植物DNA和RNA提取方法

实验一实验一 植物基因组植物基因组 DNA 的提取的提取 一 实验目的一 实验目的 掌握植物总 DNA 的抽提方法和基本原理 学习根据不同的植物和实验要求设计和改 良植物总 DNA 抽提方法 二 实验原理二 实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞 由于植物细胞匀浆含有多种酶类 尤 其是氧化酶类 对 DNA 的抽提产生不利的影响 在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原 剂 如巯基乙醇 以降低这些酶类的活性 在液氮中研磨 材料易于破碎 并减少研磨过程 中各种酶类的作用 十二烷基肌酸钠 sarkosyl 十六烷基三甲基溴化铵 hexadyltrimethyl ammomum bromide 简称为 CTAB 十二烷基硫酸钠 sodium dodecyl sulfate 简称 SDS 等离子型表 面活性剂 能溶解细胞膜和核膜蛋白 使核蛋白解聚 从而使 DNA 得以游离出来 再加 入苯酚和氯仿等有机溶剂 能使蛋白质变性 并使抽提液分相 因核酸 DNA RNA 水溶 性很强 经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质 上清液中加入无水乙醇 使 DNA 沉淀 沉淀 DNA 溶于 TE 溶液中 即得植物总 DNA 溶液 三 实验材料实验材料 水稻幼叶 四 主要试剂配方四 主要试剂配方 2 CTAB 抽提缓冲溶液 CTAB 4g NaCl 16 364 g 1M Tris HCl 20ml PH8 0 0 5M EDTA 8ml 先用 70ml ddH2O 溶解 再定容至 200ml 灭菌 冷却后 0 2 1 2 巯基乙醇 400ul 氯仿 异戊醇 24 1 先加 96ml 氯仿 再加 4ml 异戊醇 摇匀即可 五 实验步骤五 实验步骤 1 DNA 的提取的提取 1 2 CTAB 抽提缓冲液在 65 水浴中预热 2 取少量叶片 约 1g 置于研钵中 用液氮磨至粉状 3 加入 700ul 的 2 CTAB 抽提缓冲液 轻轻搅动 4 将磨碎液分倒入 1 5 ml 的灭菌离心管中 磨碎液的高度约占管的三分之二 5 置于 65 的水浴槽或恒温箱中 每隔 10 min 轻轻摇动 40 min 后取出 6 冷却 2 min 后 加入氯仿 异戊醇 24 1 至满管 剧烈振荡 2 3 min 使两者 混合均匀 7 放入离心机中 10 000 rpm 离心 10 min 与此同时 将 600 l 的异丙醇加入另一 新的灭菌离心管中 8 10 000 rpm 离心 1 min 后 移液器轻轻地吸取上清夜 转入含有异丙醇的离心 管内 将离心管慢慢上下摇动 30 sec 使异丙醇与水层充分混合至能见到 DNA 絮 状物 9 10000 rpm 离心 1 min 后 立即倒掉液体 注意勿将白色 DNA 沉淀倒出 将离 心管倒立于铺开的纸巾上 10 60 sec 后 直立离心管 加入 720 l 的 75 乙醇及 80 l 5 M 的醋酸钠 轻轻转 动 用手指弹管尖 使沉淀与管底的 DNA 块状物浮游于液体中 11 放置 30 min 使 DNA 块状物的不纯物溶解 12 10000 rpm 离心 1 min 后 倒掉液体 再加入 800 l 75 的乙醇 将 DNA 再洗 30 min 13 10000 rpm 离心 30 sec 后 立即倒掉液体 将离心管倒立于铺开的纸巾上 数 分钟后 直立离心管 干燥 DNA 自然风干或用风筒吹干 14 加入 50 l 0 5 TE 含 RNase 缓冲液 使 DNA 溶解 置于 37 恒温箱约 15 h 使 RNA 消解 15 置于 20 保存 备用 2 DNA 质量检测质量检测 琼脂糖电泳检测 原理和方法见实验二 六六 注意事项注意事项 1 叶片磨得越细越好 2 