中药化学第六章第一二三四五六七节.ppt

第六章黄酮类化合物 flavonoids 第一节概述 一 定义 1952年以前给黄酮下的定义为 黄酮主要指分子基本母核为2 苯基色原酮的一系列化合物 色原酮 苯骈 吡喃酮 2 苯基色原酮 黄酮 例如 槲皮素 异鼠李素 当时提取的此类化合物多为黄色 多有酮式 O 故称其为 黄酮 由于 吡喃酮环上氧显碱性能与酸成盐 故又称 黄碱素 但至上世纪50年代 发现了许多基本母核非2 苯基色原酮的化合物 例如 二氢黄酮 查儿酮 异黄酮 其结构虽与2 苯基色原酮不同 不符合经典的黄酮定义 但这些化合物与2 苯基色原酮类化合物有许多重要的相似之处 1 都具有C6 C3 C6的基本碳架 2 生源研究表明这样一些结构的化合物与2 苯基色原酮是同原性的 基于上述二点 上世纪50年代后对经典黄酮定义的界定范围进行了修改和重新定义 黄酮类化合物的定义 黄酮类化合物泛指两个芳环 A环与B环 经中央三碳原子 三碳链 相联结而成的一系列化合物 其基本结构为 C6 C3 C6 黄酮类化合物是一类在提取 分离及结构测定等方面研究得很成熟的化合物 自1814年第一个黄酮类化合物白杨素 Chrysin 至1974年共发现1674个黄酮类单体 苷722个 苷元902个 少数合成 至1993年共发现4000个黄酮类单体 在天然有机化合物中为数量较大的一类成分 二 生理活性 黄酮类化合物分布广 生理活性也较广 1 降低血管脆性及异常通透性 及扩冠作用 Vitp样作用 芦丁 橙皮苷 d 儿茶素 香叶木苷等 毛细血管性出血的止血药及治疗高血压 动脉硬化的辅助药 2 抗肝脏毒作用水飞蓟素 异水飞蓟素 及次异水飞蓟素等 治疗急 慢性肝炎 肝硬化及多种中毒性肝损伤等疾病辅助药 3 抗炎作用芦丁 羟基芦丁 二氢槲皮素及橙皮苷 甲基查儿酮 对佐剂引发的大鼠关节炎有明显抑制作用 4 雌性激素样作用染料木素 金雀花异黄素 大豆素等 有人认为其与己烯雌酚结构相似 故活性相似 金雀花异黄素 己烯雌酚 5 抗菌抗病毒作用黄芩苷 木犀草素 山奈酚等有抗菌或抗病毒作用 6 泻下作用营实苷A7 解痉作用异甘草素 大豆素等 有类似罂粟碱样的解除平滑肌痉挛的作用 治疗缓解高血压患者的头痛症状 另外还有止咳平喘等作用 杜鹃素 三 生物合成途径 黄酮类化合物在植物体内的生物合成分别经莽草酸途径和乙酸 丙二酸途径两条途径复合进行 复合途径 第二节黄酮类化合物的结构与分类 一 结构类型 根据黄酮类化合物A环和B环间三碳链的结构状态 氧化程度 是否成环 B环连接的位置等特点 可将主要的天然黄酮类化合物分为14大类 1 黄酮类 flavone 黄芩苷 黄酮 2 苯基色原酮 芹菜素 木犀草素 2 黄酮醇 flavonol 黄酮醇 C3连羟基 山萘酚 槲皮素R H芦丁R rha 16glc 杨梅素 3 二氢黄酮 flavanone 二氢黄酮 C2 C3氢化 甘草素R H甘草苷R glc 橙皮素R H橙皮苷R 芸香糖基 4 二氢黄酮醇 flavanonol 二氢黄酮醇 C2 C3氢化C3连羟基 二氢槲皮素 二氢桑色素 水飞蓟素 保肝 5 异黄酮 isoflavone 异黄酮 B环连C3 6 二氢异黄酮 isoflavanone 鱼藤酮 杀绦虫 毒鱼 二氢异黄酮 C2 C3氢化 7 查耳酮 Chalcone 此类可看成缩的产物 同时在酸碱性条件下可与二氢黄酮相互转化 因二氢黄酮的结构可看作是一个插烯内酯 可在碱性条件下开环 酸性环合 红花苷 异甘草素 8 二氢查耳酮 dihydrochalcone 梨根苷 二氢查耳酮 吡喃酮开环 碳氢化 9 花色素类 anthocyanidin 芍药花苷元R1 OCH3R2 H矢车菊苷元R1 OHR2 H飞燕草苷元R1 R2 OH天竺葵苷元R1 R2 H 花色素类 4 酮基还原 以烊盐存在 10 黄烷 3 4 二醇类 flavan 3 4 diol 无色矢车菊素R1 OHR2 H无色飞燕草素R1 R2 OH无色天竺葵素R1 R2 H 黄烷 3 4 二醇类 C3 C4氢化并连羟基 11 黄烷 3 醇类 flavan 3 ol 花生仁儿茶素 黄烷 3 醇类 儿茶素类 C2 C3氢化且C3连羟基 儿茶素 表儿茶素 12 橙酮类 噢类 aurone 金鱼草素 橙酮类 噢类 C环为含氧五元环 13 双苯吡喃酮类 xanthone 双苯吡喃酮类 苯环与色原酮2 3位骈合 龙胆酮 14 其他类 1 双黄酮类 由二分子黄酮相联而成 由于联结方式不同又可分3种小类 3 8 双芹菜素型 银杏素 解痉 降压 扩冠 8 8 双芹菜素型 柏黄素 双苯醚型 扁柏黄酮 2 高异黄酮 homoisoflavone 3 黄酮木脂素类 flavonolignan 基本结构中有苯丙素的碳架 水飞蓟素 4 生物碱型黄酮 基本结构中有含氮的部分 