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神经细胞培养 第一节 细胞培养的基本知识 1定义 组织培养 Tissueculture 细胞培养 cellculture 器官培养 organculture 统称为体外培养 Invitro 2组织或细胞培养的优点 1 研究对象是活细胞2 研究条件可以人为的控制3 研究的样本可以达到比较均一性4 研究的内容便于观察 检测和记录5 研究的费用相对比较经济6 可作为一些遗传物质的运载细胞7 干细胞的广泛应用前景 3组织或细胞培养的不足 1 与体内条件存在差异 2 细胞培养存在一定的不稳定性 培养细胞学的研究内容 1培养细胞学在病毒学中的应用2细胞生物学的基础研究 细胞培养使细胞生物学迅速发展3细胞工程学的研究手段 利用细胞融合及杂交技术 进行细胞工程的研究与开发 4干细胞的培养及应用5淋巴细胞培养技术的应用6遗传性疾病的产前检查7细胞作为毒性实验及生物安全性实验的工具8细胞培养在现代生物技术中应用很广 如基因分离 基因测序与表达 基因转移与重组 癌基因的研究等 4培养细胞的特性1 培养细胞生长方式 a贴附生长型细胞 大多数 b悬浮生长型细胞 少数 2 培养细胞生长特点 贴附 接触抑制 密度依赖性 5培养细胞生长的条件1 细胞的营养需要 a基本营养物质 氨基酸 维生素 碳水化合物及一些无机离子 b营养因子等物质2 细胞的生存环境 a温度 哺乳动物和人类为35 37 鸟类为38 5 b气相及PH值 O2及CO2的值 CO2 5 PH 7 2 7 4c渗透压 260 320mmol L 3 无污染及无毒 体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境 无毒 与细胞直接接触者 培养器皿 底物 培养基 蒸馏水等 间接接触者 配制培养基的器皿 瓶盖 瓶塞等无污染 微生物及交叉污染 霉菌污染常见 6常用的培养用液及培养基 培养用液 水平衡盐溶液 见表 作用 消化液 胰蛋白酶液 二乙烯四乙酸二钠 胶原酶 甘氨酸羟脯氨酸敏感培养基 1天然培养基 血清 血浆 组织浸出液 水解乳蛋白 2合成培养基 SF12 等 常用的平衡盐溶液 g L 细胞计数法 原则 取0 1ml细胞悬液加Hanks液0 9ml 混匀后滴于血细胞计数板上 在低倍显微镜下计数四角大方格内细胞 计数过程中对于大方格边缘压线按照数上不数下 数左不数右的原则 细胞浓度 4个大方格内细胞数 4 104 稀释倍数 细胞数 ml 细胞活性的检查 台盼蓝染色 0 2ml细胞悬液加0 4ml台盼蓝溶液混合 滴少许于载波片上 低倍镜计数200细胞 算比率 正常不着色 死细胞为兰色 细胞活力 细胞总数 着色细胞数 总细胞数 100 第二节 神经细胞体外培养的基本概念和方案 神经细胞培养的类型1原代培养原代培养 primaryculture 指从活体获得细胞 组织或器官在体外条件下进行的第一次培养传代培养 subculture 当细胞持续生长到达一定密度之后 就应当将细胞分成两部分 或更多 至新的培养器皿并补充新的培养液为传代培养 2细胞系培养 一神经元的原代培养 Primaryculture 一 组织来源 1 种属 大鼠小鼠家鸡瓜蟾海兔蜗牛水蛭等2 年龄 一般为胚胎或新生动物组织神经胶质细胞 生后早期大部分神经元 胚胎末期颗粒细胞 生后两周以内主要根据轴突和树突广泛分枝发育之前培养 二 常用试剂1 培养液ADMEM BF12培养液CDMEM F12培养液D无血清培养液加神经营养因子ENeurobasal培养液2 D Hank 液 其中可加入牛血清白蛋白3g L HBSS 聚L 赖氨酸 处理培养皿 瓶 10mg L 5 10min神经营养因子 睫状神经营养因子 ciliaryneurotrophicfactor CNTF 支持交感神经 副交感神经和感觉神经的生长与存活 脑源性神经营养因子 brainderivedneurotrophicfactor BDNF 支持外周和中枢特殊细胞群体的神经细胞 硷性成纤维生长因子 basicfibroblastgrowthfactor bFGF 等 三 培养操作过程新生1 3d大鼠或者胚胎18 19d大鼠 麻醉后75 酒精浸泡消毒 断头后移入超净工作台 无菌条件下开颅 快速取脑 置于D