发酵工艺学课件.ppt

发酵工艺学第一篇发酵机制及发酵控制 第一章绪论一 发酵工程发展史1 传统发酵技术 自然发酵外国 公元前4000 3000年 古埃及人酿造酒 醋 公元前2000年 古希腊人和古罗马人酿葡萄酒 公元前三世纪 古巴比伦人用谷物酿啤酒中国 距今4200 4000年前 龙山文化时期即有酒器出现 公元前1000多年前有酒 醋等的甲骨文文字记载传统自然发酵的主要产品有 酒 白酒 黄酒 清酒 果酒 啤酒等 醋 酱油 泡菜 奶酒 干酪 腐乳 纳豆等 2 纯培养技术的建立 第一个转折期奠基人 安东尼 列文虎克 巴斯德 柯赫等本时期产品 酵母 酒精 丙酮 有机酸 酶制剂等 主要为厌氧发酵和表面固体发酵的初级代谢产物 3 深层培养技术的建立 第二个转折期1928年英国细菌学家弗莱明发现点青霉可产抑制葡萄球菌的青霉素 1945年大规模生产 采用深层培养技术 链霉素 氯霉素 金霉素 土霉素 四环素等出现其他发酵产品也相继出现本时期产品 抗生素类 氨基酸类 酶制剂类 重要的近代微生物技术产品产业化年代18世纪前酒 醋 酱 啤酒 面包 奶酪 人痘接种 蒸馏酒精1880 1920乳酸面包酵母甘油丙酮丁醇淀粉酶转化酶1920 1940柠檬酸葡萄糖酸蛋白酶核黄素山梨糖1940 1950青霉素短杆菌肽链霉素金霉素新霉素两性霉素衣康酸纤维素酶果胶酶淀粉酶1950 1960谷氨酸赖氨酸土霉素四环素新生霉素红霉素制霉菌素卡那霉素丝环氨酸庆黄霉素曲酸柠檬酸葡萄糖酸过氧化氢酶甾体氧化产物赤霉素葡聚糖等1960 1970糖化酶氨基酰化酶脂肪酶乳糖酶头孢霉素林可霉素利副霉素万古霉素核糖霉素杀稻瘟菌素甾体氧化产物核苷酸生物杀虫剂黄原胶石油发酵污水处理单细胞蛋白1970 1980博来霉素阿霉素杀念珠菌素交沙霉素有效霉素苏氨酸门冬氨酸凝乳酶Vc木糖醇苹果酸长链二元酸1980 阿维霉素苯丙氨酸环氧乙烷丙烯酰氨酶抑制剂聚羟基丁酸酯 4 人工诱变育种 基因工程菌 第三个转折期 核苷酸 有机酸及部分抗生素用诱变育种的方法使产量大幅度提高 构建的基因工程菌可产生菌体本身不能产生的产物 如胰岛素 生长激素 细胞因子及多种单克隆抗体等 或使产量大幅度提高 5 发酵动力学 发酵的连续化自动化工程技术的建立 二 发酵工艺的应用1 在食品工业中的应用 食品加工 单细胞蛋白 假单胞菌 假丝酵母 曲霉 地霉 螺旋藻等 含醇饮料 以糖类及淀粉类物质为原料生产的各种酒类 发酵乳制品 奶酒 乳酪 酸乳 调味品和发酵食品 味精 肌苷酸 鸟苷酸 酱 醋 腐乳 饴糖 泡菜等 甜味剂 葡萄糖 果葡糖浆 甘露糖醇等 食品添加剂 酵母 赖氨酸 柠檬酸 色素 葡萄糖氧化酶 Vc 乳链菌肽 防腐剂 匹马霉素 食品保护剂 2 在医药卫生中的应用 1 抗生素 抗细菌抗生素 头孢菌素 氯霉素 红霉素 螺旋霉素等 抗真菌抗生素 两性霉素B 杀假丝菌素 制霉菌素等 抗原虫抗生素 烟古霉素 古曲霉素 抗肿瘤抗生素 放线菌素 博来菌素 丝裂菌素 内瘤菌素 光神霉素等 起免疫抑制作用的抗生素 环孢菌素A等 2 氨基酸 3 维生素 VB2 VB12 VC VA的前体 4 甾体激素 可的松 泼尼松 肤轻松 确氨舒松等 5 生物制品 各种疫苗 类毒素等 6 治疗用酶 蛋白酶 核酸酶 尿激酶 SOD等 7 