遗传毒理学2ppt课件.ppt

遗传毒理学 1 遗传毒理学基本概念2 遗传毒性形成的主要机制3 遗传毒性后果及其遗传毒理学应用4 遗传毒理学研究方法 讲授内容 一 基本概念 遗传毒理学 genetictoxicology 研究环境因素对机体遗传物质和遗传过程的作用 阐明遗传毒性对机体健康的后果及其作用机制 为防止环境因素对遗传物质的损伤 增加生物的遗传负荷 保护生态平衡和人体的健康提供科学依据的一门毒理学分支学科 一 遗传毒性的类型 基因突变 genemutation 染色体畸变 chromosomeaberration 染色体结构畸变 structuralchromosomeaberration 染色体数目改变 numericalchromosomeaberration DNA损伤 1 基因突变 是指基因在结构上发生了碱基对组成和排列序列的改变1 碱基置换2 移码突变3 三核苷酸重复4 大段损伤 碱基置换basesubstitution 转换transitionA GC T颠换transversionA CTC AGG CTT AG 移码突变frameshiftmutation 碱基插入或缺失1或非3的倍数 移码3或3的倍数 整码突变 三核苷酸重复 tripletrepeats 又称三联体重复 三核苷酸扩展即一特定的三联核苷酸扩增 重复数目超过正常数目如 正常人 基因中CCG CCG三核苷酸正常重复6 54次 而在脆性X综合症的人体内重复50 1500次 在强直性肌营养不良症 亨廷顿 Huntington s 病中也有此异常重复 大段损伤largesegmentdamage 指DNA链大段 数个至数千个碱基 的插入或缺失 可波及两个或数个基因 基因突变的分类 1 按突变发生原因分类2 按遗传信息的改变分类3 按突变效应的方向分类4 按基因结构改变类型分类 自发突变诱发突变 点突变移码突变三核苷酸重复大段损伤 同义突变错义突变无义突变 正向突变回复突变 2 染色体结构畸变 染色体畸变 由于染色体或染色单体断裂 造成染色体或染色单体缺失 或引起各种重排 从而出现染色体结构异常的称为染色体畸变或染色体结构畸变断裂剂 凡能引起染色体断裂的物质断裂作用 染色体断裂作用的发生或过程即为断裂作用 2 染色体结构畸变 染色体型畸变chromosome typeaberration染色单体型畸变chromatid typeaberration 染色体结构畸变的类型 裂隙 gap 断裂 break 染色体结构畸变类型 1 裂隙 gap 和断裂 break 2 断片 fragment 微小体 minutebody 和缺失 deletion 3 环状染色体 ringchromosome 和无着丝粒环 acentricring 4 倒位 inversion 5 插入 insertion 和重复 duplication 6 易位 translocation 染色体结构畸变类型 着丝粒融合 centicfusion 又称罗伯逊易位 Robersoniantranslocation 等臂染色体 isochromosome 3 染色体数目改变 整倍体 euploid 非整倍体 aneuploid 舟舟 Down氏综合征 21染色体三体综合征 4 DNA损伤 DNA分子结构的任何异常改变都是DNA损伤 包括DNA分子一级结构脱氧核糖 磷酸和碱基的损伤 DNA分子二级结构 三级结构及其构象动态变化的异常改变 DNA损伤的主要类型有DNA单链断裂 双链断裂 DNA链内 碱基 交联 DNA链间交联 DNA 碱基 与蛋白质的交联以及化学物与DNA碱基间的交联 DNA加合物等 二 遗传毒性形成机制 1 DNA损伤机制2 遗传损伤与DNA修复3不以DNA为靶的遗传毒性机制 1 DNA损伤机制 