移液器的使用 3 由于植物细胞中含有大量的 DNA 酶 因此 除在抽提液中加入 EDTA 抑制酶的活 性外 第一步的操作应迅速 以免组织解冻 导致细胞裂解 释放出 DNA 酶 使 DNA 降 解 思考题 思考题 1 本实验中所用到的各试剂的作用是什么 CTAB 氯仿 异丙醇 75 乙醇 EDTA 2 提取基因组 DNA 的方法有哪些 各有何优缺点 实验二实验二 多聚酶链式反应多聚酶链式反应 polymerase chain reaction PCR 基因扩基因扩 增及琼脂糖凝胶电泳检测增及琼脂糖凝胶电泳检测 一 一 实验目的实验目的 通过本实验学习 PCR 反应的基本原理 掌握 PCR 的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电 泳技术 二 二 实验原理实验原理 PCR 用于扩增位于两端已知序列之间的 DNA 区段 即通过引物延伸而进行的重复双 向 DNA 合成 基本原理及过程如下 PCR 循环过程中有三种不同的事件发生 1 模板变性 2 引物退火 3 热 稳定 DNA 聚合酶进行 DNA 合成 1 变性 加热使模板 DNA 在高温下 94 95 变性 双链间的氢键断裂而形成两 条单链 即变性阶段 2 退火 在体系温度降至 37 65 模板 DNA 与引物按碱基配对原则互补结合 使 引物与模板链 3 端结合 形成部分双链 DNA 即退火阶段 3 延伸 体系反应温度升至中温 72 耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板 在引 物的引导下 利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸 dNTP 按 5 到 3 方向复制出互 补 DNA 即引物的延伸阶段 上述 3 步为一个循环 即高温变性 低温退火 中温延伸 3 个阶段 从理论上讲 每 经过一个循环 样本中的 DNA 量应该增加一倍 新形成的链又可成为新一轮循环的模板 经过 25 30 个循环后 DNA 可扩增 106 109倍 典型的 PCR 反应体系由如下组分组成 DNA 模板 反应缓冲液 dNTP MgCl2 两条 合成的 DNA 引物 耐热 DNA Taq 聚合酶 琼脂糖凝胶电泳的原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子 沸水中溶解 45 开始 形成多孔性刚性滤孔 凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA 分子在碱性环境中带负 电荷 在外加电场作用下向正极泳动 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时 有电荷效应与分 子筛效应 不同 DNA 其分子量大小及构型不同 电泳时的泳动率就不同 从而分出不同 的区带 琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA 主要是利用分子筛效应 迁移速度与分子量的对数 值成反比关系 溴化乙锭 EB 为扁平状分子 在紫外照射下发射荧光 EB 可与 DNA 分 子形成 EB DNA 复合物 其发射的荧光强度较游离状态 EB 发射的荧光强度大 10 倍以上 且荧光强度与 DNA 的含量成正比 用肉眼观察 可检测到 5 ng 以上的 DNA 三 实验材料及相关试剂 实验材料及相关试剂 基因组 DNA 基因特异性引物 PCR 扩增相关试剂 等 四 实验步骤四 实验步骤 1 模板 DNA 的抽提 实验一所得的水稻基因组 DNA 2 PCR 操作 在冰上操作 1 PCR 反应混合液的配制 反应体系 25 L 在无菌的 0 2 mL 离心管中按下列操作程 序加样 反应物加样顺序体积 L终浓度 ddH2O1 17 3 n 10 x Buffer 2 2 5 n 1 x 