三七皂甙对阿霉素所致的小鼠骨髓细胞微核的影响(全)

1 三七皂甙对阿霉素所致的小鼠骨髓细胞微核率的影响三七皂甙对阿霉素所致的小鼠骨髓细胞微核率的影响 常 征 云南师范大学 生命科学院 文山学院 生化系 云南文山 663000 摘要摘要 目的目的 研究三七皂甙对阿霉素诱导的小鼠骨髓细胞微核率的影响 方法方法 将 42 只小鼠随机分成 7 个组 每组 6 只 雌雄各半 阴性对照组 CKn 和阳性对照组 CKp 每天灌胃生理盐水一次 其余 5 组分别以 12 5mg kg 25mg kg 50mg kg 100mg kg 和 200mg kg 的剂量每天灌胃 PNS 一次 所有 7 个 组都连续灌胃 7d 最后一次灌胃后 CKn腹腔注射生理盐水一次 其余各组以 80 LD50的 DXR 剂量分别 腹腔注射一次 给药结束 48h 后取小鼠骨髓进行微核分析 评价三七皂甙对阿霉素诱导的小鼠骨髓细胞 微核率的影响 结果结果 PNS12 5 组的微核率显著高于 CKn组和显著低于其他各给药组和 CKp组 P 0 05 PNS25 组和 PNS50 组的显著高于 CKn组 PNS12 5 组和显著低于 CKp组 P0 05 结论结论 低剂量的 PNS 具有一定的保护染色体不受损伤 的作用 关键词关键词 三七皂甙 阿霉素 小白鼠 腹腔注射 微核率 三七 Panax notoginseng Burk F H Chen 为五加科 Araliaceae 人参属 Panax 多年生草本植物 1 别名参三七 山漆 田七等 主产于云南 广西及四川等地 在植物分类上 与人参 西洋参 花旗参 同 属于五加科人参属 其体细胞染色体数目为 2n 24 核型公式为 K 2n 2x 24 24m 属于 1B 型 全部都 属于中部着丝粒染色体 核型为对称型 2 三七属半阴性多年生的宿根草本植物 是中国特有的名贵中药 材 起源于 2500 万年前第三纪古亚热带山区 由于其对生长环境条件有特殊要求 现仅存于中国西南山 区 据有关文献记载 三七使用历史近 600 年 栽培历史近 500 年 因其自古以来就被公认为具有显著 的活血化瘀 消肿定痛功效而被誉为 金不换 和 南国神草 等 三七主要含有三萜皂甙 三七素 黄酮 挥发油 氨基酸 糖类及各种微量元素等 其中皂苷类是 三七主要生理活性成分 含量高达 12 3 它由三萜皂甙元和糖经糖苷键连接而成的配糖体 它广泛存在 于自然界 尤以双子叶植物中分布最多 迄今 已从三七全株中分离到 20 多种达玛烷型四环三萜皂苷 在 植物中 皂甙的主要功能是防御病原体和害虫 然而 最引人注目的是它们具有抗肿瘤 抗病毒 降低 胆固醇等多种生物活性 有着相当可观的药用商业价值 4 现代化学和药理学研究发现三七皂苷 Panax notoginosides PNS 在耐缺氧 抗衰老 提高机体免疫力等方面的药理作用显著优于人参总皂苷 且 PNS 和 部分单体皂苷在血液系统 心脑血管系统 神经系统 物质代谢以及抗炎 抗肿瘤等方面均有较好活性 5 但在对抗 60Co 射线照射引起的骨髓嗜多染红细胞微核率增加方面作用不显著 6 而三七皂苷 Rg1 对环 磷酰胺诱导的小鼠骨髓细胞微核发生率和对丝裂霉素诱导的小鼠睾丸染色体畸变均有明显的抑制作用 7 而对阿霉素所致的小鼠骨髓细胞微核率的影响方面尚未见报道 阿霉素 Doxorubicin DXR 也叫亚德里亚霉素 属蒽环类药物 它被用作一种高效 广谱的抗肿 瘤药物已有近 40 年的历史 它对乳腺癌 食道癌 霍奇金淋巴瘤 非霍奇金淋巴瘤 骨肉瘤 Kaposi 肉 瘤和软组织肉瘤均有较好的疗效 8 阿霉素具有抑制 DNA 合成的能力 9 还具有引起 DNA 链断裂的潜 能 10 11 阿霉素的细胞毒性作用可能通过各种各样的机制发生 如自由基的形成 10 DNA 的绑定 12 拓扑异构酶 II 的失活 9 13 等等 先前的研究显示 阿霉素能诱导正常细胞和肿瘤细胞发生突变和染色体畸 变 9 14 15 而检测染色体损伤最方便 快速的方法就是小鼠微核试验 微核 micronucleus 简称 MN 也叫卫星核 是真核类生物细胞中的一种异常结构 是染色体畸变 在间期细胞中的一种表现形式 微核往往是各种理化因子 如辐射 化学药剂对分裂细胞作用而产生的 