酶抑制剂 8 其他 核酸类药物如 肌苷 辅酶A AMP ATP FAD3 在轻工业中的应用各种糖酶 蛋白酶 果胶酶 脂肪酶等4 在农工业中的应用微生物杀虫剂 病毒杀虫剂 细菌杀虫剂 真菌杀虫剂 动物杀虫剂防治植物病害微生物 如细菌 放线菌 真菌及杀稻瘟菌春日霉素 庆丰霉素等 生物除草剂 生物增产剂 食用菌和药用真菌5 在环保中的应用6 在冶金及石油开采中的应用三 主要参考书1 微生物工程工艺原理 姚汝华编2 微生物工程 曹军卫 马辉文编3 酿造酒工艺学 顾国贤编4 酒精发酵工艺学 姚汝华编5 啤酒工艺实用技术 德WolfgangKunze著6 酒精工业手册7 啤酒工业手册8 生物工艺学 俞俊棠编 第二章菌种筛选及选育第一节活性物质产生菌的筛选筛选步骤 样品采集样品预处理增殖培养菌种初筛菌种复筛性能鉴定传代稳定性实验菌株终选一 样品采集土壤 分布广泛 特别是一些极端环境 另外 生物物质的种类不同 地点应不同水体中 江 河 湖 海其他 动物 植物等 二 样品预处理放线菌材料的预处理方法方法处理方式材料分离菌株加热 55 6min水 土壤 粪肥小单孢菌100 1h 40 2 6h水 根土链霉菌 小双孢菌物理法马杜拉菌属膜过滤法水小单孢菌 内孢高温放线菌离心法海水 污泥链霉菌属空气搅拌法发霉的稻草嗜热放线菌含1 几丁质培养基土壤链霉菌属化学法用CaCO3提高pH培养土壤链霉菌属涂石蜡棒置碳源培养基中土壤诺卡氏菌诱饵法花粉土壤游动放线菌蛇皮土壤小瓶菌属 三 菌种的分离 一 选择性压力分离法选择性压力分离法 利用不同微生物生长繁殖对环境及营养的要求不同 如 温度 pH 渗透压 氧气 碳源 氮源及其他特殊条件 使其利于某类或某种微生物的生长而不利于其他种类微生物的生存 以使目的菌占优势而得以分离出来的方法 1 分离不同微生物采用不同的培养基或培养条件用于选择性分离放线菌的几种培养基培养基占优势的菌株含胶态几丁质 矿物盐链霉菌属 微单孢菌属基质减半的营养琼脂培养基嗜热放线菌葡萄糖 天冬酰胺 马杜拉放线菌 小双孢菌含 2 分离不同产物的微生物采用不同的培养基分离各种酶类 分离固氮菌3 恒化式富集培养技术 基质浓度对A B两种不同菌生长速率的影响 二 随机分离法随机分离法 某些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处 常随机地分离所需菌种 选择准则 1 制备系列培养基 其中有各类型的养分成为生长限制因素2 避免使用易同化的C 葡萄糖 或N NH4 它们易引起分解代谢物阻遏3 确定含有所需的辅因子 一些金属离子 4 加入缓冲液减少pH的变化 1 抗生素产生菌的分离方法有 抑菌圈法 稀释法 扩散法 生物自显影法等2 抗肿瘤药物产生菌的分离1 利用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物生化诱导分析法2 利用DNA修复能力突变株进行抗肿瘤药物筛选3 酶抑制剂产生菌的分离筛选原理 如果某种化合物能在体外抑制某种关键的人体酶 它就可能在体内产生药理作用 一般选择与生理和病理关系明确的酶为靶酶进行筛选 4 抗病毒药物产生菌的分离利用作用于核酸法 如用鸡胚线维芽细胞的噬菌斑形成法 