25 mmol L MgCl23 1 5 n 1 5 mmol L 10 mmol L dNTP4 0 5 n 200 mol L 10 M 上游引物 5 1 n 0 4 mol L 10 M 下游引物 6 1 n 0 4 mol L DNA Taq 聚合酶7 0 2 n 1 U 2 将反应混合液混匀 然后每个 PCR 管中分装 24 L 反应混合液 再加 1 L 模板 DNA 最后加 1 滴石蜡油 防止水分蒸发 然后稍离心 3 将 PCR 管放到 PCR 热循环仪中 按下列程序开始循环 94 4 min 预变性 94 30 sec 60 30 sec 72 2 min 72 7 min 35 个循环 4 注意事项 由于 PCR 灵敏度非常高 所以应当采取措施以防反应混合物受痕量 DNA 的污染 a 所有与 PCR 有关的试剂 只作 PCR 实验用 而不挪作它用 b 操作中所用的 PCR 管 离心管 吸管头等都只能一次性使用 c 每加一种反应物 应换新的枪头 3 PCR 产物的检测 琼脂糖浓度 1 2 EB 浓度 5 l 100 ml TBE 1 制胶 以 150 mL 为例 a 称取 1 8 g 琼脂糖 加入 150 ml 的 TBE 缓冲液 pH 8 0 摇匀 用电子天平称 三角瓶的总重量 b 电炉上加热 至琼脂糖完全溶解 然后在天平上加蒸馏水至原重量 c 用凝胶将制胶板两端封好 插入适当的梳子 将溶解的琼脂糖 约 50 倒入 其中 直至厚度为 4 6 mm 如有气泡要把气泡赶出 在室温下冷却凝固 约 30 45 min d 将制胶板置于电泳槽中 小心垂直向上拔出梳子 以保证点样孔完好 2 点样 a 将 2 0 l 溴酚蓝加入到 PCR 产物中 然后稍微离心 b 每孔点样 10 0 l 蓝色样品混合物将沉入点样孔下部 3 电泳 打开电源开关 调节电压至 3 5 V cm 约 100 V 可见到溴酚蓝条带由负极向正极 移动 约 1 小时后即可观察 4 染色 将电泳好的凝胶放入含 EB 的水溶液中 染色 15 20 分钟 5 观察 将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上 戴上防护观察罩 打开紫外灯 可见到橙红色核 酸条带 根据条带粗细 可粗略估计该样品 DNA 的浓度 如同时有已知分子量的标准 DNA 进行电泳 则可通过线性 DNA 条带的相对位置初步估计样品的分子量 6 注意事项 a 煮胶时 胶液的量不应超过三角瓶容量的 1 3 否则易溢出 b 煮好的胶应冷却至 50 左右时再倒 以免制胶板变形 并减少漏胶的机会 c 倒胶注意厚度 4 6 mm 充分凝固后再拔出梳子 以保持齿孔形状完好 也可待 胶稍凝固后 放入 4 冰箱 10 多分钟 以加速胶的凝固 d 加样前赶走点样孔中的气泡 点样时吸管头垂直 切勿碰坏凝胶孔壁 以免使带 型不整齐 e 一般情况下不必每点一个样品都换枪头 吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样 品 凝胶中含有 EB 切勿直接用手接触胶 废弃胶应集中处理 勿乱丢 思考题思考题 1 PCR 反应液中主要成分是哪些 在 PCR 反应过程中各起什么作用 2 为什么在 PCR 反应过程中 使用三个不同的温度变化 3 用 PCR 扩增目的基因 要想得到特异性产物需注意哪些事项 实验三实验三 植物总植物总 RNA 的提取的提取 一 实验目的一 实验目的 通过本实验学习从植物组织中提取 RNA 的方法 二 实验原理二 实验原理 RNA 是一类极易降解的分子 要得到完整的 RNA 必须最大限度地抑制提取过程中内 源性及外源性核糖核酸酶对 RNA 的降解 高浓度强变性剂异硫氰酸胍 可溶解蛋白质 破坏细胞结构 使核蛋白与核酸分离 失活 RNA 酶 所以 RNA 从细胞中释放出来时不被 降解 细胞裂解后 除了 RNA 还有 DNA 蛋白质和细胞碎片 通过酚 氯仿等有机溶 