KLF4：动脉粥样硬化斑块稳定性的关键

独家权威解读 KLF4 动脉粥样硬化斑块稳定性的关键 随着社会的进步 人们的生活条件变得越来越好 心血管疾病也开始肆意盛行起来 据相关报道指出 心血管疾病中 冠状动脉疾病 CAD 最为流行 而且是发达国家死亡 的最大原因 根据 DATASUS 统计 巴西每年大约有 100 万的医院葬礼起因于心血管疾病 因此 如何治疗动脉粥样硬化早已成为医学研究热点的重中之重 动脉粥样硬化 atherosclerosis 是动脉硬化的血管病中最常见也是最重要的一种 研究表明 各种动脉硬化症都显示出一定的共性 即动脉管壁增厚 变硬 失去弹性和管 腔缩小 导致动脉粥样硬化的因素很多 而且错综复杂 其中重要的两个因子就是胆固醇 和脂蛋白 导致动脉粥样硬化的机理 1 LDL 透过内皮细胞深入内皮细胞间隙 单核细胞迁入内膜 此即最早期 2 Ox LDL 与巨噬细胞的清道夫受体结合而被摄取 形成巨噬源性泡沫细胞 对应病 理变化中的脂纹 3 动脉中膜的血管平滑肌细胞 SMC 迁入内膜 吞噬脂质形成肌源性泡沫细胞 增生 迁移形成纤维帽 对应病理变化中的纤维斑块 4 Ox LDL 使上述两种泡沫细胞坏死崩解 形成糜粥样坏死物 粥样斑块形成 对应 病理变化中的粥样斑块 动脉硬化是进行式 不是到此为止 继发性病变有斑块内出血 斑块破裂及局部血栓 形成 称为粥样硬化 血栓形成 atherosclerosis thrombosis 粥样硬化斑块中脂质及结 缔组织的含量决定斑块的稳定性以及是否易导致急性缺血事件发生 斑块中包含大比例的巨噬细胞相对平滑肌细胞 SMCs 更不稳定 尤其是那些 ACTA2 纤维帽薄弱被认为是组成主要的表型调整型的 SMCs 对于动脉粥样硬化斑块中细胞系的 起源有广泛的歧义 这些歧义主要基于胆固醇处理后 体外培养的 SMCs 下调了 SMC markers 并活化了巨噬细胞 markers 已知的损伤中含有的因子如凝血酶处理后 巨噬 细胞会激活 SMC 的基因 而最令人信服的证据是对交叉性骨髓移植研究 在人类进展性 冠脉损伤中 SMCs 和巨噬细胞通常不能鉴别 这些研究都表明 ACTA2 细胞是造血干细 胞来源而不是 SMC 来源 且与之一致的是 Apoe 完全缺失小鼠 表达 SMC markers 的 细胞实质部分是 HSC 来源而不是 SMC 来源 相反的广泛的证据表明 Apoe 完全缺失小鼠 许多 SMC 衍生细胞缺乏可检测的传统的 SMC marker 和 或激活巨噬细胞 marker 的表达 尽管几十年的动脉粥样硬化的研究 我们仍不知道斑块内的哪种细胞是 SMC 衍生的 并且在何种程度上促进斑块的发病机理 主要的歧义在于鉴定动脉粥样硬化斑块中某种细 胞是 SMC 衍生还是巨噬细胞衍生 而解释该歧义关键需要解决以下几个问题 1 斑块内的 SMCs 巨噬细胞 和其他细胞类型的表型调整是如何调节的 2 这些表型调整细胞的功能是什么 3 这些表型调整如何影响整体的疾病发病机理 为了解决这些问题 我们培育除出了动脉粥样硬化易发的 Apoe 缺失小鼠 用这种方 法 我们可以追踪 SMCs 和研究 SMC 特异敲除干细胞多潜能基因 KLF4 的效果 Kr ppel 样因子 4 Kr ppel like factor4 KLF4 是含有 3 个锌指结构的转录因子 在细胞微 环境中参与不同的细胞信号网络 调控靶基因的转录活化或抑制 与细胞的增殖分化 诱导型 多能干细胞的生成有关 具有癌基因和抑癌基因 促炎和抗炎等双向调节功能 我们选择研究 KLF4 的作用 是因为我们和其他人前期证明了这一转录因子在发育过 程中 颈动脉结扎损伤 体外培养 SMCs 经血小板衍生生长因子 PDGF BB PDGF DD 或者氧化磷脂处理后 调节 SMCs 的表型调整方面起到了重要作用 实验结果显示约 82 的 SMCs YFP DAPI cells 为 ACTA2 阴性 说明斑块中的多 数 SMCs 不能通过传统的 SMCmarkers 来识别 表型调整的 SMCs YFP ACTA2 DAPI 组成了约 30 的斑块内的总细胞 这一结果远超过了以前基 于 ACTA2 免疫染色来估计的调整型 SMCs 的含量 动脉粥样硬化斑块中的 SMCs 表达巨噬细胞 MSCs 和肌成纤维细胞的 marker 根 据我们的结果 推测出斑块内 SMC 衍生细胞的分配比为 30 巨噬样细胞 YFP ACTA2 LGALS3 7 的 MSC 样细胞 YFP ACTA2 SCA1 12 肌成纤维样 细胞 YFP ACTA2 PDGF R 和 32 51 不确定细胞类型 YFP ACTA2 LGALS3 SCA1 另外 