生物公司内部-荧光定量PCR的全面SOP

1 实时荧光定量实时荧光定量 PCR Q PCR SOP 流程流程 1 实验前需要确认的信息实验前需要确认的信息 1 1 客户提供样本的数量 编号 种属 样本来源部位 1 2 样本类型 细胞或组织等 1 3 保存条件 1 4 检测方法 1 5 检测指标 1 6 上样顺序 1 7 试剂是否齐全 1 8 客户基本信息 姓名 邮件地址 电话信息等 2 实验开始前需要准备实验开始前需要准备的的试剂及仪器试剂及仪器 2 1 实验试剂实验试剂 试剂名称试剂名称试剂用途试剂用途生产商生产商货号货号 TRIZOL裂解细胞 释 放 RNA invitrogen15596 026 氯仿使有机相和无 机相迅速分离 萃取 RNA 江苏永华151902104 异丙醇沉淀 RNA国药80109218 75 乙醇 用 DEPC 水和无水乙醇配 清洗 RNA 去 除杂质 国药10009164 红细胞裂解液去除红细胞BDMG0048 RNA 抽提 试剂 DEPC 水溶解 RNA 沉淀生工DD1005 dNTP Mixture 10mM DNA 聚合酶的 底物 TakaraD4030RA RTase M MLV RNase H RNA 反转录酶TakaraD2639A 逆转 录相 关试 剂RNasin RNA 抑制剂TakaraD2313A 2 Inhibitor 40units l Random Primer随机引物TakaraD3801 SYBR Premix Ex Taq 2 荧光染料 TakaraDRR420A Q PCR 反应 相关 试剂 Deoxyribonuclease I DNase I DNA 酶 TakaraD2210 实验实验仪器仪器 名称生产商型号国别 PCR 扩增仪器Bio radPTC 100美国 匀浆机IKAT8德国 微量核酸蛋白检测仪ABI7500美国 实时荧光定量 PCR 仪NanoDropND 1000美国 3 Q PCR 实验实验操作流操作流 3 1 实验原理 简单描述 实验原理 简单描述 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对 起始模板定量及定性的分析 在实时荧光定量 PCR 反应中 引入一种荧光化 学物质 随着 PCR 反应的进行 PCR 反应产物不断累计 荧光信号强度也 等比例增加 每经过一个循环 收集一个荧光强度信号 可通过荧光强度变化 监测产物量的变化 从而得到一条荧光扩增曲线图 3 2 实验总体注意事项实验总体注意事项 3 2 1 为得到最佳的实验结果 实验人员要尽可能减少样品间交叉污染的可能 避免将核酸从一个实验带入下一个实验 以下措施有助于避免实验污染 问题 3 2 2 用稀释的漂白剂或净化剂以及 75 酒精抹擦工作台 3 2 3 理想的条件是在指定地配有紫外灯的超净室 罩式或台式超净台中准备 样品 如果没有要确保操作台的洁净 3 2 4 在样品准备和配制反应液过程中勤换手套 3 3 2 5 使用专门的移液器和枪头 勤用稀释的漂白剂清洁移液器 3 2 6 只使用 PCR 级的水和 PCR 专用试剂进行 PCR 实验 3 2 7 用带旋盖的 EP 管稀释和配制反应液 3 2 8 除了注意以上事项 在进行 PCR 实验时 还应准备一个无模板的对照来 验证有无污染发生 3 2 9 为最小化实验结果的统计学偏差 先制备混合反应液 建议所有样本有 三个重复 大剂量包装的反应试剂 使用前进行分装 尽量减少试剂的 反复冻融 3 3 标准标准步骤步骤 基本流程 RNA 的提取 反转录成 cDNA 引物设计 Q PCR 的扩增 3 3 1 不同样本不同样本 RNA 抽提 抽提 A组织样本 先用液氮研磨破碎或者加 TRIZOL 溶液后用匀浆机破碎 一 般需要客户提供动植物组织 30 50mg 如黄豆大小 如果组织完整需 要先将其剪碎至小块状以便于匀浆 加 1mlTRIZOL 根据提供的样本 量以此增加或减少加入的 TRIZOL 量 租用平台的匀浆机 在冰上操作 用 PBS 清洗匀浆机机头 用纸擦干 伸入 1 5mlEP 管至 TRIZOL 溶液 2 3 处每次匀浆 3 5 秒 防止机头过热 直到明显组织块均破碎 每换 一个样本匀浆都要清洗机头 B全血样本 先以 1 3 1 5 1ml 样本加入 3 5ml 裂解液 加红细胞裂解液 至样本中 室温静置 10min 3500 转 6min 弃上清后加 TRIZOL 溶液 一般全血样本 2 3ml 对应 1mlTRIZOL C细胞样本 细胞一般接种孔板时用细胞计数板计数 1 105 1 106 细胞 长到 70 80 以上 贴壁细胞吸掉旧的培养基 