互补引物模板评价毕加酵母表达丙型肝炎病毒RNA依赖RNA聚合酶

互补引物模板评价毕加酵母表达丙型肝炎病毒互补引物模板评价毕加酵母表达丙型肝炎病毒RNARNA依赖依赖RNARNA 聚合酶聚合酶 互补引物 模板评价毕加酵母表达的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合 酶魏来1 陈红松1 陈勇2 封波2 丛旭1 王宇1 1 北京大学人民医院 北京大学肝病研究所 北京100044 2 徐州医学院附属医院 徐州 摘 要 构建含有感染性克隆HCV非结构基因5b区序列的酵母表达质粒 转 化毕加酵母 获得持续 可溶性HCVRNA依赖的RNA聚合酶 R Rp 的表 达 纯化蛋白在SDS PAGE及Western bIot中显示出特异性的64 2kD HCVR Rp蛋白带 同聚引物 模板测定显示R Rp的活性极低 延长反应 时间 RNA聚合活性仅轻度升高 采用合成的杂聚互补引物 模板 未发现核苷酸在毕加酵母表达的R R p作用下掺入模板 随时间延长 杂聚互补引物 模板降解 关键词 丙型肝炎病毒 RNA依赖的RNA聚合酶 互补引物 模板 R373 2 1 O786 A 1000 8721 xx 01 0029 05 xx 05 15 修回日期 xx 11 01基金项目 教育部留学回国人员科研启动基金 教外司留 2000 367 号 首都二四八工程重大创新工程 生物医药领域 资助项目 955021 2700 国家自然科学基金 30170844 作者简介 魏来 1961 男 博士 教授 研究丙型肝炎 丙型肝炎病毒 HCV 感染后自发性病毒清除率较低 导致80 的急性感 染者慢性化 1 目前最有效的治疗是干扰素 但仅有25 的干扰素治疗者可保持长期 的丙氨酸氨基转移酶 ALT 正常 2 采用与病毒唑联合的治疗方案仅可将持续有效率提高到38 43 3 4 最近将干扰素经过聚乙二醇修饰后应用于丙型肝炎的治疗 可大幅度 提高病毒清除与ALT复常的反应率 但未能解决复发的问题 长期有效 率仅39 45 5 因而 有必要发展特异性的抗HCV治疗 对HCV基因组构成及复制机制的研究表明 具有RNA依赖RNA聚合酶 R Rp 活性的非结构基因5b蛋白与位于非结构基因3 NS3 区N端的蛋白 酶 位于NS3区C端的螺旋酶等都有可能成为有效 特异抗病毒治疗 的靶分子 6 因此开展对HCV R Rp的研究有助于设计和筛选特异性的聚合酶抑制剂 对人类免疫缺陷病毒 H V 的详细的酶学动力学 7 和结构的研究 8 为了解H V逆转录酶的功能 核苷类与非核苷类类似物抑制剂作用 机制提供了基础 这就是很好的范例 而表达具有酶活性的HCV R Rp 是研究其酶学动力学与结构的基本条件 迄今为止 各研究小组所采用的HCV R Rp无非真核细胞或大肠杆菌系统 均获得显著的研究成绩 6 我们也正在进行具有野生起点的HCVR Rp表达 9 本研究则尝试以毕加酵母 Pichiapastoris P pastoris 表达HCV R Rp 酵母为低等真核生物 其表达的蛋白具有简单的糖基化 在丙型肝炎的研究中 曾以酵母表达C100 3开创了HCV抗体检查的纪元 然而 尚未见以酵母表达用于酶活性研 究的HCV R Rp 蛋白酶 螺旋酶 鉴于研究RNA聚合活性所需的R Rp的首要条件 是表达系统中无核酸 酶的污染 或能在纯化的过程中有效地去除表达系统中的核酸酶 本研究采用互补引物 模板验证毕加酵母表达的HCV R Rp的RNA聚合活性 以及纯化过程去除核酸酶的能力 材料与方法1质粒 菌株及酵母表达系统试剂酵母表达质粒pGAPZB 酵母菌株X 33 大肠杆菌T P10F为 nvitrogen产品 含有全长HCV基因序列的感染性质粒pCV J4L6S 由美国国立卫生研究院Bukh博士惠赠 2工具酶与试剂限制性内切酶BsmB Not Aur Deep Vent聚合酶均为New EngIan BioIabs产品 T4DNA连接酶为Gibco产品 NTA为Oiagen产品 抗HCVNS5b单克隆抗体为Santa Craz产品 蛋白纯化用O Sepharose ECL化学发光Western bIot试剂盒 15聚脱氧胸苷 T15 多聚腺苷 poIy rA 467 均为Ame rsham Phar macia产品 32PUTP及 32PATP为NEN产品 RNA互补引物 模板由Dharmacon合成 3HCV RdRp表达质粒的构建与转化设计上游引物5 第18卷第1期xx年3月病毒学报CH NESE J URNAL F V R L GYVoI 18No 1MarchxxGCGCGTCTCAGCATGGCGTCAATGTCCTATACGT GG 3 下划线为BsmB I酶切位点 下游引物5 GCGTCTA