碱基类似物的渗入嵌合剂的致突变作用转座成分的致突变作用碱基的化学修饰作用DNA加合物和交联分子形成甲基化作用DNA构象改变增变基因DNA氧化性损伤 1 碱基类似物 baseanalogue 的取代 常见的碱基类似物 5 溴脱氧尿嘧啶 5 Brdu T2 氨基嘌呤 2 AP A 碱基类似物 baseanalogue 的取代 2 嵌合剂的致突变作用 有些大分子能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间 称为嵌入剂 intercalation 它们多数是多环的平面结构 特别是三环结构 其长度为6 8 l0 2nm 恰好是DNA单链相邻碱基距离的两倍 如果嵌入到新合成的互补链上 就会使之缺失一个碱基 如果嵌入到模板链的两碱基之间 就会使互补链插入一个碱基 无论多或少一个碱基都造成移码突变 吖啶橙acridine 原黄素 吖黄素 3 转座成分的致突变作用 转座子是存在于DNA上可自主复制和移位的基本单位 转座子的转移过程叫转座哺乳动物的DNA病毒和反转录病毒移码突变基因中断基因失活基因结构改变有害基因 4 碱基的化学修饰作用 有些化学物可改变DNA碱基的结构而后改变其配对功能而引起突变亚硝基 HNO2 氧化性脱氨羟胺 NH2OH 胞嘧啶衍生物烷化剂 烷基化作用 亚硝基氧化性脱氨 亚硝基氧化性脱氨 亚硝基氧化性脱氨 羟胺 胞嘧啶衍生物 烷化剂修饰 提供烷基氮芥类 乙撑亚胺类 磺酸酯及多元醇类 亚硝基脲类 三氮烯咪唑类和肼类硫酸二甲脂 甲基磺酸脂 乙基磺酸乙脂 5 DNA加合物和交联分子的形成 加合物 adduct 指亲电子性化学物与DNA作用形成共价结合物 许多化学诱变剂或其活化物分子上存在一个未配对的外层电子 具有缺乏电子的特点 是亲电子剂 electrophlicreagent 化学性质活泼 极易与蛋白质或核酸等大分子物质中富含电子的分子基团 亲核位点 如 SH OH N 等 发生共价结合 形成加合物或交联分子 参与形成DNA加合物的活性化学物 天然或人工合成的化合物 多环芳烃 芳胺 亚硝胺 霉菌毒素 农药 各种烷化剂 烷基硫酸醋 N 亚硝基化合物 氮芥和硫芥等环状烷化剂和卤代亚硝基脲等 等内源性 雌二醇等 大加合物代表物 多环芳烃 生物毒素 黄曲霉毒素B和芳香胺类后果 DNA的立体构象发生明显变化 阻断受损部位DNA的半保留复制和转录 小加合物代表物 烷化剂 亚硝基化合物后果 对DNA的构象影响较小 易导致碱基错误配对 共价结合的位点 DNA加合物的形成并非简单 随机的事件 而要涉及到特定的电子和立体化学结构 化学物质可能在DNA的碱基 磷酸二脂键和戊糖的不同位置上形成加合物 共价结合的位点 碱基易被烷化的位置为鸟嘌呤的N 3 N 7和O 6 腺嘌呤的N 1 N 3和N 7 胞嘧啶的N 3和O 2 胸腺嘧啶的N 3 O 2和O 4 DNA链上磷酸酯键上的氧也可受到烷化 A G T C 共价结合的位点 有些诱变剂与DNA共价结合的位置是比较专一的 如乙酰氨基芴 AAF 仅特异地作用与鸟嘌呤的C 8位 烷化剂对于多核苷酸链上的全部氧和氮原子 除连接戊糖的氮以外 均能在中性环境产生烷化作用 但已知N 亚硝基化合物主要与氧反应 并多数攻击鸟嘌呤的O 6位 而烷基硫酸酯几乎完全与氮反应 并多数攻击鸟嘌呤的N 7位 多环芳烃加合物主要形成在鸟嘌呤的C 8位 形成加合物的后果 1 碱基错配 C GT O 6 甲基 GO 6鸟嘌呤烷化后的碱基配对 形成加合物的后果 2 脱嘌呤作用 depurination 如鸟嘌呤的N一7位发生烷化后可导致鸟嘌呤从DNA链上脱落 致使在该位点上出现空缺 即碱基缺失 basedeletion 其结果是移码突变 偶然可能在复制时 其互补位置上随机配上一个碱基 于是导致转换或颠换 