白花蛇舌草乙醇提取物对肺腺癌a549-ddp细胞的耐药逆转及其机制

1 / 8白花蛇舌草乙醇提取物对肺腺癌A549/DDP 细胞的耐药逆 转及其机制作者：高宝安， 陈世雄， 邓红艳， 杨俊，黄骥 【摘要】 目的探讨白花蛇舌草乙醇提取物在体外对肺腺癌 A549/DDP 细胞株的耐药逆转作用及对多药耐药相关蛋白表达的影响。方法 MTT 法测定白花蛇舌草乙醇提取物对 A549/DDP 细胞耐药的逆转作用；半定量 RT-PCR 和Western Blot 分别检测肿瘤细胞 MRP mRNA 和蛋白的表达。结果白花蛇舌草乙醇提取物使 A549/DDP 细胞对 DDP 的耐药倍数由下降至；并显著降低 A549/DDP MRP mRNA 和蛋白的表达。结论白花蛇舌草乙醇提取物可以部分逆转肺腺癌A549/DDP 细胞对 DDP 的耐药；其逆转作用可能通过降低细胞 MRP 的表达来实现。 【关键词】 白花蛇舌草乙醇提取物； 人肺腺癌A549/DDP 细胞； 多药耐药相关蛋白支气管肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，早期多无症状，不少患者就诊时已经失去了手术治疗时机，因此治疗多采用化疗为主的综合治疗。铂类药物具有广泛的抗瘤谱，是肺癌化疗方案的一线药物，但随着晚期肺癌患者化疗的开展，铂类药物的获得性耐药问题日益严重，影响了化疗的效果。白花蛇舌草为茜草科耳草属植物，中医以2 / 8全草入药，性寒，味甘淡，归心、肺、肝、大肠经，清热解毒，利尿，主治恶疮肿毒，泻痢等症，临床常用于治疗各类癌症1 。我们前期研究表明2 ，白花蛇舌草乙醇提取物通过促进肺癌 A549 细胞的凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖。为了进一步阐明白花蛇舌草抗肿瘤的作用机制，为其应用于肿瘤临床提供实验依据，我们观察了白花蛇舌草乙醇提取物在体外对人肺癌耐药细胞株 A549/DDP 的耐药逆转作用和对多药耐药相关蛋白 mRNA 和蛋白表达的影响。1 材料白花蛇舌草购于湖北省药材公司。取白花蛇舌草全草 50 g，粉碎研磨，95%乙醇搅拌浸泡 15 d，滤去残渣，水浴至液体全部蒸发干，而后加入 ddH2O 50 ml 溶解，得到生药浓度为 1 g/ml， m 滤膜过滤除菌，4保存，用前用 DMEM 培养基稀释至所需浓度。四甲基氮唑蓝，二甲基亚砜，胰酶均为美国 Sigma 公司产品；顺铂为山东齐鲁医药公司产品；RPMI1640 培养基和 DMEM 培养基为 Gibco 公司产品；鼠抗人 MRP 及 -actin 单抗购自美国 Santa Cruz公司；胎牛血清为杭州四季清生物工程材料公司产品；其余试剂均为国产分析纯。2 方法3 / 8细胞及其培养肺腺癌细胞株 A549 购于武汉大学中国典型培养物保藏中心，肺腺癌耐药细胞株 A549/DDP 由第三军医大学新桥医院全军呼吸病研究所陆俊羽教授惠赠，肿瘤细胞用含 10小牛血清的 DMEM 培养基，在含5CO2，37饱和湿度的培养箱中培养，胰蛋白酶消化传代。为保持 A549/DDP 的耐药性，该细胞培养液含 6 mmol/L 的 DDP，实验前 2 天更换为无 DDP 的 DMEM 培养液。实验用细胞均处于对数生长期。对肺癌 A549/DDP 耐药细胞的耐药逆转作用 A549 和A549/DDP 两株细胞经胰酶消化后计数，调整细胞密度为1105 ml-1，接种于 96 孔板，每孔 100 l。分设 A549组、A549 空白组、A549/DDP 组、A549/DDP 空白组和白花蛇舌草组，白花蛇舌草组为 A549/DDP 细胞加入终浓度为 40 mg/ml 白花蛇舌草乙醇提取物。细胞培养 24 h 后，分别加入终浓度为 10，20，40，80，100，200 mol/L 的 DDP，终体积为 200 ml，每个浓度设 6 复孔，A549 空白组和A549/DDP 空白组则加入等体积的 DMEM，继续培养 72 h 后，每孔加入 5 g/L MTT 10 ml，继续孵育 4h，每孔加入 200 ml 二甲基亚砜终止，振荡 15 min，450 型 ELISA-Reader 酶标仪 570 nm 主波长，630 nm 副波长检测吸光度。以空白对照组细胞活力为 100，按公式计算不同浓度 DDP 对A549、A549/DDP 和加入白花蛇舌草的 A549/DDP 细胞增殖的4 / 8抑制率。公式：细胞抑制率(1实验组吸光度/空白组吸光度)100。采用直线回归法计算 DDP 的半数抑制浓度IC50 值。耐药倍数计算公式：耐药倍数耐药株 IC50 值/敏感株 IC50 值。 