赤芍总苷的提取纯化与质量检查设计方案

1 赤芍总苷的提取纯化与质量检查设计方案赤芍总苷的提取纯化与质量检查设计方案 1 文献背景文献背景 赤芍为毛茛科植物芍药 Paeonia lactiflora Pall 或川赤芍 Paeonia veitchii Lynch 的干燥根 具有清热凉血 散瘀止痛的功效 其主要有效成分为芍药苷 芍药内酯苷 氧化芍药苷 苯甲酰芍药苷 芍药花苷等单萜苷类化合物 总称 赤芍总苷 可改善机体微循环 抑制血小板凝聚 抗血栓形成 具有广泛的药 理活性 1 3 是一种可用于保健食品的中药 1 1 赤芍总苷背景意义 在药理学上 赤芍总苷对血液具有抗凝血 抗血栓以及抗内毒素和改善微 循环的作用 并且赤芍总苷对缺血性损伤如心肌缺血同样具有保护作用 4 正 是这样的良好使用疗效 我们需要对赤芍总苷进行更多的研究 来保证临床的 使用疗效 1 2 提取研究现状 目前报道的赤芍总苷提取工艺文献中 多采用正交试验设计法 5 即分别 称取赤芍药材若干 通常 800g 以不同的提取液 水 乙醇 分别按正交试 验设计表试验 滤过 合并滤液 量取体积 即得正交试验各试验的提取液 1 3 纯化研究现状 目前报道的赤芍总苷纯化工艺文献中 多采用正丁醇萃取法和大孔树脂吸 附法 6 即将提取过程中 包括糖类 脂类等许多杂质在内的浸膏提取液 补 充蒸馏水至药材的 2 倍量 作为待纯化样品溶液 纯化方法 1 正丁醇萃取法 取上述待纯化样品溶液 200ml 取等量石油 醚萃取 3 次 除去石油醚层 然后用水饱和后的正丁醇萃取 3 次 收集正丁醇 层 再用 200ml 蒸馏水洗 1 次 弃去水层 减压回收正丁醇 所得浸膏于真空 干燥器中干燥 纯化方法 2 大孔树脂吸附法 D101 大孔吸附树脂 100g 经 95 乙醇浸 泡 12h 充分溶胀后装柱 蒸馏水洗至无醇味 备用 上述待纯化样品溶液取 200ml 上树脂柱 3 倍量蒸馏水洗 再用 3 倍量的乙醇洗脱 收集 20 洗脱组 分 减压回收乙醇 剩余浸膏于真空干燥器中干燥 1 4 质量控制 2 赤芍中赤芍总苷质量控制包括性状鉴别 颜色 气味 薄层鉴别 蓝紫色 斑点 以及对其进行高效液相色谱的含量测定 检测波长为 230nm 理论板 数按芍药苷峰计算应不低于 3000 以及水分 炽灼残渣 重金属等检测 2 赤芍饮片的质量检查赤芍饮片的质量检查 2 1 性状性状 本品应呈圆柱形 稍弯 表面棕褐色 粗糙 有纵沟和皱纹 并有须 根痕和横长的皮乳样突起 有的外皮易脱落 质硬而脆 易折断 断面粉白色 或粉红色 有的有裂隙 气微香 味微苦 酸涩 2 2 鉴别鉴别 取本品粉末 0 5g 加乙醇 10ml 振摇 5 分钟 滤过 滤液蒸干 残 渣加乙醇 2ml 使溶解 作为供试品溶液 另取芍药苷对照品 加乙醇制成每 1ml 含 2mg 的溶液 作为对照品溶液 照薄层色谱法 附录 B 试验 吸取 上述两种溶液各 4 l 分别点于同一硅胶 G 薄层板上 以三氯甲烷 乙酸乙酯 甲 醇 甲酸 40 5 10 0 2 为展开剂 展开 取出 晾干 喷以 5 香草醛硫 酸溶液 加热至斑点显色清晰 供试品色谱中 在与对照品色谱相应的位置上 显相同的蓝紫色斑点 2 3 含量测定 含量测定 照高效液相色谱法 通则 0512 测定 2 3 1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 以甲醇 0 05mol L 磷酸二氢钾溶液 40 65 为流动相 检测波长为 230nm 理论板数按芍药苷峰计算应不低于 3000 2 3 2 对照品溶液的制备 取经五氧化二磷减压干燥器中干燥 36 小时的芍药苷对照品适量 精密称定 加甲醇制成每 1ml 含 0 5mg 的溶液 即得 2 3 3 供试品溶液的制备 取本品粗粉约 0 5g 精密称定 置具塞锥形瓶中 精密加入甲醇 25ml 称 定重量 浸泡 4 小时 超声处理 20 分钟 放冷 再称定重量 用甲醇补足减失 的重量 摇匀 滤过 取续滤液 即得 2 3 4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10 l 注入液相色谱仪 测定 即得 本品含芍药苷 C23H28O11 