人鼻咽癌CD133干细胞的生物学特性及意义

中国组织工程研究 第 16卷 第 6期 2012 02 05出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research February 5 2012 Vol 16 No 6 ISSN 1673 8225 CN 21 1581 R CODEN ZLKHAH 1007 Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery Affiliated Zhujiang Hospital of Southern Medical University Guangzhou Guangdong Province China Wang Hai li Studying for master s degree Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery Affiliated Zhujiang Hospital of Southern Medical University Guangzhou Guangdong Province China wanghaili 12345 Correspondence to Wen Zhong Doctor Professor Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery Affiliated Zhujiang Hospital of Southern Medical University Guangzhou Guangdong Province China wenzhong60 Supported by the Natural Science Foundation of Guangdong Province No S47 Science and Technology Program Project of Guangdong Province No 2008B Received 2011 11 10 Accepted 2011 12 22 人鼻咽癌 CD133 干细胞的生物学特性及意义 王海丽 文 忠 申聪香 钟品能 王军旗 Biological characteristics and significance of CD133 cancer stem cells in human nasopharyngeal carcinoma Wang Hai li Wen Zhong Sheng Cong xiang Zhong Pin neng Wang Jun qi Abstract BACKGROUND Recent studies shows that cancer stem cells exist in cancer cell lines and may be responsible for recurrence and metastasis of tumor There are few reports on the biological characteristics of CD133 cancer stem cells in human nasopharyngeal carcinoma OBJECTIVE To explore the biological characteristics and significance of CD133 cancer stem cells in human nasopharyngeal carcinoma METHODS Expression of the CD133 cells were detected by flow cytometry and purified by magnetic cell sorting from human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE 2 In vitro proliferation and in vivo tumorigenic capacity of the CD133 stem cells were detected by serum free culture CCK 8 plate colony formation test and tumorigenicity experiment in nude mice and which statistically compared with CD133 and control CNE 2 cells to understand the biological characteristics of the CD133 stem cells RESULTS AND CONCLUSION CD133 cells maintained a sphere like growth status in serum free medium in vitro and could form tumor spheres Compared with the CD133 cells the CD133 cells had higher colony formation