Hanks液中 仔细剥除脑膜和血管 小心剥离脑组织 海马 放入10ml小瓶中剪碎 加入0 25 胰蛋白酶放入37 培养箱 定期振摇促消化 消化约20min 用含血清的DMEM培养液终止消化 吸管反复轻柔吹打 用200目不锈钢筛网过滤 将滤液分散组成制成细胞悬液 1000rpm min离心 洗细胞两次 每次10min 吸收细胞悬液 用血球记数板快速计数细胞数 用含10 胎牛血清的DMEM培养基 稀释细胞制成一定浓度细胞悬液 接种于经多聚赖氨酸处理过的24孔培养板或培养瓶内 板孔放置0 8 0 8cm的小盖玻片 放入5 CO2培养箱 37 培养 四 神经元的鉴定 神经元特异性烯醇化酶 NeuronspecificenoloseNSE 微管相关蛋白 MicrotubuleassociatedproteinMAP2 神经元 五 神经元的纯化 胞嘧啶阿拉伯糖 培养2d后用含5 10 mol L胞嘧啶阿拉伯糖的培养24hour 然后改用常规培养液 特殊培养液 neurobasal培养基 培养过程中注意事项 1 培养底物的处理 多聚赖氨酸和多聚鸟氨酸 PEI细胞外基质成分 胶原 细胞黏附分子单层非神经细胞单层的胶质细胞2 胰蛋白酶的作用时间 3 细胞合适的换液时间 大脑皮质不用经常换液海马神经元应半量换液胶质细胞经常换液 六 神经元的观察 刚分离出的神经元呈圆形 用倒置显微镜观察有明显的光晕 接种一般在2 6小时可贴壁 8小时已有纤细有突起长出24小时后可见细胞体积开始增大 呈圆形或椭圆形 生长良好的细胞可见胞体周围有明显的光晕 立体感强 突起以单 双突起为主培养至第4天 神经元胞体明显增大 形态多样 有些具有分枝的突起 培养7天后 神经元形态基本成熟 具有光滑的胞体 发育良好的突起 MAP 2 A B NSEstainneuron THstainneuron Confocallaserscanimagesoforgantypicsliceculturefromavianhippocampus Sliceculture Luciferyellowstain bar50 m N 运动神经元Dil标记 Purkinjecellinculture PEP 19 二 胶质细胞的培养 胶质细胞纤维性的分类 a大胶质细胞 星形胶质细胞原浆性少突胶质细胞b小胶质细胞周围神经系统主要是施万细胞 根据免疫组化反应分类 型星型胶质细胞和 型星型胶质细胞 研究胶质细胞的方法 1 从未成熟的脑组织分离 培养获得大量胶质细胞2 已经开发出能识别胶质细胞的免疫学标志物 利用细胞培养可研究胶质细胞的特性 受体的表达 星型胶质细胞和少突胶质细胞可与传统的神经递质发生反映 型胶质细胞可表达25种神经配体的受体神经营养因子的分泌 酶的诱导 蛋白质的合成神经递质的摄取髓鞘的形成神经的局部免疫反应代谢过程 胶质细胞培养的局限性 1大多来自于未成熟大脑 所以不能达到与体内相一致的成熟程度 即使成年也可能有干细胞的存在 其形态可能随培养条件而发生变化 存在不同的细胞亚群其性质有赖于他们与特殊神经元相互作用 培养用液 培养基 MEM450ml 血清45ml GLU 谷氨酰胺 青链霉素溶液8ml葡萄糖 谷氨酰胺 青链霉素溶液 100ml 葡萄糖30g 谷氨酰胺100mmol l 青霉素2 5 105U 链霉素2 5 10 g胰蛋白酶 0 25 少突胶质细胞的限定培养液 F12与DMEM 高糖 4 5g葡萄糖 L1 1混合后加入 BSA 终浓度为0 66mg ml 胰岛素 10ng ml 孕酮 20nmol l 腐胺 100 mol l 碳酸氢钠 3 6g l 硒 5ng ml T3 30nmol l 转铁蛋白 50 g ml 培养的方法 1 取材生后1天的大鼠 75 酒精消毒 断头 置于培养皿中2 沿纵轴剪开皮肤和颅腔 取出大脑皮质 去除嗅球等3去除脑膜 洗涤 Hanks液 4 组织剪成碎块 37 缓慢振荡约10min 5 胰蛋白酶消化6 重复吹打 自然沉淀数次 收集细胞悬液 或者6 移入试管吹打或加入胰蛋白酶形成单细胞悬液7 加入完全培养基终止8 调整细胞密度104 106 cm2接种于培养瓶 常规CO2孵育箱培养9 接种3天后换液 以后每两天换液10 传代 0 25 胰蛋白酶消化 覆盖细胞层即可 或着用摇晃的方法 传代时注意事项 