二 取代基及成苷方式 1 取代基 黄酮常见的取代基团是ph OH OCH3 也有异戊烯基取代 少 等 例 补骨脂甲素 异戊烯基取代 槲皮素 异鼠李素 2 成苷方式 天然黄酮多以苷的形式存在 例如 槲皮素 3 半乳糖苷 芦丁 山奈苷 牡荆素 组成黄酮苷常见的糖有 单糖类 D 葡萄糖 D 半乳糖 D 木糖 L 鼠李糖 L 阿拉伯糖及D 葡萄糖醛酸等 双糖类 槐糖 glc 1 2glc 龙胆二糖 glc 1 6glc 芸香糖 rha 1 6glc 新橙皮糖 rha 1 2glc neohesperidose 刺槐二糖 rha 1 6gal robinobiose 等 三糖类 龙胆三糖 glc 1 6glc 1 2fru gentianose 槐三糖 glc 1 2glc 1 2glc sophorotriose 等 酰化糖类 2 乙酰基葡萄糖 2 acetylglucose 咖啡酰基葡萄糖 caffeoylglucose 等 3 命名 与其它类成分一样 黄酮类化合物的命名既有俗名法 依据来源命名 也有系统命名法 槲皮素 3 O D 半乳糖苷5 7 3 4 四羟基黄酮醇 3 O D半乳糖苷 槲皮素5 7 3 4 四羟基黄酮醇 异甘草素4 2 4 三羟基查耳酮 第三节黄酮类化合物的理化性质 结构特点 大部分黄酮类化合物可形成这种交叉共轭体系 整个分子结构呈 平面型 1 2 具有 吡喃酮环结构 O上的未共用电子对能引起电子转移 双键重排 呈一定的弱碱性 4 酮基没有成腙反应 但有还原性 3 多有ph OH取代及4 酮基 故显酸性及可产生络合等反应 一 性状 一 形态多为结晶 少数为无定形粉末 苷难结晶 二 颜色与荧光1 可见光 具有交叉共轭体系及助色团 ph OH OCH3 的黄酮类化合物 经电子转移双键重排 使共轭链延长 从而显现颜色 黄酮 黄酮醇 灰黄 黄色 交叉共轭体 查耳酮 橙黄 黄色 交叉共轭体 橙酮 异黄酮 亮黄色 微黄 B环接在3位 共轭程度下降 无色 2 3位双键被氢化 交叉共轭体系中断 C7或C4引进 OH OCH3等助色团供电子 则可促进重排使颜色加深 其它位引进影响较小 苷较相应苷元颜色浅 遇碱 氨熏 颜色加深 花色素 pH 7红色 8 5紫色 8 5蓝色 2 荧光 具交叉共轭体系的黄酮类化合物具有荧光 黄酮醇 查耳酮 橙酮 异黄酮 黄酮 花色素苷 亮黄或黄绿 棕 红棕 黄棕 棕或黑 亮黄 紫色或灰黄 暗红 紫红或棕 无色 成苷后一般荧光都变弱 二 旋光性 1 游离黄酮类 非交叉共轭体系结构具有C C2 C3 具旋光性 其交叉共轭体系黄酮类则无旋光 2 苷连糖 有C 有旋光 多左旋 1 游离黄酮类 难溶或不溶于 水 溶于 碱水 ph OH 吡啶MeOHEtOHEtAcOEt2OCHCl3石油醚 多 OCH3 异戊烯基 以上溶解性是总趋势 不同结构类型及取代基的游离黄酮亲脂亲水性有一定差异 三 溶解性 1 非平面型分子水溶性 平面型分子 例 吡喃环氢化后 分子呈近似半椅式结构 分子间排列空隙大 不紧密 有利于水分子进入 故水溶性较黄酮 醇 查耳酮等平面型分子稍大 二氢黄酮 醇 B环因受4 酮基及2 H的空间位阻 产生一定的偏转 破坏平面性 故水溶性较平面型分子也稍大 异黄酮 2 取代基 OH越多 水溶性越大 脂溶性越大 如川陈皮 5 6 7 8 3 4 六甲氧基黄酮 可溶于石油醚 OCH3 异戊烯基越多 3 离子型黄酮水溶性大 花色素可溶于水 2 苷 溶于 相同苷元连不同的糖 其水溶性有一定差异 多糖苷水溶性 单糖苷O 苷水溶性 C 苷水溶性3 O 糖苷水溶性 相应的7 O 糖苷 glc使B环偏移 水溶性增加 大于相应的7 O glc苷 棉花素 3 O 葡萄糖苷 水 热 冷 碱水 MeOH EtOH EtAcO 吡啶 难或不溶于 Et2O CHCl3 苯 石油醚 四 酸碱性 1 酸性 黄酮类化合物多有ph OH取代 显酸性 故ph OH取代的游离黄酮溶于NaOH水液 吡啶 甲酰胺及二甲基甲酰胺等溶剂 不同位置及数目ph OH取代的黄酮 酸性强弱亦不同 规律如下 溶于 7或4 OH在碱性条件下易形成稳定的醌式共振结构 酸性强最强 5 OH与4 酮基易形成氢键 使H 难以解离 故酸性最弱 多利用此性质分离 萃取法 不同ph OH取代的游离黄酮 2 碱性 黄酮类化合物 吡喃酮环上O具有未共用电子对 可吸引H 故显微弱的碱性 可与浓HCl H2SO4形成钅羊盐 但不稳定 加水后即分解 所生成的钅羊盐具有一定的颜色 离子化程度高 黄酮 醇 黄 橙色 荧光 二氢黄酮类 橙 冷 紫红 热 查耳酮类 橙红 洋红 异黄酮 二氢 黄 红 洋红 橙酮 注意 某些带 OCH3的黄酮可与生物碱沉淀剂产生沉淀 五 颜色反应 一 还原反应 黄酮类化合物的4 酮基有还原性 可与许多试剂反应 