PCR(级研究生).ppt

1 PolymeraseChainReaction PCR 聚合酶链反应 Departmentofbiochemistryandmolecularbiology DNA 生命的蓝图 引物酶 引物酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 故事发生在1983年的春夏之交 Mullis开车的时候 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶 面对面地合成着DNA Mullis的第一个PCR实验 1983年9月中旬 Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37 一直保温 结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带 于是他认识到有必要用加热来解链 每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应 依次循环 1983年12月 他终于看到了被同位素标记的PCR条带 KaryB Mullis 1989年美国 Science 杂志列PCR为十余项重大科学发明之首 比喻1989年为PCR爆炸年 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖 由一对引物介导 通过温度的调节 使双链DNA变性为单链DNA 单链DNA与引物复性 退火 成为引物 DNA单链复合物 以及在dNTPs存在下DNA聚合酶使引物延伸而成为双链DNA 引物的延伸 这种热变性 复性 延伸的过程 就是一个PCR循环 一般通过20 30个循环之后 就可获得大量 106倍 的要扩增的DNA片段 又称为无细胞分子克隆技术 基因扩增技术或DNA扩增技术 Pg水平至ng水平 第一节PCR基本原理 一 PCR的基本原理 DNA体外的快速扩增技术 模板DNA PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮结束 第2轮开始 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 Taq Taq Taq Taq PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝数 2nn循环次数实际拷贝数 1 x nX平均效率 约为0 85n循环次数 20 第二节 PCR的过程 一 DNA模板的解链 变性 90 95 30s理论上 在90 左右能使DNA双链之间的所有氢键链断开 完全分离为单链 且在中性pH情况下 DNA的完整性仍能很好保存 二 DNA单链与引物的退火 复性 55 65 30 45s引物与模板单链特异性结合 较高的温度 不希望两条互补的模板单链结合在一起 DNA引物的量大大超过模板的量 竞争性结合 引物 模板几率 DNA自身复性几率 三 引物的延伸 新链DNA的合成 70 75 30 60s 2kb 首次循环 引物从3 端开始延伸 延伸片段的5 端为人工合成引物是特定的 3 端没有固定的终止点 长短不一 第二个循环 引物与新链结合 由于后者5 端序列是固定的末端 意味着5 端的序列就成为此次延伸片段3 端的终止点 N个循环后 由于多数扩增产物受到所加引物5 端的限定 产物的序列是介于两种引物5 端之间的区域 引物本身也是新生DNA链的一部分 SynthesisbyDNApolymerase ATGCATGCATGC A C G T PolymeraseChainReaction PCR SpecificshortDNAprimerannealstostrandtobecopied 5 3 SynthesisbyDNApolymerase ATGCATGCATGC A C G T T PolymeraseChainReaction PCR 5 3 SynthesisbyDNApolymerase ATGCATGCATGC A C G T T A PolymeraseChainReaction PCR 5 3 SynthesisbyDNApolymerase ATGCATGCATGC A C G T T A C PolymeraseChainReaction PCR 5 3 SynthesisbyDNApolymerase ATGCATGCATGC A C G T T A C G PolymeraseChainReaction PCR 5 3 SynthesisbyDNApolymerase ATGCATGCATGC A C G T T A C G T PolymeraseChainReaction PCR 5 3 SynthesisbyDNApolymerase ATGCATGCATGC A C G T T A C G T A PolymeraseChainReaction PCR 5 3 高度的特异性 引物的限定 高温扩增 高度的敏感性 微量样品 单拷贝基因 单个细胞 一根头发等 高效性 X106 操作简便快速 易于自动化 程序化 方法稳定 对标本的纯度要求底 纯化或粗制的 新鲜或陈旧的 各种细胞 体液 完整的或降解的DNA PCR技术的特点 特异性强 