形成加合物的后果 3 DNA链断裂大的DNA加合物能阻断DNA的复制DNA加合物可发生在戊糖骨架或磷酸上 造成磷酸二脂键的断裂 形成加合物的后果 4 交联形成多功能烷化剂常使DNA链内 链间或DNA与蛋白质之间发生交联 crosslinkage 发生交联后的DNA链不易修复或发生易错修复 因而高度致突变 也经常发生染色体或染色单体断裂 并易发生致死性突变 交联也可能继发于脱嘌呤作用 紫外线 电离辐射导致形成嘧啶二聚体 6 异常甲基化作用 5mC是人基因组中最常见的一种DNA修饰方式 DNA合成完成后不久 在DNA甲基转移酶作用下 以5 腺苷甲硫氨酸作为甲基供体 使合成的DNA进行甲基化修饰 甲基化的维持是调节基因表达的一个重要机制 在人基因组中 有70 90 的5mC发生在CpG二核苷酸中 5 甲基胞嘧啶 5mC CpG在基因组中的分布是非随机的 约15 的CpG发生5mC甲基化 但这些甲基化的CpG一般是分散存在的 而 CpG岛 约1 2kb长的CG二核苷酸片段 哺乳动物基因组会有约3000个这样的CpG岛 彼此间隔平均约100kb 他的存在一般提示结构基因的起点 一般是不甲基化的 异常甲基化作用 DNA异常甲基化是人类肿瘤中常见的改变 且广泛参与了肿瘤的发生 发展过程 DNA异常的低甲基化可造成染色体不稳定 促进染色体的断裂 易位和丢失 以及原癌基因的激活 而DNA异常高甲基化主要发生在抑癌基因的启动子区域 是造成基因表达失活的重要机制之一 DNA异常甲基化作为分子生物标志物 在肿瘤的诊断 治疗和预后中均显示出广阔的应用前景 异常甲基化作用 异常甲基化 基因失活 突变热点 直接机制是指CpG岛甲基化干扰TF 转录因子 与调控区DNA的结合 间接机制包括甲基化DNA结合蛋白与甲基化DNA特异结合而抑制基因转录及DNA甲基化改变染色质结构 阻碍TF与DNA结合从而抑制转录 异常甲基化作用 异常甲基化 基因失活 突变热点 基因中极易受攻击的位置 其突变频率大大高于平均数 这些位点就称为突变热点 hotspotsofmutation 突变热点并非完全随机分布诱发突变和自发突变中均有突变热点 形成原因 5 甲基胞嘧啶 5mC 存在 5mC经脱氨形成胸腺嘧啶 在短的连续重复序列处容易发生插入或缺失突变 突变热点还与突变剂有关 5 甲基胞嘧啶 5mC 5 甲基胞嘧啶胸腺嘧啶 脱氨 C GT GT A 转换 CH3 5 甲基胞嘧啶 5mC 在目前已经报道的880种引起人类遗传病的碱基置换中 有38 的点突变发生在CpG二核苷酸中 且其中有86 6 属于 CT或GA转换 这种突变均由5mc脱氨所致 5 甲基胞嘧啶 5mC 人体基因组中的突变热点 如白蛋白基因 ALB 球蛋白基因 HBA 球蛋白基因 HBB 葡糖 6 磷酸脱氢酶基因 PAH C蛋白基因 PROC 抗凝血酶III基因 AT3 VIII因子基因 F8 及IX因子基因 F9 等 7 DNA的构象改变 乙酰氨基芴 AAF 和N 2 氨基芴 AF 都作用于鸟嘌呤的C 8位形成加合物 但结果有异 AAF主要导致移码 而AF主要导致颠换 发现在形成加合物时AAF插入DNA中 使鸟嘌呤凸出 于是导致DNA双螺旋局部变性 而AF则保持在双螺旋之外 不引起变性 又如 AAF对GGCGCC序列中的某一鸟嘌呤作用形成加合物 则产生 2移码突变的同时还出现该热点 基因中极易受攻击的位置 局部由B DNA 左旋DNA的一种 变为Z DNA 右旋DNA 的构象改变 8 增变基因 生物体内有些基因的突变与整个基因组的突变率直接相关 当这些基因突变时 整个基因组的突变率明显上升 因此把这些基因称为 增变基因 mutatorgenes 目前了解的有两类 一类是DNA聚合酶的各个基因 如果DNA聚合酶的3 5 校对功能丧失或降低 