a细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁大部分表面以前 不要急于传代b注意观察不同细胞有不同的消化时间 动作要轻柔 避免损伤细胞c首次传代时细胞数量要多一些 使细胞尽快适应新环境鉴定 星形胶质细胞鉴定 胶质原纤维酸性蛋白 GlialfibrillaryacidproteinGFAP A2B5 少突胶质细胞鉴定 GalC galactosidase 神经胶质细胞分离和纯化流程 第0 12天大鼠脑皮质混合细胞培养 第12天预震荡 260rpm 1 5h 收获非贴壁细胞 震荡 260rpm 18h 第13天贴壁的扁平细胞 富含 型星型胶质细胞 37 培养1h 收获贴壁细胞 富含小胶质细胞 非贴壁的 有突起的细胞 processingbearingPB 富含 型星型胶质细胞 含10 胎牛血清培养 富含少突交质细胞 化学限定培养 oligodendrocyte 2 typeastrocyte 0 2A 其他可选择的分离培养方案 1低密度接种培养获得 型胶质细胞 原理 在低密度时神经元和产生 型胶质细胞和少突胶质细胞的前体细胞不能存活优点 简单缺点 1 仅能获得 型胶质细胞2 成纤维细胞增殖能力更强3 部分 型胶质细胞体积变大2利用抗原和抗体结合原理用流式细胞仪分选获得3小胶质细胞在营养剥夺的情况下可以生长良好 污染细胞的去除 1成纤维细胞的污染 为 型星型胶质细胞主要污染细胞 用抗纤维结合素 fibronection 的抗体鉴别 1 预防为主 取材小于两天鼠 脑膜驱除干净 2 用D 缬氨酸代替培养基中L 缬氨酸2小胶质细胞的污染 1 预震荡的方法可以驱除大部分小胶质细胞 2 在培养液加入5mmol l的L 亮氨酸甲酯 两小时后可杀死小胶质细胞 3 让细胞先帖壁半小时后在其他培养皿接种 3少突神经胶质细胞的污染 1 含血清培养 2 在传代培养时用抗半乳糖脑苷脂抗血清或补体处理 神经胶质细胞培养的应用 1受体表达研究 星型胶质细胞和少突胶质细胞可与传统的神经递质发生反映 型胶质细胞可表达25种神经配体的受体细胞谱系的研究 研究O 2A前体细胞的分化 型胶质细胞分化的研究 胎牛血清中存在诱导O 2A前体细胞分化为 型胶质细胞的血清因子称为星型胶质细胞诱导分子 astroglia inducingmoleculeAIM 神经元与胶质细胞相互作用的研究 GFAP humanSchwanncells 细胞系的生长过程 有限细胞系 原代培养传代期衰退期无限细胞系 滞留期指数增长期平台期 三 神经细胞系培养 有限细胞系 无限细胞系 指数细胞数量 培养时间 周 原代培养 细胞系阶段 神经肿瘤细胞系培养 优点 容易生长 增殖速度快 实验操作简单等优点 可以用液氮长期保存 培养条件标准化 可以导入外源基因 缺点 不能表现出神经元分化的许多过程 不能植入人体 神经细胞系的建立 1 动物诱发性神经肿瘤分离细胞进行培养 PC12 2 将连续细胞系的细胞与神经系统特殊区域分离的细胞融合 3 利用含有癌基因的逆转录病毒感染神经细胞 使神经细胞获得永生 Neuroblastomacellsonglassslide 原始数据图 颜色表示荧光强度 Neuroblastomacellsonsiliconwafer 硅片Ra 20nm神经母细胞瘤细胞生长密度很高细胞膜电位正常活性很高Rh 123染色荧光照片100X 神经母细胞瘤细胞贴附良好 开始分化并且形成网络 大鼠嗜铬细胞瘤株PC12的培养 PC12细胞 来源于大鼠嗜铬细胞瘤克隆 其具有嗜铬细胞瘤和肾上腺嗜铬细胞相关的表型 可以合成儿茶酚氨 在有NGF的作用下细胞停止增殖 生长出神经突起等特点 优点 1 相当高的稳定性和同质性2 分化程度高 对NGF有很强的反应3 已经具备了PC12细胞的生物学特征的背景资料所以常被广泛用于神经细胞分化和功能的研究 局限性 1PC12不能作为所有类型神经元模型2不能接受形成突触联系 3在NGF处理后仍然可以继续合成DNA4可能发生自发性突变和继发性变异5长期培养可能出现明显不同的细胞亚群而导致感性趣的表型消失 一 PC12细胞的常规培养1 培养液 85 RPMI1640培养液 10 马血清 5 胎牛血清 也可用DMEM或F122 培养的底物 PC12细胞对塑料和玻璃黏附能力较差 所以必须在培养前进行底物处理 胶原 多聚赖氨酸 多聚鸟氨酸等 