PCR反应的特异性决定因素为 引物与模板DNA特异正确的结合 碱基配对原则 TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性 靶基因的特异性与保守性 灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的 能将皮克 pg 量级的起始待测模板扩增到微克 g 水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 在病毒的检测中 PCR的灵敏度可达3个RFU 空斑形成单位 在细菌学中最小检出率为3个细菌 简便 快速PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶 一次性地将反应液加好后 即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性 退火 延伸反应 一般在2 4小时完成扩增反应 扩增产物一般用电泳分析 不一定要用同位素 无放射性污染 易推广 对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞 DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板 可直接用临床标本如血液 体腔液 洗嗽液 毛发 细胞 活组织等粗制的DNA扩增检测 PCR反应 第三节 PCR扩增的基本方法 一 PCR反应体系1 仪器台式微量离心机基因扩增仪微量塑料离心管 0 5ml或1 5ml 经高压灭菌 微量加样器 pipetman 20P 200P 1000P 电泳仪及电泳槽 紫外摄影装置 乳胶或塑料手套 Tip若干 PCR Agarosegelelectrophoresis Thefinalproduct UVvisualisation 3 4hours 2 试剂与试样 一般选用50 100 l体积 模板核酸 template如 人基因组DNA0 1 g 扩增引物 primer一对 各0 2 1 mol L TaqDNA聚合酶 2 5U dNTP 四种 各20 200 mol L 标准的缓冲液 10Xbuffer KCl Tris HCl MgCl2 BSA或DDT 无菌双蒸水或三蒸水石蜡油或矿物油 30 50ul 封闭 防止高温时液体的挥发 2 PCR反应试剂 1 模板单 双链DNA均可 不能混有蛋白酶 核酸酶 DNA聚合酶抑制剂 DNA结合蛋白类 一般100ngDNA模板 100 L 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加 2 引物浓度0 2 1 mol L浓度过高易导致模板与引物错配 反应特异性下降 3 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 0 5 2 5U 50 l酶量增加使反应特异性下降 酶量过少影响反应产量 4 dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入 浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度下降 影响DNA聚合酶的活性 5 Mg2 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 0 5mmol L 2 5mmol L反应体系 Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失 PCR产量下降 Mg2 过高影响反应特异性 Mg2 可与负离子结合 所以反应体系中dNTP EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2 浓度 PCR反应体系 1 10 PCRbuffer10 l2 dNTPmix各200 mol L3 引物11 mol L4 引物21 mol L5 DNA模板50ng 1 g6 Taq酶2U7 加双蒸水至总体积为100 l 二 常规PCR的反应条件预变性 94 300s 高温起动 充分变性 防止非特异性扩增 变性 90 95 30s 60s退火 55 65 30s 45s延伸 70 72 30 60s 2kb 25 35次cycle后 延长延伸 72 10min 充分延伸 冷却至4 或加入EDTA至10mmol L以终止反应 三 PCR基本操作程序1 加样 1 向一微量eppendorf离心管 壁薄 管底扁平 深度适宜 中依次加入 10 xPCRbuffer ddH2O dNTPs Primers 102 105个copy的DNA样品 TaqDNA聚合酶0 5 l 混匀后 离心 加入石蜡油 2 上机 设置循环程序 进行扩增 3 PCR产物电泳 凝胶的制备 点样与电泳 观察结果 作好记录或摄影 保存好实验结果 四 PCR扩增产物的分析 GelelectrophoresisRestrictionendonucleaseMolecularhybridizationNucleicacidsequence PCR扩增产物的电泳分析 琼脂糖凝胶电泳常用于临床检测 定性 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好 