剂处理得到纯化 均一的总 RNA 三 仪器 药品与试剂配方三 仪器 药品与试剂配方 一 仪器 1 低温离心机 2 分光光度计 3 琼脂糖胶电泳系统 用前先用 1 Na OH 溶液浸泡过夜 之后再用 DEPC 水浸泡冲 洗 4 高压灭菌锅 5 研钵 剪刀 一次性手套等 二 药品 1 焦碳酸二乙酯 DEPC 2 吗啉代丙烷磺酸 MOPS 3 异硫氰酸胍 4 醋酸钠 NaAc 5 氯仿 6 苯酚 7 甲醛 8 乙醇 9 乙二胺四乙酸 EDTA 10 琼脂糖 11 异丙醇 三 试剂配方 1 0 1 DEPC 水 0 1 ml DEPC 加入 100 ml 三蒸水中 振摇过夜 再湿热灭菌 2 2 mol L NaAc 0 5 mol L EDTA 4 mol L 异硫氰酸胍 4 mol L LiCl 等均用 DEPC 水 配制 3 5 MOPS 电泳缓冲液 pH 7 0 MOPS 0 1 mol L NaAc 40 mmol L EDTA 5 mmol L 四 实验步骤四 实验步骤 一 总 RNA 的提取 方案一 1 实验前 10 天左右播种水稻种子 在 3 4 叶期 剪取 1 2 g 幼叶 放入研钵 在液氮中 研磨成粉末状 移入 10 mL 离心管 加入 4 mol L 异硫氰酸胍 4 mL 苯酚 3 mL 2 mol L NaAc pH 4 8 0 3 mL 氯仿 0 6 mL 混匀 冰浴放置 30 min 2 4 8000 r min 离心 13 min 3 弃沉淀 取上清至另一干净无菌离心管中 4 加入 2 倍体积无水乙醇 70 0 5 h 5 4 8000 r min 离心 13 min 6 弃上清 在沉淀中加入 1 mL 4 mol L LiCl 使其溶解 7 移入 1 5 mL 离心管中 冰浴 2 h 8 4 13000 r min 离心 15 min 9 弃上清 在沉淀中加入 400 uL DEPC 水 再加入 400 uL 氯仿 混匀 10 4 13000 r min 离心 6 min 11 取上清 并加入 1 10 体积 3 mol L NaAc pH 5 0 2 倍体积无水乙醇 20 放置 30 min 12 4 13000 r min 离心 20 min 13 将沉淀 RNA 用 70 乙醇洗涤 2 次 14 将沉淀 RNA 室温下稍干燥 15 加 30 uL DEPC 水溶解 70 保存 二 总 RNA 的提取 方案二 利用 TRIzol 提取液抽提 RNA 具体步骤如下 1 取幼叶约 250 mg 在液氮中研磨至细粉 转入预冷的 1 5 ml 离心管 2 加入 1 ml TRIZOL 提取液震荡摇匀 3 室温放置 5 min 后 加入 0 5 ml 的氯仿 剧烈摇动离心管 5 min 4 在 8 条件下 12000 rpm 离心 15 min 5 溶液分为两层 下层为酚 氯仿浅红色液层 将上层液体移入干净离心管 加 入 0 5 ml 异丙醇在 15 30 条件下 沉淀 10 min 6 然后在 2 8 条件下 12000 rpm 离心 10 min RNA 沉淀管壁和底部 7 去掉液体部分 加入 1 ml 75 酒精洗 2 次 8 风干后 加入 25 l DEPC 处理过的水溶解 RNA 储藏于 80 冰箱备用 三 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总 RNA 1 配制 1 2 变性琼脂糖凝胶 40 mL 称取 0 48 g 加入 DEPC 水 25 2 mL 5X 电泳缓冲液 4 mL 加热使溶解 稍冷却加入甲 醛 3 4 mL 混匀 室温凝固 0 5 1 h 2 RNA 电泳检测样品制备 RNA2 l 甲醛2 5 l 甲酰胺7 5 l 10 MOPS 2 l RNA Loading Buffer2 l 灭菌的 DEPC 水4 l 混合液轻轻混匀并离心 放于 65 下温育 5 min 后 置于冰上 3 