不得少于 1 8 3 参考文献 2015 版 中国药典 3 赤芍总苷的提取工艺赤芍总苷的提取工艺 3 1 指标成分的选择及含量测定指标成分的选择及含量测定 赤芍中所含丰富的苷类成分总称赤芍总苷 为赤芍的主要活性部位 其中 以芍药苷的含量最高 选择芍药苷作为含量测定的指标成分 3 1 1 HPLC 色谱条件的优化选择 色谱柱的选择 考察 Hypersil ODS 150mm 4 6mm 5 m 和 Hypersil BDS 200mm 4 6mm 5 m 流动相选择 流动相考察甲醇 水系统 甲醇 0 05 磷酸溶液系统 乙腈 水 及乙腈 0 05 磷酸溶液系统 流速选择 流速考察 0 6ml min 0 8ml min 1 0ml min 3 1 2 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品 10 63mg 置 25ml 量瓶中 加甲醇溶解并稀释至刻 度 摇匀 即得对照品贮备液 每 lml 含芍药苷对照品 425 2 g 3 1 3 标准曲线的制备 分别精密量取对照品贮备液溶液 425 2 g ml 0 5ml l 0ml 2 0ml 3 0ml 4 0ml 5 0ml 置 10ml 容量瓶中 加甲醇稀释至刻 度 摇匀 精密量取上述不同浓度对照品溶液各 10 l 注入液相色谱仪 按前述 色谱条件分别测定其峰面积 以对照品浓度 X 为横坐标 峰面积积分值 Y 为纵 坐标 绘制标准曲线 3 1 4 供试品溶液的制备及测定 取提取液 稀释至一定体积 滤过 即得供试品溶液 分别精密吸取对照 品溶液与供试品溶液各 10 l 注入液相色谱仪 测定 由外标一点法计算即得 芍药苷含量 3 2 提取溶媒的筛选 提取溶媒的筛选 赤芍中所含苷类成分极性较大 在水 乙醇等亲水性溶剂中溶解度较好 本实验以芍药苷的含量为评价指标 考察水和不同浓度的乙醇对芍药苷的提取 效率 筛选赤芍药材的最佳提取溶媒 见表 1 4 表 1 不同提取溶媒芍药苷含量 提取溶媒 水 50 乙醇 70 乙醇 溶媒用量 倍 666 提取次数 次 222 提取时间 h 1 51 51 5 芍药苷含量 3 3 正交试验设计优化提取工艺正交试验设计优化提取工艺 3 3 1 因素水平设置 溶剂法提取中影响提取效率的因素主要有溶媒用量 提取时间及提取次数 等 根据实际情况 设置醇用量 提取时间及提取次数为 3 个考察因素 因素 水平设置见表 2 表 2 因素 水平表 因素 水平 A 提取溶媒 倍 B 提取时间 h C 提取次数 次 1411 261 52 3823 3 3 2 实验安排及结果 考察影响提取效能的主要因素乙醇用量 提取时间 提取次数及相应水平 选取正交表 L9 34 作正交试验 所选因素一水平见表 2 称取川赤芍药材约 50g 按 L9 34 正交试验表按排试验 以芍药苷含量 芍药苷含量 提取液中芍药 苷质量 称取的药材量 100 为评价指标 试验方案见表 3 5 表 3 3L9 34 正交试验表 3 3 3 验证试验 以优化工艺条件重复试验 3 次 验证试验结果见表 4 表 4 验证试验结果 表头 A B C D 芍药苷含量 列号 1 2 3 4 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 I II III SS 6 4 4 赤芍总苷 赤芍总苷 TPGTPG 的纯化工艺的优化 的纯化工艺的优化 4 1 上样液预处理上样液预处理 赤芍醇提液减压浓缩至无醇味 加水适量分散溶解 过滤定容 制成每毫 升含 0 2g 生药 0 2g ml 1 的溶液 备用 4 2 大孔吸附树脂型号筛选大孔吸附树脂型号筛选 取 AB 8 型和 D 101 型大孔吸附树脂各 20ml 装于树脂柱中 径高比为 1 8 取样液 40ml 上样 先用 3BV 蒸馏水 再用 5BV 20 乙醇洗脱 合并乙醇洗脱 液 测定 结果见表 5 从芍药苷吸附解析率和残液中芍药苷含量综合考虑 选择树脂种类 表 5 树脂动态吸附实验结果 树脂型号 上样液含量 mg 吸附 解吸率 残液中含量 D101207 31 AB 8207 31 4 3 上样浓度考察上样浓度考察 取 AB 