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陶慧卿 基因分析技术简介 在生物 医学 农牧业领域的应用 测序的应用 基因组DNA测序cDNA测序未知序列测序已知序列再测序 双脱氧链终止法的原理 Sanger双脱氧链终止法的最大特点是引入了双脱氧核苷三磷酸 2 3 ddNTP 作为链终止剂 ddNTP可以在DNA聚合酶的作用下和多核苷酸链的3 羟基形成磷酸二酯键 但却不能再与下一个核苷酸缩合 结果使得多核苷酸链的延伸终止 双脱氧链终止法测序的主要步骤 扩增待测DNA片段 使其变性 获得单链DNA模板 选择一条与DNA单链互补的短链引物 将引物用放射性同位素标记 引物先同单链模板复性 在四个反应管中分别加入待测DNA单链模板 互补引物分子 四种的dNTP DNA聚合酶 Klenow酶 以及不同的ddNTP进行聚合反应 双脱氧链终止法测序与PCR的区别 测序只用一条引物 PCR需要两条引物 测序产物线性增长 PCR产物指数增长 测序需要dNTP和ddNTP PCR只用dNTP 测序产物是一系列长度相差一个碱基的片段 PCR产物只有一条带 1 商品化测序试剂盒 荧光染料标记ABIPRISMBigDyev3 1和v1 1试剂盒2 自动化测序仪ABIPRISM310 3100和3730全自动遗传分析仪 双脱氧链终止法的发展 BigDyev3 1试剂盒的反应体系及条件 反应体系 单链DNA模板引物DNA聚合酶Mg2 4种dNTP dATP dGTP dCTP和dTTP 4种不同的荧光标记的ddNTP ddATP ddGTP ddCTP和ddTTP 循环条件 96 1min 96 10s 50 5s 60 4min 25个循环 4 保温 ABIPrism310GeneticAnalyzer SeeTechnologysectionformoreinformationonCE 电进样及电泳 荧光激发和检测 影响测序质量的因素 测序成功的前提 PCR本身是成功的PCR产物一定要经过纯化后再测序测序引物比PCR引物靠后一些 Nestedprimers 在测序反应过程中反应体积不要有波动 蒸发 选择合适的测序产物纯化方法 SNP筛查 单核苷酸多态 SNP 是基因组中最为丰富的遗传多态 是决定个体差异的最主要的遗传基础 多态形式主要包括单碱基替代 插入或缺失 一般也包括微小片断插入 缺失 由于很多SNP位点本身就是功能多态位点 使得SNP在疾病易感基因的相关性研究中有着广泛的应用 SNaPshot MultiplexSystem SNaPshot试剂盒的反应体系及条件 反应体系 单链DNA模板引物DNA聚合酶Mg2 4种不同的荧光标记的ddNTP 循环条件 96 10sec 50 5sec 60 30sec 25循环 4 保温 方法特点 分型准确 该技术也称小测序技术 其准确度仅亚于直接测序 多位点同时检测 可以同时检测达12个位点 而Taqman一次仅能检测一个 不受样本量的限制 而Taqman对少量样本不适合 注意事项 1 同一反应管中 不同位点的引物长度必须不同 最好能相差4 6个碱基 2 引物与模板互补部分 有效引物 的Tm值至少要50 3 为了改变引物的长度 区分不同的位点 可以在引物的5 端加poly dT poly dA poly dC 或者poly dGACT 尾巴 这四种尾巴理论上不容易形成二级结构 并且都经过实验验证 小心 poly dT 有可能与真核基因3 端的poly dA 尾巴互补 4 在引物设计的时候 如果 链DNA的序列不理想 难以设计出最佳引物 请使用 链DNA设计引物 微卫星多态 STR 分析 微卫卫星多态位点是一种短核苷酸串连重复多态 shorttandomrepeat STR 重复单元通常为2 5bp 由于这种重复序列在DNA复制过程中不稳定 所以突变很高 从而导致这种标记位点的多态性很强 杂合度很高 正因为这种特点 微卫星多态在遗传分析中有着广泛的应用 荧光 引物 荧光 PCR产物 荧光激发与检测识别记录 结果 PCR 电泳 数据处理 STR分析实验原理及步骤 肿瘤和正常