PC12细胞的培养和传代 1 PC12细胞增倍时间为2 5 4天实际可7 10天传代一次 2 传代比例为1 3或1 43 换液时间为2 3天每次换液约为2 3的培养液4 通过机械分离进行传代培养 用吸管轻轻吹打5 必须选择生长在胶原或着其他底物的细胞群体进行传代 PC12细胞的冻存和复苏 PC12细胞可长期冻存保种过程 细胞吹打从培养皿脱落 离心收集 并悬浮于10 DMSO的完全培养液中 用冻存管分装细胞悬液 方法为每分钟 1 C的速度降至 60 C 或者放入 80 C过夜 可达6个月 长期冻存可放置于液氮罐中 复苏 37 C水浴中快速复温 离心漂洗去除冻存液后重悬浮于完全培养液 PC12细胞培养常出现的问题 1 细胞生长不良血清问题或密度过低2 细胞贴壁不良3 对NGF反应不良 细胞群体变异 NGF失活 神经生长因子 NGF 的处理 1神经纤维的生长研究 1 细胞密度 2 5 10 x1042 合适的底物处理方案 NGF可减弱细胞对塑料培养皿的黏附能力3 NGF的浓度 工作浓度为2nmol l储存浓度为250 g ml 溶剂为醋酸钠缓冲液 ph 5 温度为 804 作用时间 10天左右 神经生长速度为50 m d 2神经纤维再生 研究NGF对神经再生的作用 方法 NGF预处理一周吹打离心 去上清液并重新接种 可2 3天重新形成网络 可冻存长期保存 3NGF去除 研究NGF作用方法 1 先更换培养液4 6次 间隔培养数小时再换2次 吹打细胞 离心漂洗4次 再接种 2 用抗NGF血清 PC 12cells NGF NGF9days NGF9days NGF14days 神经元网络在神经芯片上的定位培养 神经界面芯片的研究 慕尼黑的MaxPlank生物化学研究所的PeterFromherz和GuntherZeck将蜗牛神经细胞置于一个硅芯片上 使用微型塑料桩子将它们围在特定位置 邻近的细胞彼此之间以及与芯片之间形成连接 2001 在每个神经细胞下的刺激物产生一个电压的改变从而激起一个通过整个细胞的电冲动产生 作用于芯片上的电冲动从一个神经细胞传递到另一个 再传回到芯片经历一次硅转换 该回路从严格意思上来说是有生命的 Fromherz2001nature 改变硅片表面的物理参数 比如表面粗糙度Ra设计成网格状的图案 不同区域拥有不同的粗糙度大鼠黑质神经细胞可以在粗糙度合适的位置上生长 Fan 2002 当前研究进展 研究硅基芯片的结构参数和神经元在芯片上的贴附性能的关系多种神经细胞在具有纳米粗糙度的硅片上的培养后的存活和状态分析改变硅基底纳米粗糙度Ra5nm 100nm 改变培养细胞种类不同的神经细胞可能会有不同的表面粗糙度要求 培养条件的变化可能会导致细胞对表面粗糙度要求的变化 有无血清 硅片的处理 原料Si光滑面Ra 5nm 腐蚀 用20 HF进行腐蚀 Ra 20nm t 10min 清洗 用丙酮和浓硫酸洗除光刻胶 消毒 紫外灯照射或者臭氧消毒 神经细胞种类的选取 大鼠黑质细胞nigracells大鼠脑干细胞 brainstemcells神经母细胞瘤细胞SK N SHneuroblastomacells鸡胚背根神经节细胞 DRGcells 粗糙度的不同导致细胞的活性差异 Ra 50nm Ra 20nm 硅片 Ra 20nm Ra 20nm 细胞内外膜电位变化也很显著 但是膜完整性不好 表现在峰上有波动 硅片 Ra 50nm 细胞膜内外电位变化显著 但细胞核区域膜电位偏高 细胞呈现多种形态分化 突起明显生长出延伸很长的伪足有多极也有双极的细胞Rh 123染色荧光照片400X 神经干细胞的分离和培养 NSC可定义为既可以自我更新又可分化为中枢神经系统内所有细胞类型的具有多向分化潜能的一类细胞 神经干细胞的来源 胚胎干细胞成年的侧脑室下区 SVZ区 和海马齿状回的颗粒细胞层 SGZ 成人嗅球神经干细胞骨髓基质细胞的转分化 神经干细胞 Neuralstemcells 一般处于静止或缓慢生长的状态 称为先祖细胞progenitorcells或过渡细胞transientcells 但是一般认为 先祖细胞 progenitor 这一概念主要指那些比干细胞更具有明确发展方向的细胞 而前体细胞 precursor 则是一个不甚严格的概念 泛指那些处于发育更早期的细胞 随时准备应付正常损耗或伤害之所需 在遇到伤害的情况下 