用 PBS 清洗两遍 加入 1 2mlTRIZOL 铺满 孔板或培养瓶瓶底 几分钟后贴壁细胞脱落裂解完全加到 EP 管中 悬 浮细胞吸到离心管中 1200 转离心 2 3min 吸去废培养基加入 1 2mlTRIZOL 4 操作流程操作流程 1 以加 1ml TRIZOL 溶液为例 充分混匀 静置 10min 2 4 12000g 离心 10min 吸取上清放入新的 EP 管中 不要吸到沉淀 3 加入 200ul 氯仿剧烈振荡 15S 然后室温静置 5min 4 4 12000g 离心 15min 离心液体分三层 下面是氯仿 中间是油脂 上面是含 RNA 的溶液 小心吸取上层液体 转移到一个新的 EP 管中 不要吸取到油脂 5 加入等体积异丙醇 轻轻混匀 室温静置 10 分钟 此步不要太剧烈震 荡 上下颠倒 10 下左右即可 6 4 12000g 离心 10min 弃上清 沉淀用 75 乙醇洗涤两次 第一次要 把沉淀全部旋起 7 4 7500g 离心 5min 弃上清 沉淀干燥 风干后用 15ul 或 20 ul DEPC 水溶解得到 RNA 原液 3 4 RNA 浓度测定 浓度测定 3 4 1 RNA 纯度鉴定纯度鉴定 在平台使用微量核酸蛋白检测仪鉴定得到 RNA 的浓度 纯度指标 浓度以 ng ul 为单位 纯度用 A260 A280 的比值表示 具体测定流程由平台的工作 人员操作并打印出结果详单 3 4 2 反转录体系操作流程反转录体系操作流程 Step 1 基因组 DNA 去除 一般根据引物设计是否跨内含子来决定是否去 除基因组 DNA 如果引物设计跨内含子则不需去除 直接按照 Step 2 往下操作 如何去除 去除基因组 DNA 按以下体系 在无核酸酶的离心管中加入以下 组分 反应组成成分反应组成成分体积体积 RNA3 g DNAas I 60 80 U l 1 l 10 DNase I Buffer1 5ul RNase Inhibitor 40units l 0 5ul 37 60min 80 10min 5 DEPC ddH20补至 15 l Step 2 在无核酸酶的离心管中加入以下组分 如果紧接第一步反应则直接 加组分至原离心管中 反应组成成分反应组成成分体积体积 RNA 去除基因组 DNA 2 g Random Primer 25um 1 l DEPC ddH20补至 15 l 15ul 体系 70 10min 然后在冰上迅速冷却 2min Step 3 在上述体系中再加入如下成分 反应组成成分体积 5 M MLV Buffer5 l PCR Nucleotide Mix 10mM each 1 25 l RNase Inhibitor 40units l 1 l M MLV Reverse Transcriptase1 l DEPC ddH2O1 75 l 10ul 体系 30 10min 42 60min 70 15min cDNA 产物在 20 保存 3 5 引物设计 具体操作流程参见附件的视频教程 引物设计 具体操作流程参见附件的视频教程 引物使用 Primer5 0 软件设计 由 invitrogen 公司合成 引物设计原则 1 PCR 扩增产物长度 80 150bp 最为合适 可以延伸至 300bp 2 引物长度一般在 17 25 碱基之间 上下游引物不能相差太大 3 G C 含量在 40 60 之间 45 55 最佳 4 TM 值在 58 68 度之间 上下游引物的 TM 值不能相差太大 5 碱基要随机分布 尽量均匀 3 端不可修饰 而且要避开 AT GC rich 的区域 避开 T C 或 A G 连续结构 2 3 个 引物自身不能有连续 4 个碱基的互补 引物之间不能有连续 4 个碱基的互补 引物末端碱基为 G 或 C 6 引物设计避免 DNA 污染 最好跨外显子接头区 6 7 一般可设计 2 3 对引物可供选择 预实验选出最佳引物 8 引物特意性验证 用 blast 操作步骤见附件中的教程 3 6 Q PCR 反应反应 两步法反应如下 SYBR Premix Ex Taq 2 10 0ul PCR Forward primer 10uM 0 4ul PCR Reverse primer 10uM 0 4ul ROX Referene Dye 50 x 0 4ul DNA 模板 2 0ul DEPC ddH2O 6 8ul 20ul 体系 95 30 秒 95 5 秒 60 30 秒 n 40Cycles 3 7 数据分析数据分析 定量结束后 设置阈值和基线 得出Ct值 Ct值是热循环仪检测到反应体系 中荧光信号的强度值 Ct实验组 Ct 目的基因 