条带比较集中可用于科研及检测分析 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便 快速 最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为62 65 溶解后在37 下维持液体状态约数小时 主要用于DNA片段的回收 质粒与外源性DNA的快速连接等 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围 电泳缓冲液 常用三种缓冲液Tris 硼酸 TBE Tris 乙酸 TAE Tris 磷酸 TPE TBE与TPE 缓冲容量高 DNA分离效果好 但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高 容易使DNA沉淀TAE 缓冲容量低 但价格较便宜 因而推荐选用TAE 缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子 从而抑制DNA酶的活性 防止PCR扩增产物降解 核酸电泳的指示剂 指示剂 溴酚兰二甲苯青溴酚兰 在碱性液体中呈紫兰色电泳中 溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段 核酸电泳的染色剂 溴化乙锭 ethidiumbromide EB 是一种荧光染料 EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间 在紫外线激发下 发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为0 5 g ml的EB 有时亦可在电泳后 将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10 15min琼脂糖凝胶EB染色 肉眼可见核酸电泳带 其DNA量一般 5ng溴化乙锭太多 凝胶染色过深 核酸电泳带看不清时 可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察 酶切分析 根据PCR产物中限制性内切酶的位点 用相应的酶进行酶切酶切产物电泳分离后 获得符合理论的片段此法既能进行产物的鉴定 又能对靶基因分型 还能进行变异性研究 PCR RFLP 分子杂交 检测PCR产物特异性的有力证据检测PCR产物碱基突变的有效方法主要的杂交Southern印迹杂交斑点杂交 Southern印迹杂交 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链并作标记 探针 与PCR产物杂交此法既可作特异性鉴定 又可以提高检测PCR产物的灵敏度 斑点杂交 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上寡核苷酸探针杂交观察有无着色斑点主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析 RDB检测 地中海贫血突变基因 29 A G 28 A G 17 A T AAG TAG E CD26GAG AAG IVS I 1 G T IVS I 5 G C 27 28 C 41 42 CTTT 43 G T 71 72 A或 T 654 C T 微孔板夹心杂交法 通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异性杂交 使PCR产物间接地固定于微孔板上 然后 再用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域特异性杂交 漂洗后显色即可判断结果该法使用了两个杂交过程来检测一个产物 其特异性较一次杂交的检测法高 Principle NOS 1 1014 cm2 N 羟化琥珀酰亚胺酯 Principle CCCCCC CaptureProbe NH2 DetectionProbe Biotin NH2标记的探针 Biotin标记的探针 Avidin HRP显色系统 NOS基团 Principle PCR ELISA法 本法避免了电泳和杂交的步骤 适于常规ELISA记数仪检测5 端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列 因此 可以通过修饰其中一个引物的5 端使其携带便于PCR产物固定的功能基团 而通过另一引物5 端的修饰使产物便于检测 Sequence ThespecificmethodshouldbeROBUSTRe optimiseforeachsetofprimers 第四节PCR的优化OPTIMISEPCRCONDITIONS X OptimisingthePCRReaction Startingnucleicacid DNA RNATissue cells blood hairroot saliva semenThermo stableDNApolymeraseOligonucleotidesprimersTheconcentrationofMg2 inthereactionTheannealingtemperature 