1 盐酸 镁粉反应 Mg HCl反应 此反应是黄酮类化合物定性反应中常用法 首选法 黄酮醇 二氢黄酮 醇 为阳性黄酮3位无羟基及3 OH成苷的黄酮醇反应不明显 苷可水解后再做 查耳酮 橙酮 儿茶素 花色素为阴性异黄酮多为阴性 若样品液是红色 可观察试管中升起泡沫颜色 红为阳性 做时在另一试管中不加Mg粉作对照 消除橙酮 查耳酮及花色素的干扰 机理 现代多解释为 生成阳碳离子而显色 2 盐酸 锌粉反应 Zn HCl反应 做法及阳性反应的结果同Mg HCl反应 特点 可区别二氢黄酮及黄酮醇和二者的3 O 糖苷 3 钠汞齐还原反应 Na Hg还原反应 黄酮 二氢黄酮 异黄酮 二氢异黄酮 红 黄酮醇 黄 淡红 二氢黄酮醇 棕黄色 4 四氢硼钠反应 NaBH4反应 此反应为二氢黄酮类专属性反应 样品MeOH液0 1ml 1 2mg 此反应仅二氢黄酮类为阳性 其它均为阴性 机理 NaBH4是选择性还原剂 仅还原碳和杂原子间的双键或三键 且只还原到 OH 不还原C C之间的重建 二 金属盐类试剂络合反应 具有3 羟基 4 酮基 5 羟基 4 酮基及邻二ph OH黄酮类化合物可和Al3 Pb2 Zn2 Mg2 Sr2 离子络合 出现颜色的变化或沉淀 可用来鉴定或分离相应结构的黄酮类化合物 1 铝盐反应 3 羟基 4 酮基及5 羟基 4 酮基结构黄酮类化合物均为阳性结果 邻二ph OH结构者也为阳性 但在酸性条件下不稳定 2 Mg Ac 2反应 3 铅盐沉淀反应 样品水 醇 液 此反应可鉴别这二种结构的黄酮 亦可分离这两种结构的黄酮及其苷 4 锆盐 枸橼酸反应 二氯氧锆可与3 OH 4 酮基或5 OH 4 酮基黄酮络合 但稳定性不一样 此反应也可在滤纸上进行 黄绿及黄绿荧光 稳定性 5 氨性氯化锶反应 具有邻二酚羟基黄酮有此反应 6 FeCl3反应 三 硼酸显色反应 样品 用此可将5 羟基黄酮 6 羟基查耳酮类化合物与其他类型的黄酮类化合物相区别 四 其他颜色反应 1 五氯化锑反应为查耳酮的鉴别反应 反应在必须无水环境中进行 黄酮 二氢黄酮及黄酮醇类显黄色至橙色 2 Gibbs反应 此反应不算是黄酮的专一反应 其它酚类其ph OH对位无取代的大多都有此反应 四 碱性试剂反应 例如 黄酮NaOH水液黄 冷 橙 热 查耳酮 橙酮碱液红或紫红 二氢黄酮碱液黄 橙 冷 红 加热 时间长或加热成查耳酮 黄酮醇碱液黄 棕 长时通空气 氧化 C3 OH 邻三羟基黄酮稀NaOH水液暗绿色或蓝绿色纤维状沉淀 一般常在TLC或PC展开后 用氨薰 短时间显色 或喷Na2CO3 永久显色 以使斑点颜色加深或荧光加强 较少用 因粗提物中杂质干扰大 NaOH易破坏结构 第四节提取及分离 一 提取 一 溶剂 1 苷及极性大的苷元 多 OH黄酮醇 黄酮 橙酮 查耳酮等 苷在植物体的花 叶 果中存在较多 MeOH 水 1 1 国外试验室多用 苷及苷元均可提出 与提取其他类成分一样 选择提取黄酮类化合物的溶剂还是依据黄酮类化合物的溶解性及伴存杂质的溶解性进行选择 原则是黄酮类化合物尽可能全部提出 杂质提出越少越好 工厂及试验室都可采用 生产尽量用EtOH 工厂多用 碱水 石灰水 可抑制粘液质及酸多糖的溶出花色素类 提原生苷注意 杀酶 2 苷元 苷元在植物体的木质部存在较多 多用MeOH EtOH 碱水 ph OH Et2O CHCl3 EtOAc 苯 多甲氧基及异戊烯基黄酮 多羟基及具酯键结构黄酮苷及苷元的提取液的浓缩应尽量在中性条件下低温 60 浓缩 二 纯化 1 溶剂萃取法针对伴存杂质的亲脂亲水性多用不同的溶剂系统萃取纯化 1 脂溶性杂质较多 2 水溶性杂质较多 也可用其它溶剂系统萃取 常不但可将黄酮类化合物与杂质分开 也可将苷及苷元分开 有时一种溶剂系统纯化效果不理想 可用二种或多种系统纯化 若水提液中多糖和蛋白质很多 可醇沉去除 若植物体油脂和叶绿素量大 可先脱脂 再提取 例 Acaciaixiophylla叶中黄酮的提取 槲皮素 3 3 二葡萄糖苷 表儿茶素 2 碱溶酸沉法 黄酮苷具有水溶性 但其溶解度在碱水中最大 水次之 酸水最小 因此可利用 稀NaOH液提取率较高 但杂质较多 而且易引起黄酮苷的分解 用的较少 教材中所述 碱提液酸化 二次过滤拿总黄酮苷的方法 实际很难运用 不同产地原料重现性很差 Ca OH 2水液 石灰水 用的较多 Ca OH 2可使多羟基的鞣质及含有羧基的果胶 粘液质等水溶性杂质生成钙盐沉淀 不被溶出 有利于提取液的滤过及纯化 例如芦丁的制备 碱溶酸沉法成本低 设备要求简单 大规模生产多用 3 聚酰胺吸附法 黄酮类化合物具4 酮基并多具ph OH 可被聚酰胺吸附 进行纯化 黄酮类化合物的水提液经EtOH沉淀后 也可用此法纯化 也有用活性碳或大孔树脂代替聚酰胺进行纯化 