在细胞有丝分裂间期 微核呈圆形或椭圆形 游离于主核之外 大小应在主核 1 3 以下 多数学者认为细 胞通过两种机制产生微核 一是染色体断裂剂导致染色体断裂 产生无着丝粒断片或环 不能进入子细 胞核 被包含在子细胞的胞质内 单独形成一个或几个规则的微核 二是纺锤丝毒性药物能抑制纺锤丝 的形成 破坏染色体和纺锤体的连接 阻止细胞分裂中期纺锤丝将染色体拉至细胞的两端 染色单体行 动滞后 不能进入子细胞的主核 而形成了一组微核 这样形成的微核体积往往略大于一般典型的微核 2 由于微核的产生与染色体和 DNA 损伤有较大关系 故常将微核的检出率作为 DNA 损伤的一种指标 16 微核实验创建于 20 世纪 70 年代中期 17 18 而小鼠微核试验是目前检测化学物质导致染色体损伤方便 快速的方法 是遗传毒理实验常用的细胞遗传学方法之一 19 20 所以目前许多国家 地区 和国际组织都 将其视为评价新药 食品添加剂 农药 化妆品等化合物毒理安全性的必做试验之一 21 22 本实验也就 是采用小鼠骨髓细胞的微核率作为指标来探讨三七皂甙对阿霉素引起的小鼠骨髓细胞微核率的影响 1 材料与方法材料与方法 1 1材料与仪器 1 1 1实验动物 昆明种健康小白鼠 云南实验动物许可证 SCXK 滇2005 0008 购于昆明医学院动物试验中心 1 1 2实验药品 三七总皂甙 七花有限责任公司 文山 产品批号 20031002 注射用盐酸多柔比星 阿霉素 10mg装 深圳万乐药业有限公司生产 产品批号 0808E1 生产日期 20080823 氯化钠注射液 250ml装 昆明南疆制药有限公司生产 产品批号 B081111h1 生产日期 20081111 1 1 3仪器设备 日本奥林巴斯BX51系统荧光显微镜 800型离心机 金坛市大地自动化仪器厂 1 2实验方法 小白鼠 42 只 体重 18 22g 随机分成 7 个组 每组 6 只 雌雄各半 阴性对照组 CKn 和阳性对 照组 CKp 每天灌胃生理盐水一次 其余 5 组分别以 12 5mg kg 25mg kg 50mg kg 100mg kg 和 200mg kg 的剂量每天灌胃 PNS 一次 所有 7 个组都连续灌胃 7d 26 27 最后一次灌胃后 CKn 腹腔注射生 理盐水一次 其余各组以 80 LD50的 DXR 剂量分别腹腔注射一次 注射量为 0 1 0 2ml 10g 体重 23 给 药结束后 48 h 用颈椎脱臼法处死 取样 进行小鼠骨髓细胞微核实验 小鼠骨髓细胞微核实验方法参照了肖福英 16 Makoto Hayashi 21 和汪旭 20 24 25 等的方法 稍加改动 取小鼠股骨 剪去股骨的两端 每条股骨用 1ml 生理盐水冲洗骨髓腔 每只小鼠用一个离心管 将骨髓 冲洗液 1 000 r min 1 离心 5 min 弃大部分上清液 留少许液体 约 0 2ml 轻轻震荡使细胞均匀分散 开来 用毛细吸管在每个载玻片上滴两滴 血常规涂片法涂片 自然干燥 甲醇固定 10 min 晾干 Giemsa 原液用磷酸缓冲液 PH6 8 按 1 20 的比例稀释 染色 20min 自来水轻轻冲去多余染液 充分 晾干 中性树胶封片 在油镜下对每只小鼠骨髓细胞分别计数 1 000 个 再分别统计其微核发生率 计数 细胞要符合以下条件 细胞结构完整 即必须有细胞质和细胞核 且细胞质和细胞核对比明显 细 胞核着色鲜明 均匀且边缘相对光滑 部分被污物或其它细胞组织遮盖的细胞不计数 而如果已经确 认是微核细胞则计数 1 3统计学处理 半致死剂量实验的LD50计算即采用了Bliss法 同时 还进行了Feiller校正 微核实验结果以平均数 标准差 x s 表示 微核实验数据用SPSS11 5统计软件进行方差分析 剂量 反应关系进行直线相关分 析 计算相关系数 2 结果与分析结果与分析 2 1阿霉素对小白鼠经腹腔给药途径的半致死剂量实验 经过预实验一和二得到近似的最大致死剂量 Dm 10 mg kg和最小致死剂量 Dn 80 mg kg 在正式实验 中按1 0 7的比例 6个组的腹腔给药剂量分别为13 4 mg kg 19 2 mg kg 27 4 mg kg 39 2 mg kg 56 mg kg和80 mg kg 给药后 80 mg