Ct 管家基因 实验组 Ct 对照组 Ct 目的基因 Ct 管家基因 对照组 Ct Ct实验组 Ct对照组 2 Ct即为两组的差异 4 实验结果的标准实验结果的标准 4 1 RNA 的质量 包括浓度和纯度 的质量 包括浓度和纯度 验证 验证 浓度以 ng ul 为单位 样本组织 的提取浓度 200 细胞提取的浓度 30 纯度一般 A260 A280 在 1 8 2 0 之间为标准 实际实验范围可适当放宽为 1 7 2 1 之间 严格按照提取 RNA 步骤 减少盐离子的影响 4 2 溶解曲线 扩增曲线溶解曲线 扩增曲线 4 2 1 溶解曲线溶解曲线 主要是看是否存在非特异性扩增 如果是单峰 且出峰位置是需要的退火温度 可以确定扩增的产物是单一 特异性的 则该结果可用 图 1 为标准的溶解曲 7 线 如果出现多峰或退火温度不对 则可能是出现引物二聚体或者非特异性 扩增 4 2 2 扩增曲线扩增曲线 图中 x 轴表示 PCR 循环数 y 轴表示扩增反应的荧光值 与反应管 中扩增产物的量有比例关系 扩增曲线显示 2 个阶段 指数增长阶段和 之后出现的非指数平台阶段 在指数增长阶段 每个循环 PCR 产物量大 约增加一倍 然而 随着反应的进行 反应体系组成成分的消耗 其中 的一种或多种成分限制反应 此时 产物增长速度变慢 反应进入平台 期 反应最初 虽然产物是指数增长 但是荧光处于背景水平 检测不 到荧光增加 当累积了足够的扩增产物 可以产生可检测的荧光信号时 这个循环数叫初始循环数 即 CT 曲线拐点清楚 特别是低浓度样本指 数期明显 扩增曲线整体平行性好 基线平而无上扬现象 低浓度样本 扩增曲线指数期明显 各管的扩增曲线平行性好 表明各反应管的扩增 效率相近 图 2 为标准扩增曲线 可疑样本是指曲线在 37 个 Ct 值后 出现上涨且平台趋势不明显或上涨幅度比较低的标本 图 1 溶 解曲线 8 4 2 3 CT 值值 CT 值范围一般在 15 35 这个范围内比较合适 内参基因的 CT 值一般 在 15 20 目的基因的 CT 值在 35 内都是可信的 超过 35 个 CT 那么就算 它没有扩增了 如果 15 之前起峰 那么就是模板浓度太高所引起的 所 有样本做三个平行重复 重复之间的 CT 值正负 0 5 之间可用 5 实验结果的提供形式实验结果的提供形式 5 1 实验报告 一般为实验流程 实验报告 一般为实验流程 实验结果 标准模板可为实验结果 标准模板可为 excel 格式 包含以下几个内容 见提供的模板 格式 包含以下几个内容 见提供的模板 标本对照表 一般同一个客户只有标本编号不同 其他都相同 标本对照表 一般同一个客户只有标本编号不同 其他都相同 序号序号 标本标本 种属种属 标本标本 形式形式 标本标本 来源来源 原始标原始标 本编号本编号 标本标本 数量数量 保存保存 条件条件 检测检测 方法方法 检测指标检测指标 1 2 3 2 样本浓度检测信息样本浓度检测信息 样品编样品编 号号 浓度浓度 ng ul 260 280 A1034 86 1 99 图 2 扩 增曲线 9 B C D 3 引物序列信息引物序列信息 Actb 内参内参ForwardTTCGTTGCCGGTCCACACCCReverseGCTTTGCACATGCCGGAGCC A 指标指标ForwardReverse B 指标指标ForwardReverse 引引 物物 序序 列列C 指标指标ForwardReverse 6 各检测指标各检测指标 Ct 值及值及 Ct 等 包括目的基因和内参 等 包括目的基因和内参 7 扩增曲线和溶解曲线 目的基因和内参 扩增曲线和溶解曲线 目的基因和内参 8 数据分析数据分析 包括 包括 8 1 每组结果分析的柱状图每组结果分析的柱状图 8 2 误差线误差线 8 3 对整个实验结果的初步总结 就是每个组的表达情况 以及与其他组的对整个实验结果的初步总结 就是每个组的表达情况 以及与其他组的 区别 区别 三 三 实验中遇到的常见问题及解决方案实验中遇到的常见问题及解决方案 1 Q RNA 的质量不好 浓度低 纯度不好 A 浓度低可能是提供的样本量少 或者提取过程中有污染导致 RNA 降解 A260 A280 的比值在 1 8 2 0 之间 太低说明有蛋白污染 太高说明核 酸有降解 如果样本量少 可适当减少 TRIZOL 溶液 提取中需要的 EP 管 枪头均确保是无 RNA 酶的 并且操作过程严格按照步骤所写 最好可以在超净台中操作 条件不允许时 也需保证操作台的清洁 操 作人员需带上口罩 2 Q 无 CT 值 信号 出现 A 10 1 反应循环数不够 一般都要在 35 个循环以上 可根据