目前国内外大孔吸附树脂用得最多 三 分离 黄酮类化合物的分离主要依据其结构上差异引起 设计分离方法 酸性强弱的差异形成络合物的差分配系数的差异极性的差异分子量的差异 一 萃取法 1 pH梯度萃取法用于分离苷元 主要利用ph OH的不同而引起酸性强弱的差异进行 萃取后 将各部分碱水液HCl酸化 再以Et2O或CHCl3 有机溶剂萃取液适当浓缩 析晶 即可得到分离后的苷元 2 硼酸络合萃取法 用于分离邻二ph OH与非邻二酚结构的苷元 主要利用邻二ph OH苷元可与H3BO3形成络合物不溶于亲脂性有机溶剂而转溶于水的性质分离 二 铅盐沉淀法 适用分离黄酮苷 某些亲水性强的苷元也可用此方法分离 铅盐沉淀法污染较大 现多不用 三 色谱法 色谱法是分离黄酮类化合物最有效的方法 目前常用固定相为硅胶 聚酰胺 和纸色谱 纤维素 其他固定相也有使用 1 聚酰胺聚酰胺结构上的 O及 NH2可与黄酮类化合物中的 O或ph OH形成氢键吸附 因此吸附容量较大 分辨力较高 多作为分离黄酮类化合物首选固定相 1 对黄酮类成分的吸附规律 洗脱吸序规律 对母核结构上 OH取代多的黄酮吸附大于 OH取代少的黄酮 母核一般应相同 例 羟基数目相同 对未形成分子内氢键的黄酮吸附大于形成分子内氢的键黄酮 A 4 酮基 3 OH 5 OH 结构易形成分子内氢键 B 邻二羟基结构易形成分子内氢键对间 对 二羟基结构者吸附 邻二羟基结构者 C 其它基团与羟基形成分子内氢键 对芳香化程度高的黄酮吸附 芳香化程度低的 对不同结构类型黄酮的吸附 黄酮醇 黄酮 二氢黄酮 异黄酮 对苷元相同 糖不同的黄酮苷的吸附 苷元 单糖苷 双糖苷 三糖苷 水 醇系统 如甲醇 水 三糖苷 二糖苷 单糖苷 苷元 纯有机溶剂系统 如CHCl3 MeOH 对此现象 上海药物研究所刘嘉森研究员认为聚酰胺有 双重色谱 性质 氢键吸附和分配色谱 分离不同的黄酮苷时以分配色谱为主 包括苷与苷元的分离 反相分配色谱 含糖多先洗脱 洗脱顺序为 三糖苷 双糖苷 单糖苷 苷元 正相分配色谱 含糖少先洗脱 洗脱顺序为 苷元 单糖苷 双糖苷 三糖苷 移动相的洗脱 展开 强度规律 水 MeOH或EtOH Me2CO NaOH水液 稀 或NH3 H2O 甲酰胺 二甲基甲酰胺 DMF 尿素水液 实验室一般常用 水 醇系统 水 5 10 15 20 25 100 甲醇或乙醇 纯有机溶剂系统 氯仿 甲醇 丁酮 丙酮 苯 石油醚 丁酮 甲醇等调整比例洗脱或展开 最好用聚酰胺细粉 以上规律聚酰胺CC及TLC均适用 2 硅胶硅胶分离黄酮类化合物应用得也相当广 苷元 以苯 氯仿 乙酸乙酯分别混不同比例的甲醇 丙酮 乙醚 丁酮 甲酸等为移动相分离异黄酮 二氢黄酮 二氢黄酮醇及高度甲基化或乙酰化的黄酮及黄酮醇类 苷 多用降活性硅胶 以氯仿 甲醇 水 80 20 1 65 20 2或80 18 2 乙酸乙酯 丙酮 水 25 5 1 BAW等含水系统为移动相分离 3 氧化铝 一般很少用 特别是4 酮基 3 OH结构或5 OH 4 酮基结构的黄酮 可与Al2O络合形成不可逆吸附 不能洗脱分离 邻二酚结构黄酮吸附也非常牢难洗脱 但不具上述结构的黄酮也有用Al2O3分离成功的 其色谱规律同硅胶 4 纸色谱 纤维素色谱 PC是小量制备性分离黄酮类化合物较为有效的方法 一般用30张 46cm 57cm 的滤纸分离后即可得到足够水解和紫外分析的样品 1 展开方式及条件 苷类多用双向展开 第一向醇性系统 BAW 4 1 5 TBA 3 1 1 水饱和n BuOH等 展开前 滤纸用下层水饱和 此向主要利用混合物的分配系数不同进行正相分配色谱分离 移动相醇的亲水性小于固定相 第二向水性系统 多为酸水或电解质 2 6 HOAC HOAC 浓HCl H2O 30 3 10 3 NaCl等 主要以吸附色谱为主进行分离 利用化合物极性不同进行分离 苷元 多用一向醇性系统 或用苯 HOAC H2O 125 72 3 CHCl3 HOAC H2O 13 6 1 酚 水 4 1 或HOAC浓HCl H2O 30 3 3 花色素及苷多用含HCl或HOAC水性系统 2 分子结构与Rf值的关系 苷元水性系统 如3 5 HOAC 平面型苷元 黄酮 黄酮醇 查二酮 亲水性差 共轭程度高 极性强 Rf 0 02 几乎不动 非平面型苷元 二氢黄酮 二氢黄酮醇 二氢查二酮 亲水性较强 共轭程度底 极性弱 Rf0 10 0 30 苷与苷元醇性系统 正相分配 羟基越多 亲水性越强 Rf越小 苷元 单糖苷 双糖苷 三糖苷水性展系统 吸附 分子量越大 吸附越弱 Rf越大 苷元 单糖苷 双糖苷 三糖苷 纤维素色谱CC的色谱分离条件可参考PC的移 固相条件 滤纸的本质是纤维素 但纤维素质地轻 装柱较难 因此用得不多 5 葡聚糖凝胶色谱 葡萄糖凝胶国外用于分离黄酮类化合物 