电泳检测 将 1 2 变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中 加 1 MOPS 电泳缓冲液 覆盖凝胶约 1 mm 将 RNA 样品加到凝胶点样孔中 在 5 V cm 条件下电泳 30 min 然后在 EB 中染色 15 20 min 在紫外灯下观察提取的 RNA 的质量 五 注意事项五 注意事项 1 在研磨过程中 利用液氮时刻使组织保持冰冻状态 2 RNA 酶是一类生物活性非常稳定的酶类 除了细胞内源 RNA 酶外 外界环境中均 存在 RNA 酶 所以操作时应戴手套 并注意时刻换新手套 思考题 思考题 1 实验中所用到的各试剂的作用是什么 焦碳酸二乙酯 DEPC 吗啉代丙烷磺酸 MOPS 异硫氰酸胍 醋酸钠 NaAc 氯仿 苯酚 甲醛 乙醇 乙二胺四乙酸 EDTA 异丙醇 动植物组织动植物组织 mRNA 提取实验方法提取实验方法 一 材料一 材料 水稻叶片或小鼠肝组织 二 设备二 设备 研钵 冷冻台式高速离心机 低温冰箱 冷冻真空干燥器 紫外检测仪 电泳仪 电 泳槽 三 试剂三 试剂 1 无 RNA 酶灭菌水 用将高温烘烤的玻璃瓶 180 2 小时 装蒸馏水 然后加入 0 01 的 DEPC 体积 体积 处理过夜后高压灭菌 2 75 乙醇 用 DEPC 处理水配制 75 乙醇 用高温灭菌器皿配制 然后装入高温 烘烤的玻璃瓶中 存放于低温冰箱 3 1 层析柱加样缓冲液 20mmol L Tris Cl pH7 6 0 5mol L NaCl 1mmol L EDTA pH8 0 0 1 SDS 4 洗脱缓冲液 10mmol L Tris Cl pH7 6 1mmol L EDTA pH8 0 0 05 SDS 四 操作步骤四 操作步骤 一 动植物总 RNA 提取 Trizol 法 Trizol 法适用于人类 动物 植物 微生物的组织或培养细菌 样品量从几十毫克至 几克 用 Trizol 法提取的总 RNA 绝无蛋白和 DNA 污染 RNA 可直接用于 Northern 斑点 分析 斑点杂交 Poly A 分离 体外翻译 RNase 封阻分析和分子克隆 1 将组织在液 N 中磨成粉末后 再以 50 100mg 组织加入 1ml Trizol 液研磨 注意样 品总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10 2 研磨液室温放置 5 分钟 然后以每 1mlTrizol 液加入 0 2ml 的比例加入氯仿 盖紧 离心管 用手剧烈摇荡离心管 15 秒 3 取上层水相于一新的离心管 按每 mlTrizol 液加 0 5ml 异丙醇的比例加入异丙醇 室温放置 10 分钟 12000g 离心 10 分钟 4 弃去上清液 按每 ml Trizol 液加入至少 1ml 的比例加入 75 乙醇 涡旋混匀 4 下 7500g 离心 5 分钟 5 小心弃去上清液 然后室温或真空干燥 5 10 分钟 注意不要干燥过分 否则会降 低 RNA 的溶解度 然后将 RNA 溶于水中 必要时可 55 60 水溶 10 分钟 RNA 可进 行 mRNA 分离 或贮存于 70 乙醇并保存于 70 注意注意 1 整个操作要带口罩及一次性手套 并尽可能在低温下操作 2 加氯仿前的匀浆液可在 70 保存一个月以上 RNA 沉淀在 70 乙醇中可在 4 保 存一周 20 保存一年 二 二 mRNA 提取提取 由于 mRNA 末端含有多 poly A 当总 RNA 流径 oligo dT 纤维素时 在高盐缓冲液 作用下 mRNA 被特异的吸附在 oligo dT 纤维素柱上 在低盐浓度或蒸馏水中 mRNA 可 被洗下 经过两次 oligo dT 纤维素柱 可得到较纯的 mRNA 1 用 0 1mol L NaOH 悬浮 0 5 1 0g oligo dT 纤维素 2 将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经 