菊粉酶酶源诱变菌株产酶发酵条件的优化

1 / 7菊粉酶酶源诱变菌株产酶发酵条件的优化摘要为提高黑曲霉 A24 诱变菌株产菊粉酶的活力，采用单因子试验方法对该菌株的最佳产酶条件进行了优化。结果表明：该菌株在以 3%菊芋汁为碳源、2%牛肉膏和%2HPO4为复合氮源的培养基中，初始 pH 值，30培养 72h 的条件下，所得的发酵液中酶活力最高，达到/mL，比优化前提高了 18%，表明该菌株有一定的应用潜力。 关键词黑曲霉；菊粉酶；酶活力；发酵条件；优化 传统果糖的生产一般是由淀粉通过葡萄糖的异构化取得，该法工艺复杂、成本较高、果糖含量低。因此，人们一直在寻求一种廉价的新糖源和生产果糖的方法。其中菊粉酶主要催化水解菊粉中的 -2，1 呋喃果糖苷键，由于能在温和条件下水解菊粉产生果糖和少量葡萄糖，只需一步酶解过程，工艺简单，生产成本低，可直接制备超高果葡糖浆，已成为果糖工业化生产的主要酶制剂，为低聚果糖的生产提供了一个很好的解决办法。但来源于植物的菊粉酶底物专一性较强，仅作用于菊粉；由微生物产生的菊粉酶大都能水解含有 -2，1 呋喃果糖苷键的多种糖类，2 / 7如菊糖、蔗糖和棉子糖等1。其中霉菌具有所产菊粉酶的最适温度较高、热稳定性好、适宜偏酸性的环境等特点而倍受关注。由潍坊学院生命科学学院实验室所保存的黑曲霉 A24 诱变菌株是从菊芋根际周围土壤中筛选出的一株产菊粉酶、又经过多轮紫外线诱变获得的菊粉酶产量较高的菌株。该试验在此基础上，对其发酵条件进一步优化，以期获得更高的产菊粉酶活力，为进一步研究菊粉酶的生产以及生产应用提供理论基础。 1 材料与方法 供试材料 黑曲霉 A24 诱变菌株，由潍坊学院生命科学学院实验室保存。菊芋采自潍坊市郊区。菊芋汁参照前人研究方法进行制备2。 发酵培养条件及发酵液的制备 取黑曲霉孢子悬液，接入 50mL 的 YJ2HPO41%，初始pH 值）发酵培养液中，在不同条件下进行发酵培养。 3 / 7不同碳源对产菊粉酶的影响。选择碳源分别为 2%的菊芋汁、菊粉、葡萄糖、果糖、庶糖和乳糖，将黑曲霉 A24诱变菌种接入到不同碳源的培养基中，调节各培养基初始pH 值为，在 30、120r/min 的条件下培养 72h，将各处理的发酵液经 8000r/min 离心 10min 后，收集上清液，分别测定酶活力。并选择出最优碳源，以 1%、2%、3%、4%的添加量研究不同浓度的该最优碳源对产菊粉酶的活力影响。 不同氮源对产菊粉酶的影响。用 3%的菊芋汁作碳源，以不同种类的复合氮源制备的培养基发酵培养 3d 后，测定其发酵液中菊粉酶活力，确定最佳有机氮源；在确定最佳有机氮源为牛肉膏、无机氮源为 2HPO4 的基础上，进行有机氮源和无机氮源最佳配比试验。以牛肉膏和 2HPO4 做复合氮源发酵试验，取质量浓度分别为 1%、2%、3%的牛肉膏和质量浓度分别为%、%、%的 2HPO4 进行复合。调培养基初始 pH 值为，于 30，发酵培养 3d，将各处理的发酵液经8000r/min 离心 10min 后，收集上清液，分别测定酶活力。 培养基初始 pH 值对产菊粉酶的影响。设培养基初始pH 值分别为 3、4、5、6、7，以 3%菊芋汁作碳源，以牛肉膏、2HPO4 为复合氮源，于 30条件进行发酵培养 3d。将各处理的发酵液经 8000r/min 离心 10min 后，收集上清液，4 / 7分别测定酶活力。 