GATTACTAATGGTGGTGATGGTGGTGTCGGTTGGGGA GCAGGTAAATGC 3 下划线为Xba I酶切位点 以pCV J4L6S为模板扩增HCV RdRp序列 限制性内切酶消化后重组入pGAP ZB 大肠杆菌TOPl0F 获得扩增后做限制性酶切长度多态性分析以及 序列分析鉴定 Aur H使其线性化后电转化入酵母X 33 表达质粒构建以及与酵母的同源重组示意图见图l 图l HCV RdRp重组表达质粒的构建以及与酵母基因同源性重组示意图Figure lStrategy ofconstruction of HCV RdRpexpres sion vectorand itsrebination andintegrationin Pichia4HCV RdRp的表达与纯化确认HCV RdRp持续表达后 大量培养 离心获取酵母 French Press裂解菌体后 裂解液于4 30000r min35min 取上清液经SDS PAGE电泳证实其可溶性后 依次经硫酸胺沉淀 Ni NTA 柱纯化 5酵母表达的HCV RdRp的鉴定表达产物经SDS PAGE电泳 并以Western bIot鉴定其特异性 6酵母表达的HCV RdRp活性的测定参见我们已建立的RdRp活性测定方法 l0 简言之 在含有终浓度5mmoI L MgCI 2 60 moI L ZnCI 2 0 2 Ci G 32P UTP 500 moI LUTP 0 2 moI L poIy rA 0 04 moI L dTl5的50 I反应体系中 pH7 5 加入纯化的RdRp 30 反应不同时间 加入EDTA终止反应 点膜后液闪测定同位素活性 7互补引物 模板观察其R 聚合活性以及核酸酶污染情况图2为互补 引物 模板作用示意图 互补引物 模板为人为设计的l0聚核糖核苷酸 其3 端的6个核糖核苷 酸可自身互补 从而互相成为引物 同时又互相成为模板 在RNA聚合 酶作用下 由l0聚延伸至ll l 2 l 3 l4聚 以Y 32P ATP标记互补引物 模板 90 变性后缓慢降温 使其退火 在含有终浓 度5mmoI L MgCI 2 60 moI L ZnCI 2 500 moI L ATP l moI L互补引物 模板的反应体系中 pH7 5 加入纯化的RdRp 启动反应 30 反应不同时间 加入EDTA终止反应 20 变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳观察其合成延伸结果 图2互补引物 模板作用示意图Figure2SymmetricaI primer tempIate结果1HCV RdRp在毕加酵母中持续表达 可溶性检测及纯化将感染性克隆中HCV RdRp基因扩增重组入毕加酵母表达质粒pGAP ZB后 电转化pGAP ZB入毕加酵母 小量培养证实其获得持续表达能力 转为大量培养 因为pGAP ZB为非分泌性表达质粒 离心收集持续表达的酵母 裂解后 低温离心 获得纯清化上清 做SDS PAGE电泳 在64 2kD处可见一表达的蛋白条带 表明为可溶性表达 经硫酸胺沉淀 Ni NTA金属螯和层析柱 sepharose纯化 可达90 纯 图3 图3HCV RdRp在毕加酵母中的表达与纯化Figure3Expression andpurification ofHCV RdRpin P pastorisl MoIecuIar massmarker in kiIodaIton 2 Uninduced ceIIs 3 Lysate 4 CIarified Iysate 5 40 ammonium suIfatepeIIet 6 EIu tion fractionfrom sepharose 2毕加酵母表达HCV RdRp特异性的测定以Western bIot鉴定所表达蛋白的特异性 结果显示为特异性表达产物 图4 3毕加酵母表达HCV RdRp的R 聚合酶活性留取纯化过程中每一阶段的相对纯化产物 根 据 G 32P UTP在dTl5导引下掺入poIy rA 的互补反应 测定其HCV聚合酶的 活性 结果见表l 03 病毒学报l8卷图4毕加酵母表达HCV RdRp的蛋白印迹试验Figure4Western bIot anaIysis ofHCV RdRp expressed inP pastoris using anti HCV NS5bl MoIecuIar massmarker in kiIodaIton 2 HCV NS5b controI 3 Lysate 4 CIarified Iysate 5 EIution fractionfrom O sepharose 6 PGAP ZB controI 由表l可见 在反应5min的条件下 自酵母裂解经纯化的各个 阶段 