DEPC 处理并经高压灭菌的玻 璃棉的巴斯德吸管中 柱床体积为 0 5 1 0ml 用 3 倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床 3 用 1x 柱层析加样缓冲液冲洗柱床 直到流出液的 pH 值小于 8 0 4 将 一 中提取的 RNA 液于 65 温育 5 分钟后迅速冷却至室温 加入等体积 2x 柱层析缓冲液 上样 立即用灭菌试管收集洗出液 当所有 RNA 溶液进入柱床后 加入 1 倍柱床体积的 1x 层析柱加样溶液 5 测定每一管的 OD260 当洗出液中 OD 为 0 时 加入 2 3 倍柱床体积的灭菌洗脱缓 冲液 以 1 3 至 1 2 柱床体积分管收集洗脱液 6 测定 OD260 合并含有 RNA 的洗脱组分 7 加入 1 10 体积的 3M NaAc pH5 2 2 5 倍体积的冰冷乙醇 混匀 20 30 分 钟 8 4 下 12000g 离心 15 分钟 小心弃去上清液 用 70 乙醇洗 涤沉淀 4 下 12000g 离心 5 分钟 9 小心弃去上清液 沉淀空气干燥 10 分钟 或真空干燥 10 分钟 10 用少量水溶解 RNA 液 即可用于 cDNA 合成 或保存在 70 乙醇中并贮存于 70 注意注意 1 mRNA 在 70 乙醇中 70 可保存一年以上 2 oligo dT 纤维素柱用后可用 0 3mol l NaOH 洗净 然后用层析柱加样缓冲液平衡 并加入 0 02 叠氮钠 NaN3 冰箱保存 重复使用 每次用前需用 NaOH 水层析柱加样缓 冲液依次淋洗柱床 RNARNA 提取流程提取流程 RNA total RNA 和信使 RNA mRNA 的抽提 RNA 的提取 RNA 和无 RNA 酶的环境 原核生物能产生功能上截然不同的三种 RNA 信使 RNA mRNA 核糖体 RNA rRNA 转运 RNA tRNA 而真核生物则能产生四种 还有一种为真核生物所持有 的小 RNA mRNA 是由基因转录而来的 它运送编码蛋白所需的信息 由于 mRNA 代 表了基因表达的水平 因此 mRNA 的分离 定量和检测极为重要 应用 RNA 对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍 RNA 存在于从简单 的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中 由于当前没有一种方法能 够直接扩增 RNA 因此 RNA 的分离通常是决定实验结果质量的第一步 也是关键 的一步 提取 RNA 过程中防止 RNA 酶的污染所采取的步骤 RNA 分离的实用方法既有简单直接的方法 如分离 rRNA 和 tRNA 也有困难和涉 及复杂步骤的方法 如分离 mRNA 在无细胞体系中克隆基因的体外转录非常有 用 它可以产生足量的同源 RNA 分子用作探针或模板以识别和测定表达基因的量 或 用于 RNA 的生化研究 处理 RNA 样品时必需仔细小心 其程度取决于样品的用途 和来源 由于 RNA 酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏 固 此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要 对于制备 mRNA 来说这些 预防措施尤其重要 方案 工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好 特别是那些用于细菌接种 培 养基和试剂配制的区域 那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行 DNA 的 制备和操作 通常认为这些区域富含 RNA 酶 如有可能 使用标有 无 RNA 酶 的商品试管 吸头 溶液和水 