ability P 0 01 In vivo tumorigenesis ability of the CD133 cells in the nude mice was higher than that of the CD133 cells P 0 05 The results confirmed that CD133 cells can successfully separate and culture in vitro and can generate tumor spheres and have high tumorigenesis ability in the nude mice Wang HL Wen Z Sheng CX Zhong PN Wang JQ Biological characteristics and significance of CD133 cancer stem cells in human nasopharyngeal carcinoma Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu 2012 16 6 1007 1010 摘要 背景 有研究表明肿瘤细胞株中存在肿瘤干细胞 是肿瘤复发 转移的根源 但人 鼻咽癌细胞株 CNE 2中肿瘤干细胞的表 达及生物学特性至今少有报道 目的 观察人鼻咽癌 CD133 干细胞生物学特性及意义 方法 采用流式细胞仪检测人鼻咽癌细胞株 CNE 2中 CD133的表达情况 免疫磁珠分选技术获得人鼻咽癌 CD133 干细胞 分别采用无血清培养法 CCK 8法 平板克隆形成试验及裸鼠体内成瘤实验检测 CD133 干细胞的体外增殖及体内成瘤能 力 并将其与 CD133 及未分选鼻咽癌细胞进行比较 以了解 CD133 干细胞的生物学特性 结果与结论 免疫磁珠富集的 CD133 细胞在无血清培养基中呈悬浮生长 并可以形成肿瘤干细胞球 CD133 细胞与 CD133 细胞比较具有较高的克隆形成能力 P 0 01 CD133 细胞在裸鼠体内的成瘤率高于 CD133 细胞 P 0 05 结果证实 鼻咽癌 CD133 干细胞能在体外分离培养 形成干细胞球 增殖能力强 在裸鼠体内具有极强 的成瘤能力 关键词 鼻咽癌 肿瘤干细胞 增殖 生物学特性 干细胞培养 doi 10 3969 j issn 1673 8225 2012 06 013 王海丽 文忠 申聪香 钟品能 王军旗 人鼻咽癌 CD133 干细胞的生物学特性及意义 J 中国组织工程研究 2012 16 6 1007 1010 http www crter org 0 引言 肿瘤干细胞理论认为 肿瘤中存在肿瘤干 细胞 他们具有自我更新和无限增殖潜能 1 到 目前 已经在白血病 神经胶质瘤和结肠癌等 细胞中发现了肿瘤干细胞 2 4 王静等 5 采用流 式细胞术从鼻咽癌细胞株中分选出侧群细胞 具有较强的增殖活性 实 验 采 用 了 免 疫 磁 珠 分 选 术 分 选 出 CD133 肿瘤干细胞 进一步研究肿瘤干细胞的 生物学特性 1 材料和方法 设计 细胞学体外实验 时间及地点 于 2010 08 2011 05在南方 医科大学珠江医院中心实验室完成 材料 实验动物 BALB c nu裸鼠 8只 4 6周龄 体质量 16 23 g 购自南方医科大学实验动物中 心 动物许可证号 SKXY 粤 2006 0074 实 验中对动物的处理方法符合中华人民共和国科 学技术部颁发的 关于善待实验动物的指导性 王海丽 等 人鼻咽癌 CD133 干细胞的生物学特性及意义 P O Box 1200 Shenyang 1008 www CRTER org 南方 医科大学附 属珠 江医院耳鼻 咽喉头颈外科 广 东省广州市 王海 丽 女 1985年生 汉族 河北省邯郸市人 南方 医科大学在 读硕士 主要从事 鼻咽 癌基础与临 床研究 wanghaili 12345 通讯作者 文忠 博士 教授 南方 医科 大学附属珠 江医 院耳鼻咽喉 头颈外科 广东省 广州市 wenzhong60 中图分类号 R394 2 文献标识码 B 文章编号 1673 8225 01007 04 收稿日期 2011 11 10 修回日期 2011 12 22 WJ G 意见 6 细胞株 人鼻咽癌细胞株 CNE 2由南方医科 大学病理科提供 试剂及仪器 方法 流式细胞技术检测及免疫磁珠技术分选 CNE 2中鼻咽癌 CD133 干细胞 取对数生长的 CNE 2细 胞 消 化 离 心 后 PBS 重 悬 进 行 CD133 2 293C3 PE 标记 按照说明书操作 流式细胞 仪检测细胞 CD133比例 7 取 CNE 2单 细 胞悬液 加入 FcR 阻 断 剂 100 L 加入磁珠 100 L 4 孵育 30 min 用 500 L Buffer湿柱 加入细胞悬液 过磁珠 分选柱收集未标记细胞 用 Buffer 洗柱 收集流 出液 与上述液体混合 将 MS 柱从磁珠分离器 上移开 往柱中加入 1 mL Buffer 用针芯快速将 缓冲液推出 收集液体中含有 CD133 细胞 所 得的 CD133 细胞离心 5 min 1 000 r min 去上 清 收集 CD133 和 CD133 细胞 加入无血清培 养基 37 体积分数 5 