8 型大孔吸附树脂 3 份 每份 20ml 装柱 径高比为 1 8 分别取含 生药浓度为 0 1g ml 1 0 2g ml 1 0 3g ml 1样品液上样 吸附流速为 1 0ml min 1 然后用 3BV 水洗脱 再以 5BV 20 乙醇洗脱 按 4 3 色谱条件 进行测定醇洗脱液中芍药苷含量 结果见表 6 试验 试验号 投料量 固形物 固形物 RSD 芍药苷 芍药苷 RSD 方案 kg 得率 平均得率 含量 平均含量 1 2 3 7 表 6 上样浓度考察结果 上样浓度 g ml 1 0 10 20 3 芍药苷洗脱量 mg 洗脱率 4 4 泄漏曲线考察泄漏曲线考察 取 AB 8 型大孔吸附树脂 20ml 装于树脂柱中 径高比 1 8 取样品液 60ml 上样 吸附流速为 1 0ml min 1 收集流出液 每 5ml 为一流分 按如下色谱 条件测定 绘制泄漏曲线 确定最大上样量 色谱条件 Diamonsil C18 色谱柱 250mm 4 6mm 5 m 乙腈为流动相 A 水为流动相 B 按表 7 进行梯度洗脱 流速 1 0ml min 1 柱温 25 检测波长 230nm 表 7 流动相梯度洗脱时间表 时间 min流动相 A 流动相 B 0 1486 20 955 25 1486 4 5 吸附流速的考察吸附流速的考察 取 AB 8 型大孔吸附树脂 3 份 每份 20ml 装柱 径高比为 1 8 取样液 60ml 上样 吸附流速分别为 1 0ml min 1 2 0ml min 1 3 0ml min 1 进行 动态吸附后 先用 3BV 水洗脱 再用 5BV 20 乙醇洗脱 按 4 3 色谱条件进行 测定 结果见表 8 表 8 吸附流速考察结果 8 吸附流速 ml min 1 123 芍药苷洗脱量 mg 洗脱率 4 6 树脂径高比考察树脂径高比考察 取直径依次为 1 4cm 1 5cm 1 6cm 的树脂柱 3 根 分别加入 AB 8 型大 孔吸附树脂各 20ml 装柱 径高比为 1 6 1 8 1 10 取样液 60ml 上样 吸附 流速为 1 0ml min 1 然后用 3BV 水洗脱 再以 5BV 20 乙醇洗脱 收集乙醇 洗脱液 按 4 3 色谱条件进行测定 结果见表 9 表 9 树脂径高比考察结果 树脂径高比 1 61 81 10 芍药苷洗脱量 mg 洗脱率 4 7 水洗除杂体积考察水洗除杂体积考察 取 AB 8 型大孔吸附树脂四份 每份 20ml 装柱 径高比 1 8 取样品液 60ml 上样 吸附流速分别为 1 0ml min 1 进行动态吸附后 分别用 1BV 2BV 3BV 和 4BV 水洗 测定水洗脱液中芍药苷的含量 计算损失率 结果见表 10 表 10 水洗除杂体积考察结果 水洗脱体积 BV 9 1234 水洗液中芍药苷累积含量 mg 芍药苷累积损失率 4 8 洗脱溶剂考察洗脱溶剂考察 取 AB 8 型大孔吸附树脂 4 份 每份 20ml 装于树脂柱中 径高比为 1 8 60ml 样品液上样 吸附流速分别为 1 0ml min 1 然后先以 3BV 水洗脱 再分 别用 20 40 60 和 80 乙醇洗脱 按 4 3 色谱条件进行测定醇洗脱液中芍 药苷含量 结果见表 11 表 11 洗脱溶剂考察结果 洗脱剂乙醇 20406080 芍药苷洗脱量 mg 洗脱率 4 9 洗脱曲线洗脱曲线 取 AB 8 型大孔吸附树脂 20ml 装于树脂柱中 径高比为 1 8 60ml 样品液 上样 吸附流速分别为 1 0ml min 1 然后先以 3BV 水洗脱 再用 20 乙醇洗 脱 每 10ml 收集一份 洗脱液减压至干 以 10ml 甲醇复溶 按 4 3 色谱条件 进行测定醇洗脱液中芍药苷含量 绘制洗脱曲线 确定洗脱剂用量 5 赤芍中赤芍苷提取物的质量控制赤芍中赤芍苷提取物的质量控制 5 1 性状 性状 棕褐色粉末 气微香 味微苦 酸涩 5 2 鉴别 鉴别 取本品粉末 0 2g 加乙醇 10ml 振摇 5 分钟 滤过 滤液蒸干 残 渣加乙醇 2ml 使溶解 作为供试品溶液 另取芍药苷对照品 加乙醇制成每 10 1ml 含 2mg 的溶液 作为对照品溶液 照薄层色谱法 通则 0502 试验 吸取 上述两种溶液各 