发酵温度对产菊粉酶的影响。以 3%菊芋汁为碳源、2%牛肉膏和%2HPO4 为复合氮源、初始 pH 值的发酵培养基，对黑曲霉 A24 诱变菌株分别在 24、26、28、30、32下进行发酵培养 72h，将各处理的发酵液经 8000r/min 离心 10min 后，收集上清液，分别测定酶活力。 发酵时间对产菊粉酶的影响。以 3%菊芋汁为碳源、2%牛肉膏和%2HPO4 为复合氮源，培养基初始 pH 值为，30下分别发酵 24、48、72、96、120h，每隔 24h 取样。将各处理的发酵液经 8000r/min 离心 10min 后，收集上清液，测定酶活力。 发酵液中还原糖含量及菊粉酶的活力测定 采用 3，5-二硝基水杨酸法3测定发酵液中还原糖的含量，在 540nm 波长处测定吸光度值，根据葡萄糖的标准曲线，求得还原糖的含量；酶活力定义为在规定反应条件下每分钟转化底物生成 1mol 还原糖所需的酶量为一个酶活单位，按照 Pessoni 等人报道的研究方法测定菊粉酶5 / 7活力4。 2 结果与分析 不同碳源对产菊粉酶的影响 试验结果表明，以 2%菊芋汁为碳源时酶活力最高，为/mL；菊粉次之，为/mL；葡萄糖、果糖为碳源时酶活力较低，均在/mL 以下。进一步分析不同浓度菊芋汁为碳源对产菊粉酶的影响，发现菊芋汁浓度为 3%时，菊粉酶活力最高，为/mL。 不同氮源对产菊粉酶的影响 研究结果表明，复杂有机氮源比简单无机氮源有利于菊粉酶的产生，且最适有机氮源为牛肉膏，无机氮源为2HPO4，2 种氮源所得到的菊粉酶活力分别为、/mL。由表 1可以看出，复合氮源比单纯有机或无机氮源更有利于菊粉酶的产生，且当牛肉膏和 2HPO4 的质量浓度分别为 2%和%时，菊粉酶活力最高，为/mL。培养基初始 pH 值对产菊粉酶的影响 6 / 7检测不同初始 pH 值对黑曲霉 A24 诱变菌株产菊粉酶的影响，结果如图 1 所示。可以看出，在初始 pH 值为 36的范围内，随着 pH 值升高，菊粉酶酶活增强，pH 值为时产菊粉酶酶活最高，达到/mL。此后随着 pH 值升高，菊粉酶酶活明显下降。 发酵温度对产菊粉酶的影响 试验结果表明，在 2430范围内，随着培养温度升高菊粉酶酶活增强，30时产菊粉酶酶活最高，为/mL。此后，随着温度升高，菊粉酶酶活明显下降，说明菊粉酶对温度比较敏感。因此，30是黑曲霉 A24 诱变菌株产菊粉酶的最适温度。 发酵时间对产菊粉酶的影响 由图 3 可以看出，随发酵时间的增加，黑曲霉 A24诱变菌株产菊粉酶活力增强，在培养 72h 后产菊粉酶酶活最高，为/mL。此后，随着发酵时间延长，菊粉酶酶活有下降趋势。 3 结论与讨论 7 / 7近年来，利用微生物产菊粉酶已有不少报道，包括真菌中的黑曲霉、青霉、马克斯克鲁维酵母以及细菌中的枯草芽孢杆菌和假单孢菌等5，其中黑曲霉由于特性稳定、易于培养而受到格外关注，并被普遍用来发酵生产菊粉酶。王静等6对一株黑曲霉 JNSP5-06 产菊粉酶的发酵条件进行了优化，得到最佳优化条件：2%菊粉，2%酵母膏和%NH2PO4，初始 pH 值，30培养 96h，优化后的最佳产菊粉酶活力达到/mL；唐艳斌等7曾报道黑曲霉菌株 SYS-1 在菊粉 2%、2HPO42%、初始 pH 值、30培养 96h 的发酵条件下产菊粉酶酶活最高，达到/mL。而该试验确定的黑曲霉A24 菌株产菊粉酶的最适发酵条件为：菊芋