主要是用Sephadex G和SephadexLH 20型 移动相 碱性水溶液 如0 1mol LNH3 H2O 及含盐水溶液 0 5mol LNaCl 等 醇及含水醇 如甲醇 甲醇 水 不同比例 叔丁醇 甲醇 3 1 乙醇等 其它溶剂 如含水丙酮 甲醇 氯仿等 色谱机理苷元 以吸附色谱为主 按极性大小 ph OH等多少 分离 苷 分子筛色谱为主 按分子量的大小分离 大分子先洗脱 例 Ve 洗脱样品时洗脱剂所用的总量 体积 Vo 柱子的空体积Ve Vo 相对洗脱率 Ve Vo值大说明难洗脱 反之 则易洗脱 葡聚糖凝胶价格昂贵 但近年来逐渐广泛使用 部分黄酮类化合物在SephadexLH 20 甲醇 上的Ve Vo 6 HPLC法 与分离其他类化合物一样 HPLC法是分离对各类黄酮化合物最有效的方法 固定相 ODS等反相柱 正相柱少用 移动相 一定比例的甲酸或乙酸的甲醇 水溶剂系统或乙腈 水溶剂系统 三 提取分离实例 山萘酚 槲皮素 杨梅素 伞形花内酯 莨菪亭 金丝桃苷 异金丝桃苷 第五节黄酮类化合物的检识 一 理化检识 对黄酮类化合物进行理化鉴别 主要是初步了解被鉴别的黄酮类化合物的基本结构骨架类型 以及专属反应性强的取代基团结构状态 1 物理检识 2 化学检识 主要利用专属反应性强的显色剂进行对基本母核及取代基的初步鉴别 如 盐酸 镁粉反应 Mg HCl反应 黄酮醇 二氢黄酮 醇 盐酸 锌粉反应 Zn HCl反应 二氢黄酮及黄酮醇和二者的3 O 糖四氢硼钠反应 NaBH4反应 二氢黄酮类五氯化锑反应 查耳酮锆盐 枸橼酸反应 3 OH 4 酮基或5 OH 4 酮基黄酮氨性氯化锶反应 邻二酚羟基黄酮Gibb s反应 酚羟基对位有无取代 多参考文献值 对比观察晶形及颜色 可见及荧光 进行初步判断 如二氢黄酮在可见光下不显黄色等 二 色谱检识 色谱法检识除具与对照品或 参照物 进行可见光 荧光及显色剂显色斑点颜色及Rf检识外 还具色谱分离排除杂质干扰的性质 其检识的专属性和可靠性高于化学检识 常用的色谱检识条件有 1 聚酰胺TLC 现多用聚酰胺薄膜进行黄酮苷元及苷的检识 其 国产的聚酰胺薄膜浙江黄岩 分离效果优于硅胶TLC及PC 其色谱规律与柱色谱相同 黄酮苷 多用醇 水系统甲醇 乙酸 水 90 5 5 甲醇 水 1 1 丙酮 水 1 1 异丙醇 水 3 2 水 乙醇 丁酮 乙酰丙酮 65 15 15 5 水 正丁醇 丙酮 乙酸 16 2 2 1 等 展开剂 游离黄酮 多用纯有机溶剂系统氯仿 甲醇 94 6 96 4 氯仿 甲醇 丁酮 12 2 1 苯 甲醇 丁酮 90 6 4 84 8 8 60 20 20 等 2 硅胶TLC 检识游离黄酮多于黄酮苷 展开剂 游离黄酮 甲苯 甲酸甲酯 甲酸 5 4 1 甲苯与甲酸的比例可调整 适合分离二氢黄酮 苯 甲醇 乙酸 35 5 5 氯仿 甲醇 8 5 1 5 7 0 5 苯 甲醇 95 5 黄酮苷 黄酮O 苷 黄酮C 苷和黄酮醇O 苷类 正丁醇 乙酸 水 3 1 1 二氢黄酮O 苷类 氯仿 乙酸 100 4 甲酸 乙酸乙酯 水 9 1 1 氯仿 乙酸乙酯 丙酮 5 1 4 氯仿 甲醇 水 65 45 12 等 苯 乙酸 100 4 氯仿 乙酸 甲醇 90 5 5 等 3 PC 黄酮苷及苷元均适用 其色谱规律及展开剂同第四节 4 检视及显色展开分离完毕的TLC或PC一般按可见光荧光显色剂显色的顺序进行色斑检视 第三节所述显色剂均可选用 注意供试品斑点与对照品斑点经3种展开剂展开后 在Rf值 可见光 荧光及显色剂显色上完全一致 只能下色谱行为一致的结论 不可下是同一化合物的结论 第六节黄酮类化合物的结构研究 与其它类成分的结构研究一样 黄酮类化合物的结构测定研究也是在文献分析对照的基础上 经过 上述测定手段中 波谱测定对确定结构最为重要 黄酮类化合物的结构类型较为固定 发现的化合物数量较多 波谱测定的数据较多 因此在中药各类成分中 黄酮类化合物结构的波谱测定研究 是最为系统规律性的一类 一 UV 与其他类化合物不同 黄酮类化合物UV 可见光 谱测定对黄酮类化合物的结构确定有很重要的意义 一 黄酮类化合物在甲醇溶液中的UV光谱特征1 黄酮及黄酮醇 1 带 及带 吸收峰黄酮及黄酮醇甲醇溶液在200 400nm区间出现2个主要的吸收峰 吸收带 称带 或峰 及带 或峰 带 位于300 400nm区间 由桂皮酰系统电子跃进引起 带 位于240 285nm区间出第二个峰 由苯甲酰引起 R OH或H 例芦丁的UV光谱 MeOH R OH 358 385nm R H 304 350nm 区别黄酮及黄酮醇 2 取代基对带 及带 的影响 B环及A环上引入含氧取基团 促进电子重排 引起相应吸收带红移 带 整个母核含氧取代 OH OCH3 越多越红移 