kg组所有小鼠约3 h即出现中毒症状 中毒的症状包括毛发竖起 蓬松 无光泽 行动迟缓 四肢无力 走路蹒跚 食欲减小 眼睛紧闭 颈部皮松散 血管暂时扩张等现象 除最小剂量 13 4mg kg 外 其他剂量组在7 d内均有数量不等的动物死亡 并且死亡率随着阿霉素浓度的 增加而递增 存活动物在给药7 d后精神 活动 食欲均逐渐恢复正常 通过统计小鼠死亡数量 用bliss 算半数致死量的软件计算 得到此次实验的回归方程y Probit 7 6323 9 043Log D 经Feiller校正后的 小鼠腹腔给药阿霉素的半数致死量为LD50 24 941 mg kg 95 的可信限为21 241 29 271mg kg 5 死亡 率 LD5 的剂量为16 407mg kg 95 死亡率 LD95 的剂量为37 915mg kg 详见表1 表表1 用用 Bliss 法计算腹腔注射半数致死量 法计算腹腔注射半数致死量 LD50 i p calculated by Bliss method 3 剂量 对数剂量 x 动物数 只 死亡数 只 死亡百分 率 实验机率 单位 Y 回归机率 单位 Y CK 1000 00 13 41 12711000 00 2 5601 19 21 283310110 003 71833 9726 27 41 437810880 005 84155 3693 39 21 593310990 006 28176 7758 561 74821010100 8 1766 801 90311010100 9 5774 2 2小鼠腹腔注射阿霉素诱发产生微核的最佳时间剂量效应分析实验 2 2 1不同剂量阿霉素注射后对小鼠骨髓细胞微核率的影响 不同剂量阿霉素注射后小鼠骨髓细胞微核统计结果见表2 通过对剂量与微核发生率的相关性分析 表3 图1 可以看出 阿霉素的腹腔给药剂量与小鼠骨髓细胞的微核发生率有极显著的正相关性 P 0 01 即小鼠骨髓细胞的微核发生率随阿霉素的腹腔给药剂量的增大而极显著的增大 它们表现出 了极显著的剂量 反应关系 而通过对各给药剂量间微核发生率 均数的两两比较 S N K法 表 4 可以看出 所有给药组的微核率都极显著的高于阴性对照组 P 0 01 这说明一次染毒就可造成微 核率的显著上升 同时还可以看出20 LD50组的微核率极显著的高于10 LD50组 P 0 01 40 LD50 组的微核率极显著的高于20 LD50组 P 0 01 只有80 LD50组与40 LD50组的微核率相比较差异不显 著 P 0 05 但从图1中可以看出 虽然差异不显著 但仍保持了上升的趋势 表表2 不同剂量 不同取样时间阿霉素对骨髓微核率的影响不同剂量 不同取样时间阿霉素对骨髓微核率的影响 取样时间 组别 18h24h30h48h72hTotal CK2 17 2 142 33 1 213 00 1 792 83 1 471 83 1 17 2 43 1 55 10 LD505 00 3 524 67 3 337 33 1 863 50 0 843 00 0 89 4 70 2 69 20 LD507 33 2 665 83 1 479 33 2 168 33 1 036 17 1 94 7 40 2 24 40 LD505 17 1 608 83 2 7914 67 3 2015 5 3 0210 33 1 51 10 90 4 54 80 LD5010 00 3 036 50 3 1513 33 4 3219 00 8 0712 00 2 00 12 17 6 00 Total 5 93 3 645 63 3 219 53 5 029 83 7 516 67 4 29 表表3 给药剂量与微核率的相关性分析给药剂量与微核率的相关性分析 MN DOSE Pearson Correlation10 697 Sig 2 tailed 000 MN N150150 Pearson Correlation0 697 1 Sig 2 tailed 0 000 DOSE N150150 Correlation is significant at the 0 01 level 2 tailed 图图1 给药剂量与微核率的折线图给药剂量与微核率的折线图 4 GROUPS 80 