CO2饱和温度的培养箱 中培养 8 CCK 8法检测 CD133 干细胞体外增殖能力 将 分选的 CD133 细胞 CD133 细胞以及未分选 的细胞种植于 96孔板内 每孔加入 0 2 mL无血 清培养液 无血清培养液含 DMEM F12 11 20 g L 碱性成纤维细胞生长因子 bFGF 20 g L表皮生长因子 EGF 5 mg L 胰岛素的 无血清培养液 2 000细胞 孔 设空白组用于调 零 置于 37 体积分数 5 CO2饱和温度的 培养箱中培养 每隔 3 d半量换液 1次 在培养 第 1 3 5 7天测定细胞的增殖状态 以 490 nm吸光度 A 值量化活细胞数 每组所得数据取均 值 以时间为横轴 A 值为纵轴 绘制细胞生长 曲线 比较 3组细胞的增殖速度 9 体外成球试验检测 CD133 干细胞体外成球能 力 配制无血清培养基 取分选后的 CD133 细 胞和 CD133 细胞在上述无血清培养液中 置于 37 体积分数 5 CO2饱和温度的培养箱中培 养 每天加入 0 25 mL上述无血清培养液 观察 肿瘤细胞克隆球形成过程 倒置显微镜观察并 摄片 10 体外平板克隆形成实验检测 CD133 干细胞克 隆形成能力 将分选的 CD133 细胞 CD133 细 胞进行细胞计数 以每 200个细胞接种于含 10 mL上述无血清培养液的 6孔板中 每种细胞 3个复孔 置于 37 体积分数 5 CO2饱和温 度的培养箱中培养两三周 当 6孔板中出现肉眼 可见的克隆时终止培养 弃去培养液 用 PBS 小心浸洗 2次 加纯甲醇固定 15 min 弃甲醇后 空气干燥 加适量结晶紫室温固定 15 min 洗 去染料后再显微镜下计数大于 50个细胞的克隆 数 然后计算克隆形成率 实验重复 3次 裸鼠体内成瘤试验检测 CD133 干细胞体内成 瘤能力 将 8只裸鼠分为 CD133 组和 CD133 组 每只裸鼠注入细胞量为 1 105 固定裸鼠 碘伏 消 毒 左 右侧 背部 皮肤 分 别 向 皮下 注 射 CD133 和 CD133 细胞 悬浮于 0 2 mL生理盐 水 12 用碘伏消毒皮肤 移植后饲养于高度洁 净无特殊病原体 speeific pathogen free SPF 无菌净化室内 每周观察 1次 肉眼观察和 触诊 观察 4周后 采 用断 颈法处死 测量肿瘤大小 照 相 处死 后 立即 取出肿瘤 用体积分数 10 甲 醛溶 液固定 脱 水 石蜡包埋 切 片 过 夜 苏木精伊红 染 色确 定病理 类型 12 在 普通 光学 显微镜下观察裸鼠移植瘤组 织 形态 主要观察指标 流式细胞仪检测人鼻咽癌 细胞株 CNE 2中 CD133的表 达情况 无血清培 养 法 检测人鼻咽癌 CD133 干细胞成球 情况 CCK 8法 检测 CD133 干细胞体 外 增殖 情况 平 板克隆形成 试 验检测 CD133 干细胞克隆形成 能力 及裸鼠体内成瘤实验检测 CD133 干细胞 的体内成瘤 能力 统计学分析 计量 资 料以 x s 表 示 采 用 SPSS 13 0统 计学 软件 进行数据分 析 多 组间 比较 采 用单因素重复测量数据的方 差 分 析 组 间均数 差异 的两两比较 采 用 LSD t 法 两 样本 数据 采 用两 独立样本 t 检验 四格 表 资 料 采 用 卡 方检验 P 0 05为 差异 有显 著 性意 义 2 结果 2 1 实验动物数量分析 纳 入大鼠 8只 均进 入结 果 分 析 无 死亡或感 染 无 脱落 2 2 鼻咽癌 CD133 干细胞分离鉴定结果 采 试剂及仪器 来源 DMEM F12培养基 重组人碱性 成纤维生长因 bFGF 表皮生长因子 EGF 胰岛素 Insulin 人 CD133 细胞 分选试剂盒 MACS 磁珠分选柱 CD133 2 293C3 PE Cell Counting Kit 8 CCK 8试剂盒 美国 PeproTech 公司 美国 sigma 公司 德国 Miltenyi Biotec 公司 中国碧云天公司 王海丽 等 人鼻咽癌 CD133 干细胞的生物学特性及意义 ISSN 1673 8225 CN 21 1581 R CODEN ZLKHAH 1009 www CRTER org 用流式细胞 术 检测 了 CNE 2鼻咽癌细胞株中 CD133的表 达 情 况 流 式 分 析 结 果 显 示 细 胞 株 中 恒 定 在 0 2 2 59 见 图 1 2 3 鼻咽癌 CD133 干细胞生物学特性 CD133 肿瘤干细胞球形成 在无血清 条件 下细胞悬浮 生长 培养 10 d后形成肿瘤细胞球体 球体 折 光性 好 大小 不一 从 十几 个细胞 到几十 个细胞 不等 见 图 2 CD133 干细胞体外增殖能力 结 果 表明 CD133 组的 细胞增长 幅 度 最 大 与 CD133 组比较 各 组细胞培养 72 h后 CD133 细胞增长速度大于 CD133 与未分选细 胞 P 0 05 见表 1 细胞的体外克隆形成能力 通 过计算得出 平 均克隆形 成率分别为 CD133 7 33 8 50 和 CD133 细胞 34 66 8 50 CD133 细胞的克隆形成 能力 明显高于 CD133 细胞 P 0 01 见 图 3 CD133 干细胞裸鼠体内成瘤能力 1 105个 CD133 细 胞在接种 4周 之 