一 DNA聚合酶 最关键因素之一 1 Taq DNA聚合酶的热稳定性及最适延伸温度在70 80 具有最高聚合活性 高温时仍比较稳定 所以70 80 为其最适延伸温度 则退火和延伸反应温度可提高 限制了非特异性扩增产物的出现 增加了PCR的特异性 2 Taq DNA聚合酶的功能有5 3 聚合酶活性有5 3 外切酶活性无3 5 外切酶活性Taq DNA聚合酶TaqDNA酶的聚合出错率较高 2 1X10 4 然而通过优化反应条件 可使Taq酶的聚合出错率降低到原来的1 3 若要细胞克隆PCR扩增的产物 进行表达 扩增后必须测序证实才可使用 3 激活剂与抑制剂Taq DNA聚合酶 其活性需要Mg2 Mg2 的精确浓度主要取决dNTP浓度 Mg2 浓度过高导致非特异扩增 一般常用1 5mmol L 4 其他耐热DNA聚合酶TthDNA聚合酶 Thermusthermophilus 在较高的温度下仍具有逆转录酶活性 因此能很好地克服RNA链中普遍存在二级结构的难题 VentDNA聚合酶 具有校读功能 具有相对较好的高保真性 SacDNA聚合酶 FDDNA聚合酶 二 引物 寡核苷酸引物 引物 引物是PCR特异性反应的关键 PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上 只要知道任何一段模板DNA序列 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物 利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 引物的作用 决定PCR扩增产物的特异性与长度 决定PCR反应的成败 PCR引物的设计一般原则 引物长度一般以18 30bp为宜 过短则降低特异性 过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增 同时也增加引物合成的成本 引物间退火温度相差不要超过5 避免引物内部出现二级结构 避免序列内有较长的回文结构 使引物自身不能形成发夹结构 G C和A T碱基均匀分布 G C含量在40 60 之间 引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布 避免出现嘌呤或嘧啶连续排列 Avoidrepeatsequences 5 5 3 3 notargetPCRproduct PCR hairpinloopformation 5 NNNNNNNNNNNGCATGC 3 5 NNNNNNNNNNNNNNNNN 3 5 NNNNNNNNNNNGCA3 CGT 5 3 要避免两个引物间特别是3 末端碱基序列互补以及同一引物自身3 末端碱基序列互补的 使它们不能形成引物二聚体或发卡结构 引物3 末端碱基一般应与模板DNA严格配对 并且3 末端为G C或T时引发效率较高 引物5 末端碱基可不与模板DNA匹配 可添加与模板无关的序列 如限制性核酸内切酶的识别序列 ATG起始密码子或启动子序列等 便于克隆和表达 但其保护碱基有一定的要求 引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性 Avoidrepeatsequences 5 5 3 3 5 5 3 3 primerdimer PCR 3 repeat 5 NNNNNNNNNNNNNTATA 3 5 NNNNNNNNNNNNNTATA 3 5 NNNNNNNNTATA 3 3 ATATNNNNNNNN 5 Avoidrepeatsequences 5 5 3 3 noextension PCR 5 repeat 5 TATANNNNNNNNNNNNN 3 5 TATANNNNNNNNNNNNN 3 5 TATANNNNNNNN 3 3 NNNNNNNNATAT 5 5 5 3 3 其他 简并引物 多种寡核苷酸组成的混合物 彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异 嵌套引物 巢式PCR 使DNA序列得到有效的选择性扩增 86 NestedPCR toincreasespecificity Firstroundprimers FirstroundPCR Secondroundprimers SecondroundPCR Geneofinterest 三 模板 模板核酸的量与纯化程度 是PCR成败与否的关键环节之一 PCR模板制备与纯化 上述粗样品含有大量的PCR反应抑制物质 因此如何去除这些种类繁多的抑制剂或者添加必要的PCR反应增强剂显得十分重要 PCR模板制备与纯化 从各种粗样品中去除PCR反应抑制剂的程序不尽相同 但常用的手段包括 四 脱氧三磷酸核苷酸 dNTPs 五 Mg2 Taq酶活性所必需 游离的 Mg2 的标准使用范围 0 5 10mM 特异性的改进 降低Mg2 浓度 但要注意过低的Mg2 浓度又会影响扩增产物的产量 有效性的改进 提高Mg2 浓度 但过量Mg2 将导致非特异性扩增 Mg2 的浓度影响扩增产物的特异性 引物退火 引物二聚体的形成 熔点温度 酶的活性和准确性 因此 PCR反应系统的主要优化参数是Mg2 的浓度 六 PCR的热循环计划 PCR反应条件的选择 PCR反应条件为温度 时间和循环次数 