则使突变率升高而且随机分布 另一类是dam基因和mut基因 如果这些基因突变 则错配修复系统功能丧失 引起突变率升高 9 DNA氧化性损伤 内源性活性氧 热 辐射 药物 重金属 多环芳烃OH 可攻击T的C 5和C 6双键 中间产物可与O2反应生成胸嘧啶乙二醇 阻断DNA复制OH 和O2 直接与DNA分子反应导致DNA链断裂 碱基修饰和DNA蛋白交联等OH 和H 攻击糖残基引起DNA的碎裂 碱基丢失 链断裂加成鸟嘌呤生成8 羟基鸟嘌呤 2 DNA损伤与修复 化致突变学的模式 结构损伤损伤修复突变固定突变 1 光复活 photoreactivztion phr基因TTTT 光裂合酶 长波紫外线和短波可见光 直接修复 针对紫外线损伤产生的胸腺嘧啶二聚体 2 O6 烷基鸟嘌呤 DNA烷基转移酶 适应性反应 又称O6 甲基鸟嘌呤修复甲基鸟嘌呤鸟嘌呤 O6 甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶 甲基鸟嘌呤转移酶 MGMT 可修复 烷基甲基 乙基 正丙基 正丁基 2 氯乙基 2 羟乙基 异丙基 异丁基 半胱氨酸残基 3 碱基切除修复 baseexcisionrepair BER CpG GpC me TpG GpC pG GpC T TDG pG GpC APE1 CpG GpC XRCC1 polB LIG3 CpG GpC LIG1 3 XRCC1 polB TDG 3 碱基切除修复 baseexcisionrepair BER CpG GpC me TpG GpC pG GpC T TDG pG GpC APE1 CpG GpC XRCC1 polB LIG3 CpG GpC LIG1 3 XRCC1 polB TDG 主要针对氧化损伤 化学修饰和辐射引起的碱基损伤修复 5 AP内切核酸酶脱氧核糖磷酸酶 主要的DNA糖基化酶 尿嘧啶 DNA糖基化酶错配特异DNA糖基化酶G T 错配特异DNA糖基化酶A G 错配特异DNA糖基化酶针对烷化碱基的DNA糖基化酶3 甲基鸟嘌呤 DNA糖基化酶5 甲基胞嘧啶 DNA糖基化酶 主要的DNA糖基化酶 识别氧化碱基的DNA糖基化酶胸嘧啶乙二醇 DNA糖基化酶尿素 DNA糖基化酶羟甲基尿嘧啶 DNA糖基化酶5 甲酰基尿嘧啶 DNA糖基化酶Fpg家族 MutM和Fapy DNA糖基化酶 oxoG系统 如hOGG1 4 核苷酸切除修复 nucleotideexcisionrepair NER 损伤 XPC hHR23B XPA RPA TFIIH 识别 解旋 切除 ERCC1 XPF XPG XPB XPD 核苷酸切除修复核酸酶 解螺旋酶 POL LIG3 复制因子C 修复合成 针对引起螺旋变形的DNA损伤如紫外线 苯并 a 芘 顺铂等引起的化学性加合物 PCNA DNA聚合酶 5 错配碱基修复 mismatchbaserepair 错配修复蛋白MutH MutLMutS ATP 解旋酶 核酸外切酶 POL3 LIGE 人类 hMsh2 hMsh3 hMsh6hMIh1 hPms1 hPms2外切核酸酶1 FEN1DNA聚合酶 DNA复制因子RPA RF C细胞增殖核抗原PCNA GATC GATC 1 识别并除去错配的碱基对2 碱基活性修饰 5mC脱氨基作用3 遗传重组产生的含有错配核苷酸的DNA异源双链 6 DNA单链和双链断裂的修复 DNA单链断裂 依赖BER后期起作用的同一些酶进行处理和连接 之前 由外切核酸酶切除 擦破 的末端和由DNA激酶使5 端磷酸化 多聚 ADP 核糖 聚合酶 1 poly ADP ribose polymerase 1 PARP1 对单链断裂起一过性的保护作用 起到抗重组效应 6 DNA单链和双链断裂的修复 DNA双链断裂 