后 可在 7只裸鼠体内形成移植瘤 而 1 105个 CD133 细胞在裸鼠体内均未成瘤 CD133 细胞 在裸鼠体内的成瘤率高于 CD133 细胞 2 12 44 P 0 05 见 图 4 3 讨论 自 2003年 Sighs 等 1 报道了神经胶质 瘤 CD133标记 a CD133 cells Figure 3 The first generation of CD133 cells after sorting and in vitro clone formation ability of CD133 cells at 3 wk after culture 图 3 分选后第一代 CD133 细胞和 CD133 细胞培养 3周后 体外克隆形成能力 b CD133 cells 王海丽 等 人鼻咽癌 CD133 干细胞的生物学特性及意义 P O Box 1200 Shenyang 1010 www CRTER org 的肿瘤干细胞的分选 已有多位学者对卵巢癌 胃癌与 前列腺癌等肿瘤 12 14 课题组前期研究工作也从鼻咽癌 中发现了肿瘤干细胞 7 随着对肿瘤干细胞的进一步研 究发现 肿瘤干细胞与肿瘤的复发 转移 多药耐药有 关 因此 研究肿瘤干细胞的生物学特性为临床上提高 肿瘤治愈率 降低复发率提供了新思路 CD133被 认 为 是 多 种 肿 瘤 干 细 胞 的 表 面 标 记 物 1 15 16 一小部分肿瘤细胞表达 CD133 本文针对 鼻 咽 癌 CNE 2细 胞 首 先 采 用 了 流 式 细 胞 技 术 检 测 CD133 细胞含量 证明在鼻咽癌细胞株 CNE 2中确实有 0 2 2 59 的细胞表达 CD133抗原 与文献 17 报道一 致 实验结果发现 通过免疫磁珠分选方法可高效分选 出 CD133 细胞 同时还发现细胞的活力 细胞量 细胞 混悬液制备及分选时间的长短均可以影响分选效果 CD133 细胞具有自身独特的生物学特性 有极强的 自我更新及增殖能力 在无血清成球实验中 可形成悬浮 生长的肿瘤干细胞球 实验在无血清的配制方面 与文献 18 报道有所不同 实验未加入 B27因子 可能原因为细 胞株不同对细胞因子的需要不同 3组亚群细胞的生长曲 线结果 平板克隆形成实验结果表明 CD133 细胞的增 殖能力和克隆形成能力高于 CD133 细胞 此结果与以往 文献报道一致 5 7 因此也证明了鼻咽癌细胞群中确实存 在一小部分细胞 特性不同于其他细胞 在肿瘤干细胞的鉴定实验中 裸鼠体内成瘤被认为 是一种更加可靠的方法 在以往的肿瘤干细胞鉴定试验 中 进行了大量体外细胞学实验的验证 而本文的创新 点在于 采用了免疫磁珠分选出 CD133 细胞后 不仅 进行了体外实验 还通过裸鼠体内成瘤实验来鉴定 显 示 CD133 细胞的成瘤性高于 CD133 细胞 证明 CD133 细胞中含有肿瘤干细胞 与体外实验结果一致 这种方 法系统全面且可信度高 CD133是当前肿瘤干细胞筛选的主要手段 实验中 采用了 CD133标记的表面标记物富集肿瘤干细胞 也有 研究通过细胞表面抗原 CD44 19 ABCG2 20 Oct4等筛 选肿瘤干细胞 16 迄今为止仍未发现特异性的肿瘤表面 标记物 目前 对肿瘤干细胞的研究仍在探索阶段 目 前鉴定肿瘤干细胞的基本方法都只是富集了肿瘤干细 胞 并未真正意义上将肿瘤干细胞分离出来 寻找肿瘤 干细胞特异性标记物是进一步研究的方向 致谢 感谢郝卫 温坤 郭勇辉老师和肖法 嫚 博士 在实验技术方面给予的帮助 感谢南方医科大学珠江医 院中心实验室提供的仪器和设备 4 参考文献 1 Singh SK Clarke I D Terasaki M et al Identification of a cancer stem cell in human brain tumors Cancer Res 2003 63 18 5821 5828 2 Bonnet D Dick JE Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell Nat Med 1997 3 7 730 737 3 Deng YW Fang JC Li MC et al Zhongguo Xiandaiyixue Zazhi 2005 15 16 2449 2452 邓永文 方加胜 李茗初 等 胶质瘤中肿瘤干细胞的分离 培养及鉴定 J 中国现代医学杂志 2005 15 16 2449 2452 4 Dallas N A Xia L Fan F et al Chemoresistant colorectal cancer cells the cancer stem cell phenotype and increased sensitivity to insulin like growth factor I receptor inhibition Cancer Res 2009 69 5 1951 1957 5 Wang J Guo LP Chen LZ et al Identification of cancer stem cell like side population cells in human 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