同位素掺入并没有增加 与对照相比 其活性更是有显著差异 延长反应时间 并测定不同反应时相同位素掺入量 其活性仅有轻度 上升 图5 表明不能测出该毕加酵母表达的HCVRdRp的RNA聚合酶活性 表1毕加酵母表达的HCV RdRp的RNA聚合活性TabIe lActivities ofHCV RdRpdetermined byusing ho mopoIymeric primer tempIate dupIexesPurificationstepsConcentration g mI ncorporation cpm Lysate3 760395 0CIarified Iysate3 650368 040 ammonium suIfatepeIIet33 450350 0Ni NTA eIution9l0320 0O sepharose pooIl80356 0HCV RdRpcontroI l4 005 0 ncorporation of 32P UTP into the reaction 图5毕加酵母表达的HCV RdRp聚合RNA的时间曲线Figure5Kiics ofnucIeotide incorporationby HCVRdRpwith dTl5 rA4674互补引物 模板评价HCV RdRp的活性以另一单股正链RNA病毒 脊髓灰质炎病毒的RdRp 3DpoI 为对照 以互补引物 模板进一步分析 毕加酵母表达的HCV RdRp 结果见图6 由图6可见 毕加酵母表达的HCV RdRp反应体系中 在反应lmin 2min 3min等时间点 可见明显的l0 聚核苷酸条带 自反应5min时间点开始 l0聚核苷酸条带的密度逐渐降低 从l0min时 间点开始 即可在单个核苷酸位点见到逐渐增强的密度影 至60min时 l0聚核苷酸的密度已明显降低 而单个核苷酸的密度显著增强 提示 毕加酵母表达的HCV RdRp未能使l0聚的互补引物模板延伸 相反 随反应时间延长使互补 引物模板逐渐降解 与此形成对比的是 在3DpoI反应体系中 在反应lmin时间点即可见l4 聚核苷酸的条带 且随着反应时间的延长 l0聚的互补引物 模板明显 减少 多在聚合后转化为l4聚 l5聚的条带 图6毕加酵母表达的HCVRdRp对互补引物 模板的降解作用及与脊髓灰 质炎病毒RdRp 3DpoI 聚合互补引物 模板延伸作用的比较Figure6De gradation ofsymmetricaI primer tempIate byHCVRdRpexpressedin P pastoris and parison withpoIymerization cataIyzedby3D poI讨论互补合成引物由Cameron设计 为人工合成的 l3 l期魏来等 互补引物 模板评价毕加酵母表达的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合 酶10个寡核苷酸 可自我互补 互为引物 模板的杂聚RNA分子 其3 端的6个寡核苷酸互补后形成双链体 该双链体带有两个4个核苷 酸的5 端突出端 每一个突出端都可以作为模板 来观察单个或多个 循环中核苷酸的掺入 Cameron以该模型来研究广谱抗病毒药物利巴韦林的作用 11 发现 利巴韦林可与胞嘧啶配对 掺入互补引物模板中 且并不影响后续的 核苷酸掺入与链的延伸 认为利巴韦林的掺入是由于单股正链RNA病毒的RGRp缺乏校读功能 而掺入后导致RNA的突变 笔者曾以该模型观察FCV RGRp催化下核苷酸掺入的动力学 未发表资料 这些都是该模型用于RGRp聚合作用的研究 在我们获得HCV RGRp在毕加酵母中的持续表达后 采用多聚模板未能测得其RNA聚合 酶活性 延长反应时间所提高的聚合效率极为有限 故而以互补引物 模板评价在聚合反应起始时相核苷酸的掺入 结果 发现 在毕加酵母表达的HCVRGRp体系中并不能获得任何核苷酸的掺 入与链的延伸 相反 随着反应时间的延长 互补引物 模板逐渐降解 提示 在纯化过程中未能去除表达体系中的核酸酶 更重要的是 表明了互补引物模板在评价核酸酶污染中的作用 显示 其另一个方面的作用 在研究HCV的过程中 曾以酵母表达系统获得重组HCV蛋白 用于检测 抗HCV抗体 但在研究HCV各种蛋白的非免疫学功能中 鲜见以酵母来 表达蛋白 在对HCV RGRp的研究中 所有的研究报告均采用大肠杆菌表达的RGRp 或昆虫 细胞表达的RGRp 因为酵母表达系统能对重组表达蛋白作简单的糖基化修饰 所以与大 肠杆菌表达系统相比有其独到的优势 又因为其表达水平的缘故 也 有优于真核表达系统的优点 同时鉴于毕加酵母已用于多种病毒蛋白的表达 我们以毕加酵母表达 HCV RGRp 虽然获得持续表达 且表达蛋白具有可溶性 纯化后达90 以上 纯度 