温度与时间的设置 基于PCR原理三步骤 DNA变性 引物退火和反应延伸 而设置变性 退火 延伸三个温度点 双链DNA在90 95 变性 再迅速冷却至40 60 引物退火并结合到靶序列上 然后升温至70 75 在TaqDNA聚合酶的作用下 使引物链沿模板延伸 退火杂交温度和时间 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 特异性的改进 提高退火温度 比建议退火温度提高2 5 减少退火时间 过长的退火时间在正常情况下并不能提高产量 只会增加非特异性引物杂交的可能性 退火温度与时间 取决于引物的长度 碱基组成及其浓度 还有模板的长度 OptimisingtheAnnealingTemperature Primershaveacalculatedannealingtemperature e g 54 C TemperaturemustbeconfirmedpracticallyTemperaturestepsof2 CaboveandbelowUsegradientcycler 循环次数 决定PCR扩增程度 主要取决于模板DNA的浓度 选在25 40次之间 影响的主要因素包括 扩增底物 引物和dNTPs 有效浓度的下降 非特异性产物或引物二聚体对反应试剂的竞争作用 反应试剂的稳定性 扩增产物抑制作用 高浓度产物的退活作用以及不完全变性 第五节PCR中应注意的事项 一 防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开 无菌操作 二 设立对照 阳性对照 阳性模板阴性对照 阴性模板 第六节PCR技术类型 反向PCR 锚定PCR 不对称PCR 原位PCR RT PCR 重组PCR 差异显示PCR 免疫PCR 实时定量PCR 多重PCR 1 反向PCR reversePCR 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增 可对未知序列扩增后进行分析 如探索邻接已知DNA片段的序列 用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆 扩增基因文库的插入DNA 建立基因组步移文库 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 2 不对称PCR目的 扩增产生特异长度的单链DNA 方法 采用两种不同浓度的引物 分别称为限制性引物和非限制性引物 其最佳比例一般是0 01 0 5 M 关键是限制性引物的绝对量 用途 制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究 高浓度引物 低浓度引物 3 RT PCR 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应 用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变 呈现mRNA多态性 克隆mRNA的5 和3 末端序列 以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库 标准的RT PCR程序包括 mRNA的分离 cDNA反应的引物退火 mRNA反转录为cDNA cDNA的PCR扩增 引物选择有三种战略 基因特异性引物化 最精确灵敏 寡聚dT引物化 随机六聚体引物化 RDDP 反转录酶 引物 4种dNTP RNase 核酸酶H活性 DDDP DNA聚合酶活性 4种dNTP RNA DNA杂化分子 双链DNA cDNA第二链 反转录为cDNA 原位PCR 1990 以组织固定处理细胞内的DNA或RNA为靶序列 进行PCR反应 不必分离模板DNA或RNA 探针原位杂交 蛋白酶处理 多重PCR MultiPCR 加入多对引物 对同一模板的若干区域进行同时扩增 适用于绘制真核生物庞大基因或基因组中的缺失图谱 如分子病的临床辅助诊断 P1 P2 P3 P4 P1 P2 P3 P4 正常人扩增物 病人扩增物 多对引物的组合必须满足二个条件 将反应条件较为接近的引物组合在一起 以使反应条件尽量适合所有被扩增片段 同一反应内各扩增片段的大小应不同 以便检测时能通过电泳将各片段分离开 锚定PCR AnchoredPCR AAAAA3 3 GGGGGGGG 锚定引物 锚定PCR又称为cDNA末端快速扩增PCR 主要用于5 端序列未知的cDNA的扩增和克隆 5 5 5 CCCCCCCC 5 CCCCCCCC 5 特异性引物 免疫PCR 免疫PCR 结合了PCR扩增体系和以免疫反应原理为基础的技术 对扩增产物进行特异鉴定和定量分析的反应 一 寡核苷酸探针检测系统 二 RNA探针 抗体捕获系统 寡核苷酸探针检测系统 此种系统十分灵敏 它能检测微板中约10pg的生物素化PCR产物 并且适合应用于任何靶序列 RNA探针 抗体捕获系统 PCR RFLP 根据突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内而设计的对PCR产物作限制性片段长度多态性分析的技术 RFLP 在同种生物不同个体出现不同长度限制性片段类型的现象 PCR 限制片段长度多态性 114 PCRmutagenesis 诱