如 羟基甲基化或苷化的影响 3 OH带 328 357nm 紫移 与黄酮的带 波长范围重叠 峰形也相似 5 OH带 和带 紫移5 15nm 4 OH带 紫移3 10nm 带 A环含氧取代越多越红移 如 B环含氧取代对带 位移无影响 仅影响其峰形 如 4 氧取代带 单峰3 4 二氧取代带 将为双峰 或1主1肩峰 酚羟基乙酰化后 原酚羟基对UV光谱的影响消除 如 槲皮素五乙酰化物的UV光谱与无羟基取代的黄酮几乎相同 母核羟基乙酰化的影响 2 查耳酮及橙酮类 此二类的UV光谱的共同特征是带 吸收强 为主峰 带 的吸收弱 为次强峰 与其它类黄酮化合物区别 查耳酮 带 弱 220 270nm OH OCH3取代红移 2 OH红移最大 2 OH取甲基或苷化紫移15 12nm 橙酮可见3 4个峰 带 370 430nm或388 413nm 天然 羟基甲基化或苷化影响不大 但6 7 二羟基取代中的7 OH甲基化或苷化 带 紫移18nm 3 异黄酮 二氢黄酮 二氢黄酮醇 这三种成分均系非交叉共轭 具苯甲酰 A环 而无桂皮酰存在 故带 很弱 在带 强 后显一肩峰 异黄酮 带 主峰 245 270nm 二氢黄酮 醇 带 主峰 270 295nmA环引入 OH 主峰红移 二 诊断试剂在黄酮类化合物UV结构研究中的应用 1 诊断试剂在黄酮或黄酮醇甲醇液中分别加入NaOMe NaOAc NaOAC H3BO3 AlCl3 AlCl3 HCl试剂 使其酚羟基解离或形成络合物 NaOMe 碱性 解离母核上的ph OH NaOAc 弱碱性 仅解离酸性强的ph OH 如黄酮的7 OH NaOAC H3BO3 与邻二酚络合 AlCl3 HCl 与3 OH和4 酮基 5 OH和4 酮基 邻二酚羟基络合 络合规律为 A 络合物的稳定性3 OH 黄酮醇 5 OH 黄酮 5 OH 二氢黄酮 邻二酚 OH 3 OH 二氢黄酮 B 可同时生成二络合物C 邻二ph OH及3 OH 二氢黄酮 形成的络合物不稳定 遇酸分解 加入以上试剂后带 及带 产生相应的规律性的红移 根据红移的规律 可判定黄酮类化合物结构上 OH取代的位置 而这些试剂称此为 诊断试剂 或 位移试剂 例芦丁的UV 紫外光谱数据 maxnm MeOH259 266sh 299sh 359NaOMe272 327 410AlCl3275 303sh 433AlCl3 HCl271 300 364sh 402NaOAc271 325 393NaOAc H3BO3262 298 387 芦丁 2 黄酮及黄酮醇位移规律 3 查耳酮及橙酮位移规律 4 异黄酮 二氢黄酮及二氢黄酮醇位移规律 例 从某中药提得1黄色结晶 熔点258 C21H20O11 钠汞齐还原反应 红色 FeCl3反应 蓝黑 氨性氯化锶反应 黑色沉淀锆盐 枸橼酸反应 黄 退色Gibb s反应 阳性Molish反应 阳性酸水解产物可析出一分子 D glu UV maxnm MeOH 255 267sh 348 4 OH NaOAc 259 266sh 365sh 4054nm 5nm 无7 OH或苷化 NaOAc H3BO3 259 37224nm 邻二ph OH AlCl3 274 329 43284nm 5 OH AlCl3 HCl 273 294sh 358 38739nm B环邻二ph OH 3 HCl水解后再测 MeOH 242sh 253 349 NaOAc 269 326sh 38416nm 7 OH 综合上述分析 结晶的结构式初步定为 木樨草素 7 O D 葡萄糖苷 NaOMe 263 300sh 394 不降 46nm 位移值 二 1H NMR 1964年以前1H NMR仅运用于测定异黄酮和一些高度甲基化 乙基化或乙酰化的黄酮 CDCl3 CCl4 而其它类的黄酮在CDCl3或CCl4中均不易溶 1964年Beteacham和Highet发现黄酮类化合物用DMSO d6可以溶解 从而解决了黄酮类化合物的测定溶剂 扩大了测定范围 并提高了各质子的分辨率 但有以下缺点 1 沸点太高 189 难回收样品 2 可能引起某些样品的分解 3 难以避免因吸水而引起的水峰 3 5宽峰 随后将黄酮类化合物做成三甲基硅醚衍生物 以CCl4溶后测定并有以下优点 1 溶解性好 可任意混溶 2 无干扰信号 CH3 3SiO 均在0 5以下 不用价格昂贵的氘化溶剂 3 对比5 OH甲醚化或不甲醚化的图谱 可提供C6 C3 及C8取代的参数 4 三甲基硅醚衍生物可直接乙醚化或甲基化进而再作相应的测定 Mabry分析了大量的黄酮类化合物三甲基硅醚衍生物1H NMR数据后 总结出如下黄酮类化合物三甲基硅醚衍生物的1H NMR规律 若用DMSO d6作溶剂测定黄酮类化合物 其测得的数据与三甲基硅醚衍生物的规律可能有少许出入 