4 l 分别点于同一硅胶 G 薄层板上 以三氯甲烷 乙酸乙酯 甲 醇 甲酸 40 5 10 0 2 为展开剂 展开 取出 晾干 喷以 5 香草醛硫 酸溶液 加热至斑点显色清晰 供试品色谱中 在与对照品色谱相应的位置上 显相同的蓝紫色斑点 5 3 含量测定 含量测定 照高效液相色谱法 通则 0512 测定 5 3 1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 以甲醇 0 05mol L 磷酸二氢钾溶液 40 65 为流动相 检测波长为 230nm 理论板数按芍药苷峰计算应不低于 3000 5 3 2 对照品溶液的制备 取经五氧化二磷减压干燥器中干燥 36 小时的芍药苷对照品适量 精密称定 加甲醇制成每 1ml 含 0 5mg 的溶液 即得 5 3 3 供试品溶液的制备 取本品粉末约 0 2g 精密称定 置具塞锥形瓶中 精密加入甲醇 25ml 称 定重量 浸泡 4 小时 超声处理 20 分钟 放冷 再称定重量 用甲醇补足减失 的重量 摇匀 滤过 取续滤液 即得 5 3 4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10 l 注入液相色谱仪 测定 即得 将提取物中芍药苷含量换算成药材中芍药苷含量 对比药典 检查提取 纯化工艺是否合适 2015 版 中国药典 中规定赤芍药材中含芍药苷 C23H28O11 不得少于 1 8 5 3 5 系统适用性试验 线性关系考察线性关系考察 吸取上述对照品溶液 1 0ml 1 5ml 2 0ml 2 5ml 3 0ml 分 别置 25ml 量瓶内 加甲醇稀释至刻度 摇匀 分别精密吸取 10 l 注入液相色 谱仪分析 以进样量 g 为横坐标 峰面积为纵坐标 绘制标准曲线并进行 线性回归 结果见表 12 11 表 12 线性关系考察结果 芍药苷对照品 ug 峰面积 1 2 3 4 5 精密度试验精密度试验 精密量取已知浓度的芍药苷对照品溶液 10 l 按液相色谱条件 进样测定 6 次 结果见表 13 表 13 精密度试验结果 峰面积值平均值RSD 1 2 3 4 5 6 稳定性试验稳定性试验 取本品 制备供试品溶液 测定芍药苷于 0 2 4 6 8 10 小 时内峰面积 结果见表 14 表 14 稳定性试验结果 时间 小时 峰面积值平均峰面积值RSD 0 2 4 12 6 8 10 重复性试验重复性试验 取本品 一式 6 份 制备供试品溶液 测定样品中芍药苷含量 结果见表 15 表 15 重复性试验结果 样品量 g 芍药苷含量 mg g 平均含量 mg g RSD 1 2 3 4 5 6 加样回收率试验加样回收率试验 取已知含量芍药苷的本品 6 份 每份约 10mg 精密称定 分 别按样品中芍药苷含量精密加入芍药苷对照品 按供试品溶液制备方法制得供 试品溶液 精密量取续滤液 10 l 经 HPLC 分析 测定芍药苷含量 计算回收率 结果见表 16 表 16 加样回收率试验结果 取样量 g 样品中芍 药苷量 芍药苷对 照品加入 芍药苷测 得量 回收率 平均回收 率 RSD 13 mg 量 mg mg 5 45 4 水分水分 按 中国药典 2015 年版四部通则 0832 的第二法项下操作 取本品粉末 约 1g 平铺于恒重的扁形称量瓶中 厚度 5mm 精密称定 打开瓶盖 100 105 烘 5 小时 盖好 移至干燥器中冷却 30 分钟 精密称定 同样温 度下在烘 1 小时移至干燥器中冷却 30 分钟 精密称定 直至连续两次称定重量 之差 5mg 为止 按减失重量和称样量计算供试样品中水分含量 见表 17 表 17 水分含量 样品编号水分含量 平均含量 1 2 3 5 55 5 炽灼残渣炽灼残渣 按 中国药典 2015 年版四部通则 0841 进行炽灼残渣的检测 取本品粉末 约 1g 置已炽灼至恒重的坩埚中 精密称定 缓缓织灼至完全炭化 放冷至室 温 加硫酸 0 5ml 使湿润 低温加热至硫酸蒸汽除尽后 在 500 600 炽灼使 完全灰化 移置干燥器内 放冷至室温 精密称定后 再在 500 600 炽灼至 恒重 表 18 炽灼残渣 样品编号炽灼残渣 平均值 1 2 3