LD5040 LD5020 LD5010 LD50CK Mean 14 12 10 8 6 4 2 0 表表4 各给药剂量间微核率 各给药剂量间微核率 均数的两两比较 均数的两两比较 S N K法 法 Student Newman Keulsa b MN Subset DOSEN 1234 CK302 43 10 LD50304 70 20 LD50307 40 40 LD503010 90 80 LD503012 17 Sig 1 0001 0001 0000 084 a Uses Harmonic Mean Sample Size 30 b Alpha 0 01 2 2 2不同取样时间对小鼠骨髓细胞微核率的影响 通过对各取样时间间微核发生率 均数的两两比较 S N K法 表5 可以看出 30h和48h时 取样的微核率显著 P 0 05 甚至是极显著 P 0 01 用P 0 01进行检验结果同样成立 的高于18h 24h和 72h时取样的微核率 而18h与24h与72h取样时 微核率差异不显著 P 0 05 30h与48h取样时 微核 率差异也不显著 P 0 05 但通过图2可以看出 在所有的取样时间里 48h取样时微核率是最高的 48 h后微核率显著下降 阿霉素腹腔注射后随取样时间不同 小鼠骨髓细胞微核率统计结果变化见表2 表表4 各取样时间间微核率 各取样时间间微核率 均数的两两比较 均数的两两比较 S N K法 法 Student Newman Keulsa b MN Subset TIMEN 12 24h305 63 18h305 93 72h306 67 30h309 53 5 48h309 83 Sig 0 3340 681 a Uses Harmonic Mean Sample Size 30 b Alpha 0 05 图图2 取样时间与微核率的折线图取样时间与微核率的折线图 TIME 72h48h30h24h18h Mean 11 10 9 8 7 6 5 2 3三七皂甙对阿霉素所致的小鼠骨髓细胞微核率的影响实验 通过对表2中80 LD50组48h取样的微核率和表5中CKp组的微核率进行两个独立样本的平均数比较T 检验得出 两组数据间不存在显著差异 说明在PNS对DXR引起的小鼠骨髓细胞微核率影响的实验中 阳性对照是成功的 且对微核的判断也是准确的 前后一致的 通过对表5中各组的微核率均数进行两两 比较 表6 可以看出 PNS12 5组的微核率显著高于CKn组和显著低于其他各给药组和CKp组 P 0 05 PNS25组和PNS50组的显著高于CKn组 PNS12 5组和显著低于CKp组 P0 05 但是其值也是比CKp组的小的 说明PNS在低剂量时对DXR所 导致的小鼠骨髓细胞微核率有一定的抑制作用 但不能完全抑制 当剂量增加时 这种抑制作用逐渐减 小乃至最后就消失了 但PNS并不会引起小鼠骨髓细胞微核率的增加 即PNS对小鼠骨髓细胞的染色体至 少是没有损伤的 实验中部分小鼠骨髓细胞微核见图3 图中箭头所示为小鼠骨髓细胞微核 表表5 三七皂甙对阿霉素所致的小鼠骨髓细胞微核率的影响三七皂甙对阿霉素所致的小鼠骨髓细胞微核率的影响 组别小鼠数观察细胞数微核率 CKn660003 83 1 33 CKp6600018 67 1 03 PNS12 5 DXR6600011 50 3 02 PNS25 DXR6600015 50 2 17 PNS50 DXR6600014 50 1 87 PNS100 DXR6600014 00 2 76 PNS200 DXR6600014 33 3 08 Total424200013 19 4 85 表表6 各组间微核率 各组间微核率 均数的两两比较 均数的两两比较 S N K法 法 6 Student Newman Keuls MN Subset for alpha 05 GROUPSN 1234 CKn 63 83 PNS12 5 DXR 611 50 PNS100 DXR 614 0014 00 PNS200 DXR 614 3314 33 PNS50 DXR 614 5014 50 PNS25 DXR 615 50 CKp618 67 Sig 1 0000 1290 6761 000 a Uses Harmonic