干细胞可以很快扩展以取代失去的细胞 但仍保留一定数量的干细胞于原处以备下次之用 诱导干细胞增殖和分化的营养因子 bFGF对神经干细胞分裂和增殖具有重要作用对胎鼠纹状体海马人胚胎干细胞的增殖和分化有重要作用 EGF 表皮生长因子 对干细胞有分裂和增殖作用 BDNF使干细胞分化为神经元CNTF 睫状神经营养因子 定向分化为胶质细胞 胶质细胞生长因子 使干细胞分化为施万细胞BMP 骨形成蛋白 与NGF作用可使干细胞成为胶质细胞T3 少突胶质细胞的前体细胞 大鼠胚胎海马神经干细胞培养 一 培养用液 PBS G溶液 含有6g L葡萄糖的PBS ph 7 4N2培养基 DMEM F12 1 1 混合 添加有29mmol l孕酮 30 mol l硒酸钠 100 mol l腐胺 3 9mmol 谷氨酰胺 5 g ml胰岛素 mol l转铁蛋白 多聚鸟氨酸溶液 终浓度为 g mlbFGF 分装后 20 C终浓度为20ng ml二 细胞分离和培养步骤1 孕期16天大鼠麻醉后腹部用75 酒精消毒 剪开腹腔取出角状子宫 取出胎鼠 2 胎鼠用75 酒精消毒断头处死 剪开颅腔 解剖显微镜下去除脑膜 分离获取海马组织 3 海马组织置于PBS G溶液中吹打40次机械分离4 离心吸除上清得到沉淀 用N2培养液重悬细胞5 取少量细胞悬液滴于血球计数板上进行计数 6 将细胞接种于已经处理过的培养板上 7 培养液添加bFGF置37 C 5 CO2培养8 3 4天换液一次 培养一段时间传代 神经干细胞的鉴定 目前关于神经干细胞的鉴定还在探讨中 主要有以下几种NestinBrdUPSA NCAM tubelin vimentinGAL CA2B5 GFAP此外还有CD133等 神经干细胞的生长方式 积聚成神经球并向四周扩散 神经干细胞培养的应用 大大促进了神经发育机制的了解 使一些神经营养因子直接应用于体内细胞的增殖和分化有效解决细胞来源 免疫排斥 不能长期存活等问题 使自体细胞移植治疗某些神经退行性疾病成为可能 基因治疗的载体 SamuelI Stupp BoardofTrusteesProfessorDepartmentofMaterialsScience EngineeringDepartmentofChemistry andFeinburgSchoolofMedicineNorthwesternUniversity 利用纳米技术培养神经干细胞并诱导其分化为神经元 1 制备一种纳米级的三维材料 IKVAV PA 2 这种纳米级材料通过具有极性的多肽分子的自组装形成3 这种分子结合一段具有生物活性的多肽链 它有使神经干细胞分化成神经元作用 AMoleculargraphicsillustrationofanIKVAV containingpeptideamphiphilemolecule IKVAV PA anditsself assemblyintonano fibers BScanningelectronmicrographofanIKVAVnanofibernetworkformedbyaddingcellmedia DMEM toapeptideamphiphileaqueoussolution Table1 ListofPAmoleculesMoleculeNterminusPeptide NtoC ChargepH71HCCCCGGGS PO4 RGD 22C6H11OCCCCGGGS PO4 RGD 33C10H19OCCCCGGGS PO4 RGD 34C16H31OCCCCGGGS PO4 RGD 35C22H43OCCCCGGGS PO4 RGD 36C10H19OAAAAGGGS PO4 RGD 37C16H31OAAAAGGGS PO4 RGD 38C16H31OCCCCGGGS PO4 39C16H31OCCCCGGGS PO4 KGE 310C16H31OCCCCGGGS PO4 RGDS 311C16H31OCCCCGGGSRGD 112C16H31OCCCCGGGEIKVAV 1 PNASApril16 2002vol 99no 85133 5138 1 CandD ThissolidcontainedencapsulateddissociatedNPCsorclustersofthecellsknownasneuros