用小平板测定由病毒引起的细胞变性效果检测病毒复制中特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶抑制剂5 生长因子产生菌的分离如氨基酸和核酸产生菌6 多糖产生菌的分离 第二节菌种选育一 自然选育 方法 将菌种制菌悬液 稀释后分离得单菌落 测其生产能力 选育高水平菌种 特点 简单易行 可纯化菌种 防止退化 稳定产量 偶而可提高产量 效率低 二 诱变育种 一 原理 二 诱变育种的基本方法 1 步骤出发菌株菌种纯化制备斜面孢子或菌悬液活菌计数活菌计数性能初测诱变处理平板涂布初筛复筛传代稳定性实验放大试验菌种保藏并用于生产2 诱变育种要点 1 出发菌株选择依据 1 选用来自于生产的自发突变菌株 2 选有利于进一步研究的菌株 3 选用几次诱变处理均能提高产量的菌株 4 选用形态发生变异以后的菌株等 致死率确定 性能精测 2 诱变方法的选择 可采用单一的物理 化学诱变因素处理 两种或两种以上的诱变剂先后处理 或者同时使用 或者一种诱变剂重复使用 诱变过程 以紫外线诱变为例 开灯预热20min 使光波稳定 加5mL菌悬液于 6cm培养皿距灯30cm处照射无光下置几代时间涂布培养注意问题 a波长 257 3nm 紫外线灯的功率固定为15W 灯与处理物之间的距离也固定在30cm b处理后的菌悬液增殖培养期间 可用黑纸包住盛有处理菌液的玻璃器皿 剂量的选择从过去的99 99 9 降至70 80 甚至更低 在搅拌下 无可见光有红光 3 其它诱变方法a氮芥使用方法 配制活化剂和解毒剂 称取碳酸氢钠68mg加入蒸馏水10mL 即为活化剂 称取碳酸氢钠136mg 甘氨酸120mg 溶解在200mL蒸馏水中 即为解毒剂 将这两种溶液高压灭菌备用 将一只小瓶和橡皮塞灭菌 烘干 称取约10mg的氮芥盐酸放人瓶中 再加入灭菌蒸馏水2mL 则成为每毫升含有5mg的氮芥盐酸盐溶液 吸取1mL孢子悬浮液 浓度为200万孢子 mL 于另一灭过菌的小瓶中 加入0 6mL缓冲液 再加入0 4mL上述氮芥溶液 将橡皮塞盖紧 摇匀 此时瓶中的氮芥作用浓度为每毫升1mg 加入氮芥溶液30s后开始计算时间 达到所需要的时间后 用1mL注射器吸取0 1mL处理液加到9 9mL的解毒剂中 使氮芥作用停止 bN 甲基N 硝基 N 亚硝基胍 NTG 通常在浓度为300 g mL 温度为28 时间为60min的条件下进行处理 容易得到高产菌株 c航天育种所谓航天育种即利用空间环境高真空 微重力和强辐射的特点 在宇宙封线辐射的作用下 使生物的遗传性状发生变异 从而选育出优良菌种 利用返地卫星或高主气球搭载植物种子进行航天育种 三 抗噬菌体菌株的选育 一 抗噬菌体菌株的选育1 方法 自然突变 以噬菌体为筛子不加任何附加条件培养 频率低 诱发突变 先诱变再与高浓度噬菌体混合培养 2 抗噬菌体菌株的特性试验 稳定性试验 真正抗性与溶源性的区别试验 二 噬菌体的防治1 正确判断2 普及噬菌体的防治知识3 选育抗噬菌体菌株4 消灭噬菌体5 收集和保存噬菌体 四 杂交育种 一 细菌的杂交育种1 杂交方式 细菌接合 F因子转导 R因子转移 转化及转导等 2 选择标记 营养缺陷 抗生素抗性 温度敏感 发酵性能3 方法 将带两个以上不同选择性遗传标记的两个菌株杂交 