1 单链退火2 非同源末端连接3 同源重组 非同源性末端连接 NHEJ Ku70 Ku80DNA pkcsXRCC1 DNA PK复合体将两个断端牵合在一起而促进两相对末端联会 DNA PK可使结合至相对末端的KU和DNA pkcs发生反式磷酸化 导致DNA pkcs解离并激活KU的解旋酶活性 使DNA末端解旋而发生微同源序列配对 连接常有短缺失 1 6个核苷酸 连接 KU70 XRCC6 KU80 XRCC5 DNA pkcs XRCC7 DNA依存性蛋白激酶 重组修复 RAD52群基因 在人类 已经克隆了5个RAD52同源基因 hRAD50 hMRE11 hRAD51 hRAD52 hRAD54 XRCC2 XRCC3 hRAD51B hRAD51C hRAD51D hDMC1 7 复制后修复 postrelicationrepair 跨损伤的DNA合成是一种耐受修复 复制时 DNA聚合酶将从DNA上解离而在新合成的链上留下一个缺口 DNA聚合酶跨过损伤合成 缺口通过重组作用及链延长作用填补 DNA损伤依然存在 7 复制后修复 postrelicationrepair SOS修复SOS系统只在细胞受到严重损伤或复制系统受到抑制时才出现特点 一种旁路系统 允许新生DNA链越过胸腺嘧啶二聚体而生长 保真度降低 好死不如赖活着 参与的酶 recA酶LexA酶这个系统是在DNA分子受到大范围的损伤情况下防止细胞死亡而诱导出的一种应急措施 是使细胞通过一定水平的变异来换取最后幸存手段 借用国际通用的紧急呼救信号 saveoursouls SOS 命名 表示细胞受到危急状态时的修复方式 修复过程 当DNA两条链的损伤邻近时 损伤不能被切除修复或重组修复 这时在核酸内切酶 外切酶的作用下造成损伤处的DNA链空缺 再由损伤诱导产生的一整套的特殊DNA聚合酶和SOS修复酶类 催化空缺部位DNA的合成 补上去的核苷酸几乎是随机的 但仍然保持了DNA双链的完整性 使细胞得以生存 由于SOS修复是一种错误修复 SOS系统可造成很高的突变率 在哺乳动物中也有类似机制 可能与癌变有关 因此受到高度重视 对于其修复的机制还有许多问题有待于进一步研究 损伤修复与突变 需要关注的几个问题 1 DNA损伤修复错误 错误修复2 DNA损伤修复能力和缺陷DNA损伤修复酶的多态性有害因素对DNA合成和修复酶系统的损害修复酶系统的甲基化3 细胞周期的关卡作用在DNA损伤修复的意义 MGMTERCC1XRCC1XRCC3 细胞周期的关卡作用 DNA损伤关卡时相顺序关卡1 传感器部分2 制动部分3 检修部分4 处理部分 DNA损伤信号 细胞停滞 DNA损伤修复 凋亡 细胞分裂 G1 G2 G1关卡G2关卡S关卡纺锤体关卡 细胞周期的关卡作用 细胞周期蛋白 依存于细胞周期蛋白的激酶 细胞转录活化因子 3 不以DNA为靶的作用机制 非整倍体和整倍体的诱发对纺锤体的毒作用对DNA合成和修复有关的酶系统的作用修复与突变 非整倍体和整倍体的诱发 不分离 染色体遗失 染色体桥 核内再复制 减数分裂 对纺锤体的毒作用 与微管蛋白二聚体结合与微管上的琉基结合破坏已组装完成的微管妨碍中心粒移动其它作用 DNA损伤修复的效率 体细胞突变 生殖细胞突变 良性肿瘤 恶性转化 细胞衰老 分化的胚胎细胞受损 未分化的胚胎细胞 显性致死 隐性致死 存活突变 动脉硬化 未知疾病 癌变 老化 出生缺陷 流产 死胎 癌变 出生缺陷 功能或结构畸形 流产死产 出生缺陷基因负荷 先天性疾病 三 遗传毒性的后果 遗传毒理学的应用 1 诱变剂的检测2 致突变机制研究3 遗传生物标志物的研究4 遗传损伤与疾病5 抗突变研究6 易感人群的筛查7 健康危险度的评定 1 诱变剂的检测 化学物质 环境污染物 放射线和放射元素 药物 农药 毒素 