进展性动脉粥样硬化斑块中 36 LGALS3 细 胞是 YFP 说明根据以前的研究被分类到巨噬细胞的约 1 3 的细胞 实际上起源于 SMCs 而不是髓系细胞 但是尽管动脉粥样硬化的 SMC 衍生细胞表达了 MSCs 的多种 markers 这些细胞并不表现出多能性 也不表现出 MSCs 的功能属性 动脉粥样硬化中的 SMCs 表达巨噬细胞 marker CD68 原位杂交接近结扎实验 ISH PLA 由本实验室建立 这个技术通过检测 Myh11 启动子的组蛋白 H3K4diMe PLA 确 定组织中表型调整的 SMCs 当 RAW264 7 鼠巨噬细胞或人单核细胞暴露在 POVPC 下时 LDL 的氧化产物 会激活单核细胞 巨噬细胞 抑制 Myh11 启动子的组蛋白 H3K4diMe 人冠状动脉硬化斑块染色 CD68 和 ACTA2 ISH PLA 检测 Myh11 启动 子的组蛋白 H3K4diMe 18 的 CD68 细胞 PLA 表明它们是 SMC 起源的 KLF4 在调节 SMC 表型和斑块发病机理中起关键作用 以前没有证据证明 SMC 表型 调整是 KLF4 依赖的 但是我们观察到动脉粥样硬化模型鼠的头臂动脉中大量 YFP 细胞表 达 KLF4 我们培育了 SMC 特异性 KLF4 敲除的 SMC YFP Apoe 鼠 SMC YFP Klf4 Apoe 鼠 发现与对照组 SMC YFP Klf4 Apoe 相比 约 50 斑块范围缩小 增加了斑块的稳定性及纤维帽中 ACTA2 细胞的数量 下调了 LGALS3 细胞的数量 对 SMC 表型调整方面 53 巨噬样 SMCs YFP LGALS3 YFP 的下降 70 MSC 样 SMCs YFP SCA1 YFP 的下降 流式分析也得到一致结果 SMC YFP Klf4 Apoe 鼠表现出纤维帽中 ACTA2 细胞增加 而 SMC 衍生细 胞的增殖下降 YFP SMC 凋亡与对照组相比显著下降 KLF4 调节 SMCs 的表型调整和功能属性 ChIP seq 分析发现西方饮食 Apoe 缺失 小鼠 KLF4 结合Acta2 Tagln Myh11 and Cnn1内生启动子显著增加 ISH PLA 分析 在 Apoe 缺陷小鼠的斑块个体表型调整的 SMCs 中 KLF4 结合 Tagln 启动子 SMC marker 基因表达的共同抑制是 KLF4 直接结合到 SMC marker 基因的启动子上实现的 KLF4 可以作为转录抑制剂或激活剂 依赖于细胞的类型和基因的位置 为了更好的定义介 导 SMC 表型的 KLF4 靶基因的全部内容 我们运用 ChIP seq 分析 SMC YFP Klf4 Apoe versus SMC YFP Klf4 Apoe 小鼠 鉴定了 869 个 KLF4 的靶基因 不仅得出 KLF4 与 SMC smarker 基因的结合 还发现了 KLF4 与调节途 径基因的结合 包括了吞噬作用 凋亡 细胞迁移 和炎症基因家族 这些推测的 KLF4 的靶基因可能有益于 SMC 特异的 KLF4 缺失缩小损害范围和斑块发病机理 同时 文章还检测了整体 KLF4 基因的敲除改变斑块发病机理 发现纯合敲除的小鼠 不能长期存活 主要跟小鼠的体重严重下降及皮肤损害有关 而杂合敲除的小鼠则表现为 斑块内出血下降 凋亡减少和细胞增殖 因此一条 KLF4 等位基因的缺失 由于形成更小 更稳定的斑块对斑块的发展是有益的 我们发现在选择性 KLF4 的缺失时 可以导致损伤范围减小 增加纤维帽的厚度 SMC 衍生的巨噬样细胞 MSC 样细胞含量的大幅度下降 但是增加了纤维帽中 ACTA2 细胞的分数 另外 我们发现培养的 SMCs 胆固醇加载会诱导 KLF4 依赖的巨噬 marker 和 MSC marker 的激活 促炎因子的表达 增加吞噬行为 最后 我们体内 ChIP seq 分析鉴定大于 800 个推测的 KLF4 在 SMCs 中的调节基因 包括许多相关的促炎过程 综 合来讲 这些结果提供了令人信服的证据 SMCs 表型调整在损害发展 斑块组成 稳定 性方面中有关键的作用 因此 瞄准促进 SMC 表型有益的变化的治疗方式可能成为处理 进展性动脉粥样硬化的可行的方法 然而 KLF4 在 SMCs 中的缺失是如何导致全面的损 害范围减小的 以及斑块稳定性方面多种改变是如何发生的仍然是一个关键的问题 最近 Fisher 实验室发现胆固醇加载后 SMCs 表达巨噬细胞 marker 但是芯片数据显示这些 细胞的主要成分与典型的单核细胞 巨噬细胞和树突细胞明显的不同 这些细胞的吞噬能 力降低 而我们也发现 SMC 衍生的 MSC 样细胞功能异