如 A B 和A B 杂交中会出现A B A B A B 和A B 四种重组类型 采用排斥亲本及A B 只允许A B 生长的培养条件 二 放线菌的杂交育种1 杂交原理 异核现象 接合现象 异核系的形成 a b a一个亲本有完整的染色体组 另一个不完整b两个亲本都有不完整的染色体组 但在不同区域出现缺失 重组体的形成2 杂交方法 1 混合培养法 亲本 亲本 混合菌丝 异核体 亲本分离子 部分合子 异核系 重组体 a 选择性平板法 所使用的两亲株必须是互补的营养缺陷型 将用来进行重组的两亲株混合 接种到丰富的完全培养基斜面上 若其中一株产生孢子慢时 可多接一些 孢子形成后制成单孢子悬浮液 然后在选择性培养基平板上进行分离 长出的菌落即为各种类型的重组体 b 异核系分析法 将混合培养后所制得的单孢子悬浮液 分离在基本培养基平板上 其中长成的小而丰富的菌落即为异核系 将异核系在分离在完全培养基上 长出的菌落即为分离子 2 平板杂交法 方法 将菌落培养在非选择培养基上 当菌落形成孢子以后 用影印培养法将菌落印至已铺有试验菌孢子 107 109孢子 mL 的完全培养基平板上 再培养至孢子形成 然后把这上面的孢子影印到一系列选择性培养基上 便于各种重组体子代的生长 特点 优点是能迅速地进行大量杂交 尤其是确定大量菌落与一个共同试验菌配对时的致育力更为方便 平板杂交法适用于迅速研究大量表型相似菌株的遗传 一般一个培养皿可以排列20个菌株与一株配对菌株杂交 3 玻璃纸转移法 具备条件 1 直接亲本必须带有两个遗传标记 即一个直接亲本带有一种营养要求和抗药性 如抗链霉素 而另一个直接亲本则为对该药物敏感 如对链霉素敏感 和带有另一种营养缺陷型 2 选择性培养基是带有抗性药物的补充培养基 原理 异核体带有链霉素敏感的等位基因 在含有链霉素的选择性培养基上不能生长 敏感性亲本和抗药性亲本因为营养要求得不到满足也不能在该选择性培养基上生长 而不带链霉素敏感等位基因的两直接亲本的局部结合子则能在该选择性培养基上生长 繁殖成为异核系菌丛 步骤a玻璃纸混合培养 将两直接亲本幼年培养物的孢子混合接种于铺有玻璃纸的完全培养基平板上 培养24h b 混合培养物的转移 当小菌落间刚接触 气生菌丝未长 仅在玻璃纸上发育一层基内菌丝时可转移 一般24h左右 c异核系的分离 在显微镜下 用无菌细针收集异核系小菌点 然后置于完全培养基表面的一滴无菌水中 涂布培养三天 即得分离子菌落 三 霉菌的杂交育种 准性生殖过程 见微生物 霉菌的杂交技术 1 选择直接亲本 原始亲本 用来进行杂交的两个野生型菌株叫原始亲本 直接亲本 原始亲本经诱变得到各种突变型菌株 假设这种菌株是用来作为形成异核体的亲本 就叫直接亲本 遗传标记 营养突变型 抗药性突变型 形态突变型 2 异核体的形成形成方法有 完全培养基液体混合培养法 完全培养基斜面混合培养法 液体有限培养基混合培养法 有限培养基平板异核丛形成法 基本培养基斜面衔接接种法 基本培养基平板穿刺法等 3 双倍体的检出检出方法 用扩大镜观察异核体菌落的表面 若有野生型颜色的斑点和扇面 可用接种针将其孢子挑出 进行分离纯化 即得杂合双倍体 将异核体菌丝打碎 在基本培养基和完全培养基平板上进行分离 经培养长出异核菌落 