通常新的无菌处理 过的塑料试管和吸管无 RNA 酶 3 双蒸水 ddH2O 和溶液应该用 RNA 酶的抑制剂 DEPC 焦碳酸二乙酯 进行处理 每 100mL 溶液或水中加入 0 1mL DEPC 原液 放在摇床上充分混匀并在 37 下作 用数小时 然后将溶液高压灭菌 15min 使 DEPC 失活 4 用分子级的试剂和 DEPC 处理过的水配制的溶液通常没有 RNA 酶 5 分离 RNA 以前 将一些实验室玻璃制品置于烤箱在 300 烘烤 4h 以灭活核 酶 如有可能 将其他设备也灭菌处理 从组织中提取 RNA 则要注意 动物器官的解剖器械 存放组织块的玻璃器皿 冻存组织块所用的器皿 组织器官的冲洗液 人汗含有 RNA 酶 故在所有步骤中均应戴手套并经常更换 记住我们的周围环境含有大量的微生物和气雾 它们来自吸液操作或来自我们自 己的呼吸 这些可能造成 RNA 酶的污染 一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的 RNA 酶 细菌比哺乳动物细胞中有更 多的 RNA 酶 因此从这些细胞中制备 RNA 应采取更严格的预防措施 分离后的 RNA 通过琼脂糖凝胶电泳再经溴化乙锭染色后便可检查其是否完整 rRNA 18s 和 28s 条带模糊可能表明由 RNA 酶引起的 RNA 的降解 一步法分离 RNA 应用 从组织或细胞中分离细胞的总 RNA 从液体样品中分离 RNA TRI REAGENT Tripure 是一种用于 RNA 分离的商品溶液 该法源于 chomc zynski 的 RNA 分离一步法 它更便于使用并且结果更加可靠 对于来源有限的样 品 我们推荐使用这种试剂 这种试剂能从同一样品中同时分离 RNA DNA 蛋白 质 方案 用 l mL Tripure 50 100mg 组织 匀浆组织样品 对于细胞 每 10cm2 面积 贴 壁的单层细胞 或每 106 个细胞 细胞沉淀 使用 1mL 将样品转至 1 5mLEP 管中 70 可保存 1 月 室温下放置样品 5min 每 1mL Tripure 中加入 0 2mL 氯仿并摇动 15s 置于室温 下 2 15min 4 下 12000g 离心 15min 将水相 上部 转至一个新 EP 管 每 1mL Tripure 加入 0 5mL 异丙醇沉淀 RNA 将 样品置于室温下 5 10min 4 12000g 离心 10min 凝胶样沉淀物为 RNA 吸出上清并用 1mL 75 乙醇在涡旋振荡器上洗涤 RNA 沉淀一次 4 7500g 离心 5min 晾干 RNA 沉淀 然后用无 RNA 酶的水 甲酰胺或 0 5X 的 SDS 溶液溶解沉淀 RNA 的检测 将样品稀释液于三处波长处读取 OD 值 记录 OD 值 通过计算确定 RNA 浓度或纯度 公式如下 对于 ssDNA ssDNA 33 OD260 一 OD310 稀释倍数 对于 dsDNA dsDNA 50 OD260 OD 310 稀释倍数 对于 ssRNA ssRNA 40 OD260 一 OD310 稀释倍数 以上浓度单位为 ug mL 注意事项 1 OD310 值是背景 若盐浓度较高 OD310 值也高 2 OD260 OD280 对 DNA 而言其值大约为 1 8 高于 1 8 有 RNA 污染 低于 1 8 则 有蛋白质污染 3 OD260 OD280 对 RNA 而言其值大约为 2 0 小结 所有可能与 RNA 接触的器材均得用 DEPC 处理 操作过程中应带口罩 手套 DEPC 有致癌之可能 尽量避免接触皮肤 提取的 RNA 应尽早逆转录成 cDNA 逆转录聚合酶链式反应 RT PCR RT PCR 间接用来扩增从 RNA 分子今得到的一段特异序列 RNA 首先被逆转录为 cDNA 用位于一段特异序列或者一个基因两侧的引物生成以 cDNA 为摸板的 PCR 产物成为一个标准的 PCR 反应 得到阳性产物说明存在着特异的