第四章 PCR法获取目的基因ppt课件.ppt

第四章PCR法获取目的基因 目录 PCR技术的创建PCR技术的原理PCR的反应体系和条件PCR的类型和应用PCR法定向扩增目的基因 DNA 生命的蓝图 PCR技术 PolymeraseChainReaction多聚酶链式反应 一 PCR技术的创建 KaryB Mullis 1 Khorana等1971年提出在体外经DNA变性 与适当引物杂交 再用DNA聚合酶延伸 克隆DNA的设想 2 1983年 Mullis发明了PCR技术 使Khorana的设想得到实现 3 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶 Taq 引入了PCR技术 4 1988年 第一台PCR仪问世 5 1989年美国 Science 杂志比喻1989年为PCR爆炸年 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖 6 1991年 HoffmanLaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权 KaryB Mullis 1944 http 三篇重要论文TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction ScientificAmerican 1990 262 4 56 61 64 5 Primer directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase Science 1988 239 4839 487 91 SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction MethodsinEnzymology 1987 155 335 50 DNA聚合酶 引物 引物 1977年Sanger的测序技术 1983年Mullis的构思 1983年春夏之交的一个晚上 Mullis开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物去扩增模板DNA的想法 他开车时 感觉两排路灯就是DNA的两条链 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶 面对面地合成DNA 缺点 DNA聚合酶不能耐受高温 每个循环需额外添加DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 水生栖热菌 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶 Taq 引入了PCR技术 二 PCR技术的原理 1PCR原理 在微量离心管中 加入适量的缓冲液 微量的模板DNA 四种脱氧核苷酸 耐热性DNA聚合酶 一对合成DNA的引物 通过高温变性 低温退火和中温延伸三个阶段的循环合成DNA 每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍 一般样品经过30次循环 可使基因的拷贝数达到数百万 1PCR原理 1 类似于DNA的天然复制过程 其特异性依赖于寡核苷酸引物 2 PCR过程 由变性 退火 延伸三个基本反应步骤构成 变性 94 左右 使双链DNA模板解离成为单链 复性 55 左右 引物与模板DNA单链互补配对结合 延伸 72 左右 模板 引物结合物 在DNA聚合酶作用下 以dNTP为原料 以靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成新的DNA链 3 重复 变性 退火 延伸 的循环 可获得大量的新DNA链 而且这种新链又可成为下次循环的模板 从而指数级地获得大量DNA产物 数小时内可使目的基因的数量扩增数百万倍 2PCR技术依赖于DNA的变性和复性 DNA的变性 加热或强酸 碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂 双链解离 形成单链DNADNA的复性 退火 解除变性的条件后 变性的单链DNA可以重新结合起来 形成双链 其原有的特性和活性可以恢复 3PCR技术的特点 1 速度快 灵敏度高 经过30轮循环 理论上目的产物的扩增量达230个拷贝 109拷贝 2 特异性 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性 同时尽可能减少非特异性扩增 3 操作简便易行 只需要数小时就可以用电泳法检出1 g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列 4 用途广泛 生命学科 医学工程 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学 三 PCR的反应体系和条件 H2O35 L10 PCR反应缓冲液5 L25mmol LMgCl24 L4种dNTP4 L上游引物 引物 0 5 L下游引物 引物 0 5 L模板DNA 约1ng 0 5 LTaq酶0 5 L 1反应体系 总体积 50 L PCR技术的基本过程 1 模板DNAdNTP引物BufferMg2 预变性 模板DNAdNTP引物BufferMg2 TaqDNA聚合酶 94 5min 2基本程序 PCR技术的基本过程 2 Taq酶模板DNAdNTP引物BufferMg2 循环仪 94 55 72 Taq酶模板DNAdNTP引物BufferMg2 72 5 7min 循环25 35次 PCR技术的基本过程 3 注意事项 EB是强诱变剂并有中等毒性 配制和使用时都应戴手套 并且不要把EB洒到桌面或地面上 凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗 沾染了EB的实验垃圾需专门回收处理 观察DNA离不开紫外透射仪 可是紫外光对DNA分子有切割作用 从胶上回收DNA时 应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯 300 360nm 以减少紫外光切割DNA 