食品添加剂 病毒等检测方法研究慢性或低剂量接触条件下DNA损伤 3 遗传损伤与疾病 人类疾病相关基因的识别与鉴定病变组织 非病变组织致病基因的识别与鉴定动物模型 基因替代 治疗疾病分子机制的研究基因结构突变 表达水平改变 病因学研究诱变因素致病基因 标志物 3 遗传损伤与疾病 肿瘤 人类致癌物 癌基因 抑癌基因 增变基因 易感基因 代谢酶基因 修复酶基因 保护性蛋白 3 遗传损伤与疾病 衰老 线粒体DNA突变 缺失突变氧化性损伤 8 OH dG增长3倍 3 遗传损伤与疾病 动脉粥样硬化 6 磷酸葡糖脱氢酶 G 6 PD 原发性高血压 血管紧张素转换酶 ACE 血管紧张素原基因 AGT adducin基因 2 类上腺素受体基因G 蛋白 3亚单位基因 GNB3 上皮钠通道 亚单位基因 ENaC 3 遗传损伤与疾病 高脂蛋白血症 型 型 型脂蛋白脂酶 LPL 低密度脂蛋白受体载脂蛋白E载脂蛋白C II LDLR 非胰岛素依赖型糖尿病胰岛素基因 胰岛素受体基因葡萄糖激酶 线粒体tRNA基因 4 生物标志物 Biomarker 1987年 美国全国科学理事会 NRC 生物标志物委员会将生物标志物描述为反映生物系统或样本中所发生事件 event 的指标 并将其视为研究接触外源化学物与健康损害之间关系的工具 其广义定义为 测定生物系统与外源化学物之间相互作用关系的一种特异测量指标 4 生物标志物 Biomarker 遗传毒性生物标志物 利用人体不同生物材料反映遗传毒物接触水平 生物学效应和机体对遗传毒物反映能力与水平的生物学标记 就是生物标志物暴露生物标志物效应生物标志物易感生物标志物 暴露生物标志物 用以反映机体生物材料中 外源性化学物或其代谢产物或外源性化学物与某些靶细胞或靶分子交互作用产物的含量 尿1 羟基芘 多环芳烃 效应生物标志物 机体中可测定的生化 生理 行为和其他改变的指标 这些改变与化学物导致的健康效应或疾病相关联DNA加合物癌基因MN抑癌基因SCE特定基因突变 产物8 OH dG 易感性生物标志物 反映机体先天具有的或后天获得的对接触外源性化学物产生反应能力的指标代谢酶基因多态性 CYP1A1 DNA修复损伤修复酶基因多态性 XRCC1 2 3保护机制多态性 HSP70 理想的生物标志物的特征 与机制紧密相关敏感性和特异性标准化的方法便于现场使用方法难度非创伤性高通量分析费用适当 5 抗突变研究 抗诱变剂分类 机制 去诱变剂 desmutagen 使诱变剂灭活的物质生物抗诱变剂 bioantimutagen 干预突变表达的物质 抗诱变剂分类 作用部位 细胞外作用的诱变剂 阻止诱变剂摄入和形成灭活已存在的前诱变剂和诱变剂 抗诱变剂分类 作用部位 细胞内作用的诱变剂阻止诱变剂到达靶位点或阻止其于靶作用点发生作用抑制终变剂形成增强机体解毒酶活性直接与诱变剂结合消除已经存在的致突变的自由基阻止转化细胞表达阻止突变DNA修复 6 易感人群的筛查 遗传缺陷基因多态性代谢酶类修复酶类免疫类保护性蛋白类 7 危险度评定 riskassessment 在人群水平上 定性和定量地评估危害因素导致人类不良健康效应的可能性 主要由四部分组成 危害鉴定 剂量 反应关系评价 接触评定和危险度描述 四 遗传毒性检测方法 1 遗传学终点2 试验组合的原则3 常用的试验方法 1 遗传学终点 试验观察到的现象所反映的事件称为遗传学终点 geneticendpoint 1 遗传学终点 国际环境致突变物致癌物防护委员会 ICPEMC 于1983年提出致突变试验的遗传学终点分为五类 DNA完整性的改变 形成加合物 断裂 交联 DNA重排或交换 DNA碱基序列的改变 基因突变 染色体完整性的改变 染色体畸变 染色体分离改变 2 试验组合的原则 应包含5个遗传终点的原则 包含原核生物与真核生物的原则 