甲醇打孔的免疫荧光方法

甲醇打孔的免疫荧光方法甲醇打孔的免疫荧光方法 重要提示 重要提示 在开始实验前请查阅所用抗体的说明书中第一页应用 应用 APPLICATIONS 部分 确认这支抗体已经验证过可用于你计划采用的本实验方法中的特定方案 A 所需溶液和试剂所需溶液和试剂 注意 用 Milli Q 超纯水或是相当级别的水配制溶液 1 10 X 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 PBS 1 升水中加入 80 g 氯化钠 NaCl 2 g 氯化钾 KCl 14 4 g 磷酸氢二钠 Na2HPO4 and 2 4 g 磷酸二氢钾 KH2PO4 调整 pH 到 7 4 2 甲醛溶液 16 无甲醇的类型 Polysciences Inc cat 18814 现配现用 开封 以后放在 4 C 避光保存 使用时用 PBS 稀释 3 二甲苯 4 无水乙醇 组织学级 100 和 95 5 蒸馏水 dH2O 6 封闭缓冲液 配制 25ml 时 2 5 ml 10X PBS 和 1 25ml 正常血清 来源与二抗相同 例如正常山羊血清 正常驴血清 兑到 21 25ml 的蒸馏水中 混匀 边搅拌边加入 75 L Triton X 100 100 7 抗体稀释缓冲液抗体稀释缓冲液 配置 40ml 时 取 4 ml 10X PBS 兑入 36 ml 蒸馏水 混匀 加入 0 4 BSA 使溶解 边搅拌边加入 120 L Triton X 100 100 8 10 mM 柠檬酸钠缓冲液柠檬酸钠缓冲液 配置 1L 时 称取 2 94g 二水合柠檬酸三钠 C6H5Na3O7 2H2O 溶解在 1L 蒸馏水中 调整 pH 为 6 0 9 1X PBS 高盐高盐 0 4M 高盐高盐 PBS 配置 1L 时 取 100ml 10X PBS 兑入 900 ml 蒸馏水 另加 23 38 g NaCl 使溶解 10 荧光素标记的二抗荧光素标记的二抗 推荐的二抗 注意 第一次使用不论是一抗还是荧光素标记的二抗时 都需要做滴定分析以判断何种稀 释比例能在你的样品上得到最强的特异信号同时背景保持最低 11 Prolong Gold 抗淬灭试剂 Invitrogen Eugene OR Cat P36930 B 切片准备切片准备 I 细胞系培养物来源细胞系培养物来源 IF IC 重要提示 查阅说明书中 APPLICATIONS 部分 确认所用抗体可用于 IF IC 注意 细胞应直接在多孔板 腔室玻片或是盖玻片上直接培养 处理 固定和染色 1 用 PBS 稍加润洗 2 吸去 PBS 将细胞泡在 2 3 mm 厚的 2 4 甲醛溶液 PBS 配制 中 注意 甲醛有毒 需要在通风橱中操作 3 室温下固定细胞 15 分钟 4 吸去固定剂 用 PBS 润洗三次 每次五分钟 5 甲醇打孔步骤甲醇打孔步骤 在甲醛固定后 将细胞浸泡在冰纯甲醇中 加入足量甲醇完全盖住 细胞 液层厚度在 3 5mm 千万别让细胞干掉 20 C 孵育 10 分钟 用 PBS 润洗 5 分钟 6 继续 C 部分的免疫染色 II 石蜡切片石蜡切片 IF P 重要提示 查阅说明书中 APPLICATIONS 部分 确认所用抗体可用于 IF P 脱蜡处理 再水化 1 用二甲苯浸洗切片 3 次 每次 5 分钟 2 用无水乙醇浸洗切片 2 次 每次 10 分钟 3 用 95 乙醇浸洗切片 2 次 每次 10 分钟 4 在蒸馏水中润湿 2 次 每次 5 分钟 抗原暴露 1 室温下 将切片泡在 10 mM 柠檬酸盐缓冲液中 pH 6 0 2 用水浴锅或是微波炉加热泡在柠檬酸盐缓冲液中的玻片使之接近沸腾 保持 95 99 C 约 10 分钟 3 取出玻片 放在实验台上自然冷却 30 分钟 4 在蒸馏水中润洗 3 次 每次 5 分钟 5 在 PBS 中润洗 5 分钟 6 继续 C 部分的免疫染色 III 冰冻切片 IF F 重要提示 查阅说明书中 APPLICATIONS 部分 确认所用抗体可用于 IF F 1 用 PBS 配置的 2 4 甲醛溶液浸泡切片 注意 甲醛有毒 这一步需要在通风橱中进行 2 室温下 固定 15 分钟 3 用 PBS 润洗 3 次 每次 5 分钟 C 免疫染色免疫染色 注意 以下所有的孵育过程 除特殊说明外 需要在室温下的避光湿盒中进行 以免切片 变干和荧光淬灭 1 将样品在封闭液中封闭 60 分钟 2 封闭结束前 按说明书的指示用抗体稀释缓冲液稀释一抗 3 吸去封闭液 加入稀释的一抗 注意 在做双染时 将两种抗体按各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液 4 在 4 C 孵育过夜 5 用 PBS 润洗 3 次 每次 5 分钟 可选 为降低背景 在第 2 次 PBS 润洗和第 3 次 BS 润洗之间可增加高盐 PBS 润洗 2 分钟的 步骤 但也要注意 这一步可能会降低一些抗体的特异信号 注意 如果所用一抗直接标记有 Alexa Fluor 荧光素 则直接跳到 C8 步 6 把荧光素标记的二抗稀释在抗体稀释液中的 将样品与稀释抗体在室温下避光孵育 1 2 小时 注意 在做双染时 将两种二抗体各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液 7 按第 5 步用 PBS 高盐 PBS 润洗切片 8 涂上 Prolong Gold 抗淬灭试剂后盖上玻片 处理多孔板时 抗淬灭试剂盖住细胞细 胞即可 9 在盖玻片的周围涂上指甲油密封 10 立即在显微镜下用相应波长激发光观察样品可以得到最佳的效果 如果要长期保存 将玻片放在 4 C 避光保存 推荐的二抗推荐的二抗 抗兔抗兔 Anti Rabbit IgG H L F ab 2 Fragment Alexa Fluor 488 Conjugate 4412 Anti Rabbit IgG H L F ab 2 Fragment Alexa Fluor 555 Conjugate 4413 Anti Rabbit IgG H L F ab 2 Fragment Alexa Fluor 647 Conjugate 4414 Anti Rabbit IgG H L F ab 2 Fragment DyLight 488 Conjugate 4315 抗小鼠抗小鼠 Anti Mouse IgG H L F ab 2 Fragment Alexa Fluor 488 Conjugate 4408 Anti Mouse IgG H L F ab 2 Fragment Alexa Fluor 555 Conjugate 4409 Anti Mouse IgG H L F ab 2 Fragment Alexa Fluor 647 Conjugate 4410 Anti Mouse IgG H L F ab 2 Fragment DyLight 488 Conjugate 4316