每加完一个样品要更换tip头 以防止互相污染 注意上样时要小心操作 避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿 1 PCR反应成分 1 模板 Template DNA模板浓度一般为1 g mL左右 单 双链DNA 线状DNA分子或环状DNA分子均可 DNA模板不能混有蛋白酶 核酸酶 DNA聚合酶抑制剂等 模板的浓度和纯度是影响PCR的重要因素 模板过多可能增加非特异性产物 纯度不高会影响PCR的效率 甚至得不到产物 3PCR反应条件 2 引物 Primer 浓度 0 1 0 5 mol L 浓度过高易导致模板与引物错配 反应特异性下降 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定 引物的好坏往往是PCR成败的关键 引物设计可遵循下列原则 引物长度 约16 30bp 太短会影响引物与模板的配对 四种碱基随机分布 在3 端不存在连续3个G或C 这样易导致错误引发 falsepriming 引物中G C含量 通常为40 60 可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm 4 G C 2 A T 引物3 端 关键碱基 必须与模板完全配对 最好对应密码子的第一或第二位核苷酸 以减少由于密码子摆动产生的不配对 引物内部 尤其在3 端 不存在二级结构 Hairpin 二聚体 Dimer 两引物之间 尤其在3 端 不能互补以防出现引物二聚体 crossdimer 减少产量 两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性 引物5 端 对扩增特异性影响不大 可在引物设计时加上限制酶位点 核糖体结合位点 起始密码子 缺失或插入突变位点以及标记生物素 荧光素 地高辛等 通常应在5 端限制酶位点外再加3 4个保护碱基 引物不产生falsepriming 不与模板结合位点以外的序列互补 避免错误引发PCR扩增 3 5 3 5 限制性内切酶的识别序列 启动子序列定点突变 探针标记 3 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 浓度 0 5 2 5U 50 L体系 所用的酶量可根据DNA 引物及其它因素的变化进行适当的增减 酶量增加使反应特异性下降 酶量过少影响反应产量 TaqDNA聚合酶活性的半衰期 92 5 130min 95 40min 97 5min TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义 74 下 30min 掺入10nmol LdNTP到核酸中所需的酶量 TaqDNA聚合酶的出错率 一般PCR中出错率为1 10 5 每碱基对 在利用PCR克隆和进行序列分析时应注意 类型 TaqDNA聚合酶 普通型 PCR产物末端为A PfuDNA聚合酶 Pyrococcusfuriosus 高保真 出错率为1 10 6 每碱基对PCR产物为平末端 4 反应缓冲液 PCRbuffer 组分 一般含10 50mmol LTris Cl 20 下pH8 3 8 8 50mmol LKCl和适当浓度的Mg2 Tris Cl 在20 时pH为8 3 8 8 但在实际PCR反应中 pH为6 8 7 8 50mmol L的KCl 有利于引物的退火 Buffer中加入5mmol L的二硫苏糖醇 DDT 或100 g mL的牛血清白蛋白 BSA 可稳定酶活性 加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长的DNA片段有利 各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液 5 Mg2 浓度 0 5mmol L 2mmol L Mg2 浓度过低会降低Taq酶活性 Mg2 浓度过高影响反应特异性 对于一种新的PCR反应 可以用0 1 5mmol L的梯度进行Mg2 预备实验 选出最适的浓度 Mg2 的作用 DNA聚合酶的激活剂 可影响酶的活性和真实性 还影响引物退火和解链温度 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等 在PCR反应混合物中 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团 如磷酸基团 EDTA等可能影响Mg2 离子浓度的物质 以保证最适Mg2 浓度 dNTP可与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度下降 影响DNA聚合酶的活性 6 dNTP 4种三磷酸脱氧核苷酸 浓度 20 200 mol L dNTP浓度取决于扩增片段的长度 浓度过高易产生错误碱基的掺入 浓度过低则降低反应产量 理论上4种dNTP各20 mol L 就足以在100 L反应中合成2 6 g的DNA 当dNTP终浓度大于50mmol L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性 四种dNTP浓度应相等 以减少合成中由于某种dNTP不足而导致的掺入错误 dNTP可与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度下降 影响DNA聚合酶的活性 dNTP制备 应用NaOH将dNTP溶液的pH调至7 0 并用分光光度计测定其准确浓度 dNTP原液可配成5 10mmol L并分装 20 贮存 2 循环参数 1 预变性 94 5min 2 变性 94 20s 45s使双链DNA解链为单链 3 退火 温度由引物的解链温度Tm决定 时间 45s左右 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 降低温度可增加反应的灵敏性 4 延伸 一般为72 时间由扩增片段长度决定 5 循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 一般为25 35次 次数过多 导致扩增效率降低 错误掺入率增加 到达平台期 Plateau 