胶与去离子水 1 1 混合 浸泡 沉降装柱 以 2BV 的流速先用碱洗 2 5h 5 倍 胶体积 用去离子水洗至 pH 值为 7 0 左右 用酸洗 2 5h 用水洗至 pH 值为 7 0 左右 再用碱洗 2 5h 后用水洗至 pH 值 7 0 左右备用 2 1 2 牛初乳的脱脂 取新鲜牛初乳在冷冻离心机中离心 30min 4 800r min 1 5 去上层油脂 2 1 3 阶跃洗脱的方法 在 4 条件下动态上柱吸附 8h 去离子水以 1BV 的流速洗柱约 10h 待基线走平 用 1 6 NaCl 洗脱约需 5h 期间杂蛋白被洗脱下来 待基线再度走平 使用 5 0 NaCl 洗脱 洗脱产物为 LF 粉红色 出峰时间为 1h 左右 洗脱曲线见图 1 2 1 4 CM SEPHAROSE FAST FLOW 的穿透曲线 图 2 在实验中利用纯度为 97 标准样品配制浓度为 4 80g l 的 LF 溶液 在约 5BV 流速下测 定胶体积为 62ml 的 CM SEPHAROSE FAST FLOW 的穿透曲线 根据洗脱记录可计算得到 在穿透点到达前 CM SEPHAROSE FAST FLOW 的实际吸附容量为 2g 左右 2 1 5 透析 取洗脱液于透析袋 放在蒸馏水中 24h 中间每 8h 换一次水 除去洗脱液中的盐类小 分子 2 1 6 干燥 冷冻干燥法 此法对乳铁蛋白的生物活性损失小 2 2 分析方法 2 2 1 蛋白质测定 用核酸蛋白检测仪测定蛋白质 2 2 2 乳铁蛋白纯度的分析 用 HPLC 法和凝胶电泳法进行纯度分析 3 结果与分析结果与分析 3 1 交换剂的选择 根据乳铁蛋白的特性 本实验选用弱酸性阳离子交换剂 并选用 Na 型交换剂作为贮存 吸附时的离子型 比较了 CM SEPHADEX C 50 和 CM SEPHAROSE FAST FLOW 2 种树脂的 分离效果 从表 1 可以看出 相同单位量的牛初乳原料进行实验 CM SEPHADEX C 50 和 CM SEPHAROSE FAST FLOW 相比 洗脱得到的 LF 的量和纯度都相差不大 只是 CM SEPHADEX C 50 得到的洗脱液呈较深粉红色 而用 CM SEPHAROSE FAST FLOW 洗脱得到 的洗脱液颜色略浅一些 使用相同的装柱方法时 CM SEPHAROSE FAST FLOW 比 CM SEPHADEX C 50 更容易 操作 且在实验过程中体积不会发生变化 有利于实现工业化生产 同时由于装柱过程对 洗脱效果也有相当程度的影响 故后继实验选用 CM SEPHAROSE FAST FLOW 为交换剂 3 2 吸附方法的选择 见图 3 离子交换色谱的吸附方法主要分为静态吸附与动态吸附 2 类 静态吸附需要的时间比较 少 但是无法实现连续操作 只能停留在实验室小规模提取阶段 缺乏工业化生产的可能 性 而动态吸附比较容易实现产业化 需要的时间一般随原料的量而变化 2 种吸附方法在后期的 pH 值基本保持稳定 说明牛初乳具有良好的缓冲功能 由于静态吸 附后的吸附剂难于装柱 故选用动态吸附法 3 3 吸附速度的选择 由于在工业化生产中为了提高生产效率 必然在不影响产品得率的前提下降低生产周期 而牛初乳的上柱吸附时间在整个生产环节中占了很大的一个比例 尽可能的提高牛初乳的 吸附速度成为工业化生产的必然选择 由于吸附速度受牛初乳的理化性质及离子交换柱的 径高比等因素的影响 本实验只在现有条件下比较了 3 种不同吸附速度的效果比较 从表 2 我们可以看出 3BV 和 5BV 两个吸附速度的产品得率相差不大 7BV 的收率偏低 估 计已超过穿透速率 故选用 5BV 的吸附速度 3 4 洗脱方法的选择 洗脱方法中 最常用的是阶跃洗脱与梯度洗脱法 2 组梯度洗脱实验 分别使用 5 NaCl 以及 10 NaCl 的浓缩液 稀释液均为去离子水 表 3 中可以看出 阶跃洗脱的效果要好于梯度洗脱 从洗脱曲线上 见图 4 图 5 可 以看出 梯度洗脱的梯度没有掌握好 峰都重叠在了一起 没有达到要求的分离度 可能 是梯度太小 从而流动相的浓度增大 速度太小 峰型过宽 影响了最终的分离度 从洗 脱曲线上也可看出 随着梯度洗脱的梯度的增大 峰型变得窄一些和陡一些 洗脱效果也 有所提高 3 5 产品的透析和冻干 见图 6 图 7 洗脱液经透析 24h 后冷冻干燥 得 LF 固态产品 4 结论结论 本文主要对牛初乳中乳铁蛋白 LF 分离纯化的工艺进行了研究 并对其工艺流程实现了 优化 得到最佳洗脱工艺 使用 CM SAPHAROSE FAST FLOW 装柱 再转化为 Na 型 然 后用脱脂牛初乳作为原料 用 200 目滤布过滤后 在 4 下以 5BV 动态吸附上柱 吸附