Mean Sample Size 6 0 图图3 实验中部分小鼠骨髓细胞微核实验中部分小鼠骨髓细胞微核 3 讨论讨论 为了用药安全和实验的顺利进行 本研究探讨了 DXR 对昆明种小白鼠的半致死剂量 通过 bliss 软 件计算 得到此次实验的回归方程 y Probit 7 6323 9 043Log D 经 Feiller 校正后的小鼠腹腔给药阿 霉素的半数致死量为 LD50 24 94 mg kg 95 的可信限为 21 24 29 27mg kg 为了得到较好的 DXR 所致 的小鼠骨髓细胞的微核率 本研究摸索了小鼠腹腔注射阿霉素诱发产生微核率的最佳时间剂量条件 因 为微核率出现峰值的时间因不同化合物而异 波动范围可能在 18 h 72 h 内 大多数化合物诱发的形成的 微核 其检出峰值在给药后的 24 30h 间 72h 后出现峰值的情况很少见 21 而且同一化合物 如果给药 的剂量与途径不同 动物种属不同 微核率峰值出现的时间也不同 28 29 30 因此 合理的选择取样时间和 给药剂量对获得较高的微核率显得尤为重要 在本实验中 小鼠一次染毒 18 h 后 骨髓细胞微核率就明 显升高 直到 48h 时出现峰值 当然 30h 与 48h 时的微核率差异不显著 P 0 05 这与付小锁 31 许重洁 32 33 的阿霉素两次染毒得到的小鼠骨髓细胞微核率出现峰值的时间是一致的 这提示了我们 要 获得理想的腹腔注射阿霉素诱导的小鼠骨髓细胞微核率的峰值 无须进行二次染毒 一次染毒即可得到 这不仅可以节约一定的实验经费 同时也可以节约一定的时间和精力 另外 本实验同样也得出了与付 小锁 31 许重洁 32 33 相同的剂量 反应关系的结果 即小鼠骨髓细胞的微核发生率随阿霉素的腹腔给药剂 量的增大而极显著的增大 并对它进行了线性相关分析 得到了相关性极显著 P 0 01 的结果 本研究 得到的理想的腹腔注射阿霉素诱导的小鼠骨髓细胞微核率峰值的条件为 一次染毒 剂量在 10 LD50即 2 5mg kg 至 80 LD50即 20mg kg 的范围内越大微核率越高 取样时间在 30h 至 48h 间微核率最高 在上述条件下 本人对三七皂甙对阿霉素所致的小鼠骨髓细胞微核率的影响进行了研究 结果表明 PNS12 5 组的微核率显著高于 CKn组和显著低于其他各给药组和 CKp组 P 0 05 PNS25 组和 PNS50 组 的显著高于 CKn组 PNS12 5 组和显著低于 CKp组 P0 05 但其值也是比 CKp组的小的 说明 PNS 在低剂量时对 DXR 所导致的小鼠骨 7 髓细胞微核率有一定的抑制作用 但不能完全抑制 当剂量增加时 这种抑制作用逐渐减小乃至最后就 消失了 但 PNS 并不会引起小鼠骨髓细胞微核率的增加 即 PNS 对小鼠骨髓细胞的染色体至少是没有损 伤的 这与郑文康 34 的结果是相符的 阿霉素的细胞毒性作用的可能机制有 自由基的形成 10 DNA 的 绑定 12 拓扑异构酶 II 的失活 9 13 等等 而 PNS 具有清除自由基的能力 35 36 37 同时 根据本实验推 测 PNS 也可能具有激活与 DNA 的修复相关的酶的作用和 或 重新激活拓扑异构酶 II 的能力 参考文献 参考文献 1 徐冬英 三七名称及其有文字记载时间的考证 J 广西中医学院学报 2000 年 9 月第 17 卷 第 3 期 2 段承俐 李一果 杨艳琼等 三七的染色体核型分析 J 西南农业学报 2007 年 20 卷 3 期 3 Dong TX Cui XM Song ZH et al Chemical assessment of roots of Panax notoginsengin China regional and seasonal variations in its active constituents J J Agric Food Chem 2003 51 4617 4623 4 姚新生 天然药物化学 M 第三版 北京 人民卫生出版社 2001 289 5 Ye ZG Xue BY Dai BQ et al Comparative 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