但仍未能去除核酸酶的污染 提示 该表达系统可能不适合核酸聚合酶的表达 参考文献 1 Di BiscegIieA M Hepatitis C J Lancet 1998 351 3511 355 2 Lai MY Kao JH Yang PM et aI Long term efficacyof ribavirinpIusinterferon aIfain thetreatment ofchronic hepatitis C J as troenteroIogy 1996 111 1307 1312 3 McHutchison J orGon SC Schiff ER nterferon aIfa 2b aIoneorin binationwith ribavirinas initiaItreatment forchronic hep atitisC J Hepatitis nterventionaI Therapy roup N EngIJ MeG 1998 339 21 1485 1492 4 PoynarG T MarceIIin P Lee SS et aI RanGomiseG triaIof interferonaIpha2b pIusribavirin for48weeks orfor24weeks versusinterferonaIpha2b pIuspIacebo for48weeks fortreatment ofchronic infectionwithhepatitis Cvirus J nternationaI Hepatitis nterventionaITherapy roup Lancet 1998 352 9138 1 426 1432 5 Zeuzem S Feinman V Rasenack J et aI Peginterferon AIfa 2a inpatientswith chronichepatitis C J N EngIJ MeG 2000 343 23 1666 1672 6 De FrancescoR NeGGermann P Tomei L et aI BiochemicaI anGim munoIogic propertiesof thenonstructuraI proteinsof thehepatitis Cvirus impIications forGeveIopment ofantiviraI agentsanG vaines J Seminars inLiver Disease 2000 20 1 69 83 7 Feng JY AnGerson KS Mechanistic stuGiesfor paringthe in corporation of anG isomers of3TCTP byH V 1reversetranscriptase J Biochemistry 1999 38 1 55 63 8 Huang H Chopra R VerGine L et aI Protein nucIeotiGe structureof acovaIentIy trappeGcataIytic pIexofH V 1reverse tran scriptase impIications forGrug resistance J Science 1998 282 5394 1669 1675 9 魏来 具有野生起点的丙型肝炎病毒RNA依赖的RNA聚合酶表 达质粒的构建 J 徐州医学院学报 1999 19 4 259 262 10 Wei L Huhn JS Mory A et aI Proteinase poIymerase precursorasthe activeform offeIine caIicivirusRNA GepenGent RNApoIy merase J J ViroI xx 75 3 1211 1219 11 Crotty S Maag D ArnoIG JJ et aI The roaG spectrum antiviraIribonucIeosiGeribavirin isan RNAvirus mutagen J NatureMeGicine 2000 6 12 1375 1379 23 病毒学报18卷Evaluation onHepatitis CVirus RNADependent RNAPolymerase ExpressedinPichia pastorisusingaSymmetrical Primer Template SubstrateWEILai1 CHEN Hong song1 CHEN Yong2 FENG Bo2 CONG Xu1 WANG Yu1 1 Hepatology I