包含体内试验与体外试验的原则 包含生殖细胞和体细胞的原则 3 常用的试验方法 1 基因突变测试 2 染色体畸变检测 3 DNA损伤标志的检测 4 现代分子生物学技术在基因突变检测中的应用 1 基因突变测试 微生物突变分析哺乳动物细胞突变分析昆虫突变分析哺乳动物体内突变分析 1 沙门氏菌 组氨酸回复突变分析 Ames 2 穿梭质粒 XYLE 邻苯二酚氧化酶 细菌回复突变试验 Ames试验 正向突变野生型菌株 原养型 突变型菌株 组胺酸营养缺陷型 回复突变 代谢活化系统受试物图3 4Ames试验原理 1 基因突变测试 微生物突变分析哺乳动物细胞突变分析昆虫突变分析哺乳动物体内突变分析 正向突变分析次黄嘌呤 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 HGPRT 胸腺嘧啶核苷激酶 TK 哺乳动物细胞正向突变分析 1 tk基因座 胸腺嘧啶核苷激酶 基因座位于常染色体 其基因产物为胸苷激酶 TK 该酶催化胸苷的磷酸化反应 使生成胸苷单磷酸 TMP 进一步生成DNA复制所必需的胸苷三磷酸 如果存在5 溴尿嘧啶脱氧核苷 BrdU 或三氟胸苷 TFT 等类嘧啶类似物 则产生异常的TMP 而异常TMP的存在将导致细胞死亡 如在受检物存在下 细胞对Brdu或TFT等发生抗药性 则说明tk基因座发生了突变 哺乳动物细胞正向突变分析 2 hgprt基因座 次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶 HGPRT 的编码基因hgprt位于人和啮齿动物的X染色体 由于X染色体在雌性有一条处于失活姿态 所以hprt基因座在雌雄两性是分别处于功能上的和结构上的单倍状态 HPRT催化次黄嘌呤和鸟嘌呤生成相应的核苷单磷酸 NMP 后者进一步合成DNA 如在6 巯基嘌呤 6 MP 6 硫代鸟嘌呤 6 TG 或8 氮杂鸟嘌呤 8 AG 等嘌呤类似物 则以这些物质为底物生成相应的NMP 这些异常NMP的存在将导致细胞死亡 如受检物使hprt基因发生突变而失活 hprt 细胞中的HPRT活性将大为下降 于是使细胞发生对嘌呤类似物的抗性 哺乳动物细胞正向突变分析 gpt基因座即xprt基因座 其基因产物可催化黄嘌呤 xanthine 和鸟嘌呤产生NMP 当6 TP等嘌呤类似物存在时 生成的异常NMP使细胞死亡 如受检物的存在下能使细胞对嘌呤类似物发生抗性 则可说明gpt基因座发生了突变 1 基因突变测试 微生物突变分析哺乳动物细胞突变分析昆虫突变分析哺乳动物体内突变分析 小鼠特异性基因座测试 SLT 小鼠体细胞皮毛斑点突变分析转基因动物 转基因动物 转基因动物是指基因组中整合有用实验方法导入的DNA 可以是完整的基因 也可以是完整的DNA片段 并能遗传给后代的动物 目前 用于致突变作用研究的转基因动物主要有商品化的BigBlu小鼠和MutaMouse小鼠 BigBlu小鼠以大肠杆菌LacI为靶基因 MutaMouse小鼠以大肠杆菌LacZ为靶基因 转基因动物 1 基因导入导出模型 LacI LacZ 2 穿梭质粒模型 Puc118 pESnx质粒 邻苯二酚氧化酶基因xylE靶基因 亚硝基胍为诱变物 靶基因突变和外周血 骨髓微核分析为终点 3 基因敲除模型 2 染色体畸变检测 染色体畸变分析微核试验显性致死试验荧光原位杂交技术 fluorescenceinsituhybridization FISH 荧光原位杂交技术 fluorescenceinsituhybridization FISH 它是利用一系列诸如由DNA重复序列 寡核苷酸片段构成的探针以及从染色体文库中构建的涂染探针 paintingprobe 可以识别中期和间期细胞中的特异染色区域 微核试验 