在个别异核菌落上长出野生型原养性的斑点和扇面 将其挑出进行分离纯化即可 将大量异核体孢子分离于基本培养基平板上 1X10 2X10 孢子 皿 从中长出野生型原养性菌落 将其挑出分离纯化 即得杂合双倍体 4 分离子的检出 将杂合双倍体单孢子分离于完全培养基平板上 培养至菌落成熟 检查大量双倍体菌落 在一些菌落上有突变颜色 隐性标记 的斑点或扇面出现 每个菌落接一个斑点或扇面的孢子于完全培养基斜面上 培养后经过纯化和鉴别得分离子 用选择性培养基筛选分离子 四 酵母的杂交育种1 获得单倍体细胞 单倍体和二倍体可从形态上识别 思考 2 杂交育种交配方式 孢子与孢子交配 单倍体细胞与孢子交配 细胞间交配对于不同的出发菌株 应采用不同的交配方式 最好是采用具有不同遗传标记的细胞进行交配 3 杂交育种实例 卡尔酵母可用糖类产生酒精和二氧化碳 但只能发酵约80 的糖 糖化酵母能发酵糊精 杂交得发酵糊精产酒精的杂种 此杂种生产的啤酒口味欠佳 再与卡尔酵母回交 得到糖转化率90 的杂种再与能利用异麦芽糖的野生酵母杂交 产生糖转化率100 的新杂种 如此多次进行互交和选择 得到将糖充分转化生产 淡 啤酒的杂交酵母 日本研究者将能产生杀伤因子的杀伤酵母与清酒酿造酵母杂交 得到抗野生杀伤菌株侵袭的菌种 并反复回交 培育出一株嗜冷的对杀伤因子免疫的葡萄酒酵母 五 原生质体融合技术1 原生质体融合技术优点 去除了细胞壁的障碍 亲株基因组直接融合 交换实现重组 不需要有已知的遗传系统 即使是相同接合型的真菌细胞也能发生原生质体相互融合 并可对原生质体进行转化和转染 原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换 产生各种基因组合而得到多种类型的重组子 参与融合的亲株数可多至三个 四个 般常规杂交无法达到 重组频率特别高 如放线菌10 2 10 1丝状真菌10 3 10 2 可以和其他育种方法相结合 把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合再组合到一个单株中 可以用温度 药物 紫外线等处理 钝化亲株的一方或双方 然后使之融合 再在再生菌落中筛选重组子 这样往往可以提高筛选效率 2 原生质体融合的一般步骤 钝化的亲株 钝化的亲株 具遗传标记的亲株 具遗传标记的亲株 菌丝培养 菌丝培养 酶解细胞壁 酶解细胞壁 原生质体 原生质体 再生 再生 再生菌落性状测定 再生频率测定 再生频率测定 再生菌落性状测定 诱变 融合 PEG处理 直接选择法 间接选择法 融合子 多次接种均在基本培养基或选择培养基生长菌落 接种完全培养基生长但基本培养基或选择培养基不生长的菌落 杂种性状测定 操作要点1 原生质体制备 革兰氏阳性细菌 枯草杆菌和巨大芽孢杆菌的细胞壁用溶菌酶进行消化 乳链球菌细胞壁需要用溶菌酶和细菌溶菌酶共同消化 黄色短杆菌的原生质体制备是先加青霉素培养1 5h后 再用酶消化 而革兰氏阴性细菌 EDTA加溶菌酶 或甘氨酸 溶菌酶 EDTA 或在含青霉素培养基培养等条件下制备原生质体 链霉菌 在含甘氨酸的培养基中培养后 用溶菌酶消化 酵母菌 接种在巯基乙醇和EDTA的溶液中培养 再用细胞壁溶解酶消化获得 或者用蜗牛酶