但各信号的峰数及相对位置基本一致 一 A环质子 1 5 7 二OH黄酮类化合物 7 OH成苷则H 6 H 8移向低场 2 7 OH黄酮类化合物 H 5受H 6邻偶 d峰 J Ca 9 0Hz 8 0 4 羰基去屏 H 8受H 6间偶 d峰 J Ca 2 5Hz 5 70 6 90 位置可颠倒 二 B环质子 1 4 氧取代 由于B环的旋转 使 H 2 H 6 位移值与C环的氧化水平有关 4 氧取代黄酮类化合物中H 2 H 6 和H 3 H 5 的化学位移 H 2 H 6 位移随C环的氧化程度升高而移向低场 2 3 4 二氧取代 1 3 4 二氧取代黄酮和黄酮醇 H 2 与H 6 间偶d峰 J Ca 2 5Hz 7 20 C环去屏 H 6 与H 2 有时重叠 难以区分 若与H 2 6 的峰位未重叠 可利用两者的位移顺序来区别黄酮或黄酮醇是3 OH 4 OCH3或是3 OCH3 4 OH取代 以上可见 2 3 4 二氧取代异黄酮 二氢黄酮及二氢黄酮醇 此3种类型取代黄酮交叉共轭体系的共轭程度下降或消失 C环对H 2 H 5 及H 6 的去屏影响极小 难以利用 值将H 5 与H 2 H 6 区分开 H 2 H 5 及H 6 为一复杂多重峰 常常组成两组峰 出现在 6 70 7 10区域 各质子化学位移主要取决于它们处于含氧取代基的邻位或对位 3 3 4 5 三氧取代黄酮类化合物 此种类型取代黄酮的出峰信号简单 由于B环旋转 若R相同 则H 2 和H 6 S峰 2H 6 50 7 50若3 或5 OR的R为CH3或糖则H 2 与H 6 间偶裂分为2个d峰 J Ca 2 0Hz 三 C环质子 1 黄酮类 H 3尖锐S峰 6 30 若与5 6 7或5 2 8三氧取代的H 6或H 8孤立芳氢相混难以区别 可用下法区别 将硅醚化产物在空气中曝露10分钟 5 OH硅醚即水解 无水CCl4溶解测定 H 3峰低场移动0 25以上 H 8峰高场移动0 25以上 H 6峰不动 2 异黄酮类 H 2S峰 7 60 7 80 1 氧 4 羰基及B环去屏作用 DMSO d6测定 低场位移 8 50 8 70 3 二氢黄酮类 H 2 H 3组成ABX偶合系统 ABX系统最多可出12 2 峰 AB部分8 X部分6 各为q峰 多相互重叠 4 二氢黄酮醇类 以上偶合常数说明H 2与H 3为反式偶合 那么C 2 C 3的构型证明是2R 3R 若3 OH成苷 则H 2 H 3都移向低场 糖吸电作用所致 见下表 5 查耳酮类 H 与H 反式偶合 稀氢Jcis 6 14Hz Jtrans 11 18Hz H d峰J Ca 17Hz 6 70 7 40H d峰J Ca 17Hz 7 30 7 70 说明H H 为反式构型 6 橙酮类 苄基质子S峰 6 50 6 70DMSO d6测定S峰 6 37 6 94 确切的峰位随A环和B环上羟基取代而定 羟基取代增多 高场位移 其中以H 4 0 19 及H 6 0 16 影响最明显 四 糖基上的质子 1 单糖苷类 一般糖上质子在 3 2 3 8出峰 但C1 上的H 1 位于较低场 d峰 其峰位可供我们判定成苷的位置及糖的种类 见表 3 O 葡萄糖苷易与7或4 或5 O 葡萄糖苷相区别3 O 葡萄糖苷易与3 O 鼠李糖相区别但二氢黄酮醇的3 O 葡萄糖苷与3 O 鼠李糖难以区别 2 双糖苷类 末端糖上的H 1 由于离苷元较远 因此出峰较H 1 位移高场 其位移随联糖的位置不同而异 可供判断两个糖联结的方式 如双糖苷中的鼠李糖的 CH3以d峰 J 6 5Hz 或重峰在 0 8 1 20出峰 低于一般糖上质子 3 2 3 8的范围 可作为鉴别特征 例 芦丁糖基 D 葡萄糖 6 1 L 鼠李糖 新橙皮糖基 D 葡萄糖 2 1 L 鼠李糖 五 其他质子 1 甲氧基质子 多在 3 50 4 10出S峰 3H 其在黄酮结构母核上的位置可用 苯 诱导位移 技术确定 NOE技术及2D NMR也可定甲氧基位置 2 乙酰氧基上的质子 具羟基的黄酮类化合物有时做成乙酰化产物 利用乙酰氧基上 CH3 3H S 易于辨认的特点 根据其峰数和氢面积可推测其苷元和糖上羟基的数目 糖乙酰氧基 脂肪族乙酰氧基 S峰3H 1 65 2 10苷元乙酰氧基 芳香族乙酰氧基 S峰3H 2 30 2 50也可根据乙酰氧基的信号位置推测苷元酚羟基所在位置 3 酚羟基质子 可用DMSO d6 无水 为溶剂测定黄酮类化合物酚羟基质子 不必做成三甲基硅醚衍生物 例如 在木犀草素 7 0 D 葡萄糖苷的1H NMR谱 4 C6 和C8 CH3质子 C6 CH3比C8 CH3小 0 2 如异黄酮 C6 CH3 2 04 2 27C8 CH3 2 14 2 45 三 MS 游离黄酮类 芳香化程度高 热稳定性较强 多用EI MS测定 黄酮苷 