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数 6 延伸补齐 72 5min 10min 1不对称PCR目的 扩增产生特异长度的单链DNA 方法 采用两种不同浓度的引物 分别称为限制性引物和非限制性引物 其最佳比例一般是0 01 0 5 M 关键是限制性引物的绝对量 用途 制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究 四 PCR的类型 高浓度引物 低浓度引物 2反向PCR reversePCR 目的 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段 对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增 用途 探索邻接已知DNA片段的序列 用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆 扩增基因文库的插入DNA 建立基因组步移文库 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 3多重PCR 复合PCR 目的 用于检测特定基因序列的存在或缺失 电泳 引物 1 2 3 4 1 2 3 4 DMD 人类肌营养不良基因 A 无外显子8 12 17 19对应条带 说明病人外显子8 19缺失 B 病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半 提示为区域缺失携带者 C 正常人DMD基因外显子的一般扩增形式 多重PCR检测DMD基因缺失 4LP PCR Labelledprimers 目的 利用同位素 荧光素等对 引物进行标记 用以直观地检测目的基因 用途 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分 病毒1病毒2病毒3病毒4 标记引物 观察 PCR产物 5锚定PCR anchoredPCR A PCR PCR技术需了解靶基因片段两测的序列 对于未知序列和具有不同末端序列怎么办 cDNA 末端核酸转移酶 3 GG GG 5 CC CC锚定引物 3 GG GG 5 CC CC 3 GG GG CC CC 锚定PCR首先合成第一链cDNA 然后再添加一同聚物尾 polydG 与同聚物尾配对的3 锚定引物 带有限制性内切位点polydC 一起作PCR扩增 6PCR固相分析法 检测探针信号 可用于基因芯片的制作 7原位PCR 1 原位PCR的概念原位聚合酶链式反应 InStillPCR ISPCR 是由Haase等于1990年首创 它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段 在不破坏细胞的前提下 利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增 可进行细胞内定位 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 2 原位PCR的作用既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交 ISH 但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下 该方法的敏感度就明显下降 而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列 敏感度很高 但却未能与细胞形态学研究相结合 ISPCR则可把这两者结合起来 成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术 利用该法可检测细胞内病毒感染 细胞内基因重排 以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用 在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义 3 操作步骤 细胞或组织固定 细胞经固定和乙醇通透化处理后使得一般PCR试剂 包括引物和Taq酶 能够进入细胞 PCR扩增细胞内目的片段 原位杂交检测扩增产物 A 阳性对照 B 阴性对照 C 原位检测mRNA表达 8反转录PCR RT PCR 逆转录酶 聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 9荧光定量PCR real timePCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针 对PCR产物进行标记跟踪 实时在线监控反应过程 结合相应的软件可以对结果进行分析 计算待测样品的初始模板量 1 荧光定量PCR标记方法内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeacons 分子信标 DualProbes FRET 引物特异性探针Amplifluor Intergen 2 荧光定量实时PCR与普通PCR的比较实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控 能够实时地观察到产物的增加 直观地看到反应的对数期降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合 提高了PCR反应的特异性增加定量的精确性全程监控 准确的算法进行定量结果分析更加快捷方便 无需电泳检测 全新4通道实时荧光定量PCR仪 普通梯度PCR仪 PCR相关的术语和产品层出不穷 T vectorHotStartTaqRT PCRRAPD PCRDDRT PCRLM PCRInversePCRNestedPCRReal timePCRRACEFlowchipPCR TASMultiplexPCRImmunoPCRAsymmetricPCRLP PCRNASBARecombinantPCRAFLPSSCPInsituPCRTaqMan SYBRgreen 五 PCR技术的应用 1基因克隆 2遗传病的诊断 基因缺失 插入或置换等 地中海