对肺癌 A549/DDP 耐药细胞 MRP mRNA 和蛋白质表达的影响半定量 RT-PCR 检测 MRP mRNATRizol 裂解培养的A549 和 A549/DDP 细胞，氯仿抽提，异戊醇沉淀，乙醇洗涤干燥获取总 RNA，逆转录成 cDNA，PCR 扩增出 MRP、内参-actin 基因片段。MRP 引物序列参照文献3：上游5-GTA CAT TAA CAT GAT CTG GTC-3，下游 5-CGT TCA TCA GCT TGA TCC GAT- 3，扩增片段长度 256 bp。反应条件：预变性 945 min 进入循环，94变性 30s，退火30 s，72延伸 60 s，共 38 个循环，最后 72延伸 5 min。内参 -actin 基因引物序列：上游 5-CAC ACG CAG CTC ATT G -3，下游 5-AAG GAC TCC TAC GTT G -3，扩增片段长度 141 bp。反应条件：预变性 94 2 min 进入循环，94变性 30 s，退火 30 s，72 延伸 30 s，共 30个循环，最后 72延伸 5 min。反应完成后取 5l IL-5 PCR 产物，3 l -actin PCR 产物及 2 l 5上样缓冲液，加少量溴乙锭染色，行 2%琼脂糖凝胶电泳。于紫外透5 / 8射仪上观察电泳结果。用图像分析系统分别测每个目的基因及看家基因 -actin 的吸光度值，取目的基因与 -actin 的 A 值比值即相对 A 值。蛋白免疫印迹试验检测 MRP 收集 DDP 浓度为 100 mol/L 的肿瘤细胞，加入细胞裂解液，冰上放置 15 min，12 000 r/min 离心 15 min，取上清，以 Bradford 法作蛋白质定量后置80贮存备用。灌制 10SDS-聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳，转膜，封闭，一抗，4孵育过夜，二抗，室温孵育 2 h，ECL 显色。图像经 Uvp grabit Image软件测定各条带的吸光度，以各条带的吸光度值与 -actin 吸光度值的比值进行细胞间蛋白表达量的比较。统计学分析所有数据均用s 表示，使用统计软件进行 t 检验分析。3 结果 白花蛇舌草乙醇提取物对肺癌 A549/DDP 耐药细胞的耐药逆转作用 MTT 结果见表 1，DDP 对 A549 和 A549/DDP细胞的抑制作用呈浓度依赖性。DDP 对 A549 细胞的 IC50 为 mol/L，对 A549/DDP 细胞的 IC50 为 mol/L，A549/DDP的耐药倍数为。而经过白花蛇舌草乙醇提取物作用后的A549/DDP 细胞 DDP 的 IC50 为 mol/L，耐药倍数为。表 1 不同浓度 DDP 作用 72 h 对 A549 和 A549/DDP 细胞的抑制作用6 / 8白花蛇舌草乙醇提取物对肺癌 A549/DDP 耐药细胞MRP mRNA 表达的影响 A549/DDP 细胞的 MRP mRNA 的表达显著高于 A549 细胞；而白花蛇舌草乙醇提取物则使 A549/DDP细胞 MRP mRNA 的表达明显减少，但仍高于 A549 细胞 MRP mRNA 的表达，如图 1 所示。白花蛇舌草乙醇提取物对肺癌 A549/DDP 耐药细胞MRP 蛋白表达的影响 Western Blot 检测显示，A549/DDP 细胞的 MRP 蛋白表达显著高于 A549 细胞的表达；白花蛇舌草乙醇提取物能够减少 A549/DDP 细胞 MRP 蛋白的表达。结果见图 2。4 讨论 肺癌化疗疗效的降低，主要是肺癌细胞对化疗药物产生耐药性所致，因此积极寻找有效的肺癌化疗耐药逆转的有效方法是肺癌治疗的研究热点。研究表明4，5 ，多种中药如鸦胆子油乳、苦参碱、姜黄素等具有不同程度逆转肿瘤多药耐药的作用。白花蛇舌草是临床广泛使用的抗肿瘤中药之一，现代研究表明68 ，其主要化学成分有熊果酸、免疫多糖、乌索酸、白花蛇舌草素等，这些主要的有效成分具有增强免疫活性、抗氧化和抗肿瘤活性。我们研究结果显示，A549/DDP 细胞对 DDP 的耐药倍数为，白7 / 8花蛇舌草乙醇提取物能够明显降低 A549/DDP 细胞对 DDP 的耐药性，增敏倍数高达倍。 肺癌细胞的多药耐药与 P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白、肺耐药相关蛋白、谷胱甘肽 S 转移酶、拓扑异构酶、细胞膜离子通道等多种因素相关，其中 MRP 在肺癌细胞表达的增强是重要的耐药机制之一。MRP 的主要作用是在消耗ATP 的基础上将细胞内的阳离子或细胞毒性物质逆浓度梯度转运出细胞，降低细胞核内的药物浓度，使药物对 DNA 靶点的绝对浓度降低，并可改变胞浆和细胞器的 pH 值及通过囊泡转运和胞吐作用将药物排出细胞，使药物到达其作用部位的浓度减少、药物活性成分脱离其作用部位和胞内药物浓度降低，从而使细胞产生