micronucleustest 进展 1 双核微核试验2 图像分析系统3 使用细胞材料的扩展 微核试验 micronucleustest 细胞松弛素B阻止细胞分裂 微核试验 micronucleustest 动物 骨髓嗜多染红细胞 胚胎细胞 各种脏器细胞人血淋巴细胞 头毛囊细胞 痰液细胞 支气管肺泡灌洗液细胞 泌尿道上皮细胞 宫颈上皮细胞 口腔粘膜细胞 鼻腔粘膜细胞蚕豆根尖细胞 紫露草雄蕊毛细胞 3 DNA损伤标志的检测 1 单细胞凝胶电泳 single cellgelelectrophoresis SCGE 2 H2AX的检测3 程序外DNA合成试验4 DNA修复检测5 DNA加合物的测定6 姐妹染色单体交换试验7 精子畸形试验 1 单细胞凝胶电泳 单细胞凝胶电泳技术 singlecellgelelectrophoresis SCGE 也称彗星试验 cometassay 可以检测DNA单链和双链断裂 1 单细胞凝胶电泳 当细胞DNA受损产生链断裂时 DNA的超螺旋结构受到破坏 在细胞裂解液作用下 细胞膜 核膜等膜结构受到破坏 细胞内蛋白质 RNA及其它成分均可进入凝胶而扩散到裂解液中 而核DNA分子量很高不能进入凝胶 只能留在原位 在碱处理和碱性电泳液的作用下DNA解螺旋 使DNA的断链和碱易变性DNA片断从超螺旋结构中释放出来 这些DNA断链分子量较小且碱变性为单链 在电泳电场中就可以离开核DNA在凝胶分子筛中向阳极移动 形成慧星状图象 DNA受损伤愈严重 产生的断链和碱易变性片断就愈多 断链也愈小 在相同电泳条件下迁移的DNA量就愈多 迁移的距离就愈长 因此 通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定DNA损伤程度 确定电离辐射或其它因素作用剂量与DNA损伤效应之间的关系 1 单细胞凝胶电泳 检测指标 尾长 尾矩 olive尾矩分析软件 CASP软件 低暴露组 出现拖尾细胞 正常组 淋巴细胞核完整 无拖尾 高露组 细胞拖尾严重 2 H2AX的检测 DNA双链断裂 DNAdoublestrandedbreaks DSBs 发生后 产生一系列的应激反应 其中一个主要的反应就是毛细血管共济失调突变基因 ATM 起始的信号级联反应 它使细胞周期停顿直到损伤修复 H2AX是这一信号级联反应中的一个主要成员 它能被ATM磷酸化 称为 H2AX H2AX在DSBs位点形成焦点 并进一步募集一些损伤修复相关蛋白 如BRCA1 53BP1 Rad50和NBS1等 对DSBs进行修复 由于 H2AX的出现与DSBs紧密相关 且存在着一一对应关系 H2AX也被认为是检测细胞DNA双链断裂的一个新的特异性指标 H2AX与公认的反映DNA双链断裂的彗星试验具有很好的相关性 2 H2AX的检测 免疫荧光 直观 形象 在不同的研究中 镜下观察得到的 H2AX焦点的大小和荧光强度在不同的条件下可能发生变化流式细胞术 结果比较客观 准确 统计学精度也比较高 能进一步结合细胞周期来分析 H2AX含量的变化 但是 不能从单细胞角度分析 H2AX焦点的形成情况 免疫印迹 所需要的设备要求低 极易开展工作 它只能检测到 H2AX含量的变化 其他功能方面都不如免疫荧光技术或FCM 2 H2AX的检测 DNA加合物常用检测方法比较 方法灵敏度 加合物 108核苷酸 每次分析所需DNA量 g 荧光法同步荧光法3 1050 1000低温激光法10 100100激发 发射荧光法10 100100色谱 质谱法色谱 质谱法0 1 150 2000加速器质谱法0 0001 0 0010 001 0 01免疫法免疫法10 10025 60放射免疫法1 1050 5000竞争性酶联免疫法1050非竞争性酶联免疫法10 1000 1 1超敏酶促