热稳定性较差 难气化 现多用FD MS FAB MS及ESI MS等软电离方式测定 一 游离黄酮类化合物 EI MS 可用EI MS测 特点为 M 很强 多为基峰 常出现 M H M CH3 多甲氧基 及 M CO 等碎片离子峰 对解析结构最有价值的峰为基本裂解 基本裂解方式 的碎片离子峰 基本裂解方式 RetroDiels AlderreactionRDA反应 基本裂解方式 裂解特点 1 游离黄酮类化合物的质谱中这两种裂解都可发生 但发生强度互为反比 A1 B1及B2碎片峰及其子离子峰 A1 CO A1 CH3 及 B2 CO 均可出现 仅是其丰度成反比 2 A1和B1碎片峰的质荷比之和等于 m 的质荷比 因此找到A1 B1或B2碎片峰 并与 m 对照 即可了解A及B环的取代状况 3 查耳酮由酮基两侧断裂 无RDA裂解 1 黄酮类 1 M 很强 基峰 M CO M H A1 B1 及 A1 CO 等碎片峰较强 如 2 具鉴别价值的非RDA裂解离子峰 侧链碎片离子峰 3 6 及8 位异戊烯基的取代的黄酮类多产生此碎片 如 M m z414 m z357 M CH3 及 M CH3 CO 碎片离子峰 6 及8 位含有甲氧基的黄酮 可出现一个强的 M CH3 离子峰 然后失去CO 产生 M 43 碎片离子 例如 2 黄酮醇类 M 多为基峰 裂解方式 是主要裂解方式 产生B2 及 B2 CO 碎片离子峰 也有 A1 H 碎片离子 强度弱 图谱中A1 及B1 峰不明显 则主要检查B2 离子 如 B2 离子 m z 105 未甲基化前 B环无羟基取代 135 未甲基化前 B环有1个羟基 165 未甲基化前 B环有2个羟基 195 未甲基化前 B环有3个羟基 2 除有B2 B2 CO 及 A1 H 外 还有 M 1 M H M 15 M CH3 M 43 M CH3 CO 等碎片峰 3 2 羟基或2 甲氧基黄酮醇裂解方式独特 其裂解方式较为独特 容易失去2 羟基或甲氧基形成新的稳定的五元杂环 其它类2 羟基黄酮也都有这种特有的裂解方式 二 黄酮苷 1 EI MS测定黄酮苷与测定苷元的区别是不但要了解苷元部分的结构信息 还要了解糖部分的结构信息 数量 种类及位置等 然而黄酮苷由于难以气化及对热不稳定 黄酮苷直接用EI MS测定 不出分子离子峰及糖的碎片峰 难以提供黄酮苷的分子量及糖的结构信息 chrysoeriol 7 o D glocopyranosidede 例如chrysoeriol 7 o D glocopyranosidede的EI MS 其EI MS与苷元一样 没有出现分子离子峰及糖的碎片峰 鉴于此种原因 上世纪70年代多将黄酮苷做成三甲基硅烷化 乙基化 全甲基化 PM 及全氘代甲基化 PDM 衍生物后 PM及PDM多用 再测定其EI MS PM及PDM黄酮苷 O 苷 的EI MS的结构信息如下 1 基峰为苷元 分子离子峰很弱 低于1 且其强度规律为7 O 糖苷 4 O 糖苷 3 及5 O 糖苷 2 经分子离子峰 较弱 了解苷的分子量 3 对比苷元的碎片 基峰 了解糖的连接位置 A或B环 4 己糖基 去氧己糖基 戊糖基及双糖基等糖的种类 碎片离子的质量单位数 2 FD MS FAB MS和ESI MS 黄酮苷做成全PM或PDM衍生物虽然可以进行EI MS测定 但制备PM或PDM衍生物还是较麻烦 耗费样品 分子离子峰很弱 现多将黄酮苷直接进行FD MS FAB MS 多用 和ESI MS等软电离测定 软电离测定 除可获得EI MS能获得结构信息外 还具有样品用量少 分子离子峰强的特点 如chrysoeriol 7 o D glocopyranosidede的FD MS M z 404 b 58 c 乙二醇 300 A H 433 d 485 环氧及C 1 的间开裂C 4 与C 5 的间开裂苷元加氢 M 1 脱CHCO 再加氢转移 M Na 四 结构测定实例 从黄芩 ScutellariabaicalensisGeorig 根中分离出的成分 的结构测定 成分 淡黄色针晶 mp300 302 dec 元素分析C16H12O6 MSm z 300 M 55 6 285 100 118 19 4 UV maxnm IR maxkbrcm 1 3430 3200 1660 1610 1580 1H NMR CDSO d6 3 82 3H s 6 20 1H s 6 87 2H d J 9Hz 7 81 2H d J 9Hz 12 35 1H s 解析 成分 淡黄色针晶 mp300 302 dec FeCl3反应 阳性Mg HCl反应 阳性Gibb s反应 阴性SrCl2反应 阴性 具酚羟基黄酮类酚羟基对位无取代非邻二酚 可能为非邻二酚结构的羟基黄酮 元素分析C16H12O6 MSm