氨 基 酸 自 动 分 析 仪 简 介

1 氨 基 酸 自 动 分 析 仪 氨基酸是蛋白质的组成成分 是蛋白质化学研究的主要 内容之一 蛋白质是一切生命物质的基础 因此 探讨和 揭示生命现象的发生 生长 新陈代谢 遗传变异过程 都与氨基酸的研究有关 随着近代物理学 化学和电子学的飞速发展 氨基酸的 分析技术亦在不断更新 氨基酸分析仪是本世纪 50 年代研 制的 仅 40 多年 已发展到现在的进样 分离 检测和数 据处理全部自动化的程度 检出量由微克分子到毫微克分 子 分析时间由原来的 24 小时到现在的半个小时 分析技 术的提高促进了其他科学领域的发展 一 氨基酸自动分析仪的进展 用于氨基酸分析的方法很多 有纸色谱法 柱色谱法 薄层色谱法 电泳法及气相色谱法等 一般认为离子交换 柱色谱法是较为精确的检测方法 氨基酸分析仪就是在此 基础上研制成功的 1951 年 Moor 和 Stein 采用离子交换树 脂色谱 用茚三酮试剂显色和分光光度计检测而设计 后 来在 Spaekman 的协助下 使分析操作自动化 迄今氨基酸 分析仪的条件和自动程度有了很大的改观 其特点主要表 现以下几个方面 树脂粒径减小 近年来制成的小颗粒球状树脂 使氨 基酸分析仪得到很大改进 由于树脂粒径减小就对应地增 2 加等量树脂的总面积 使现在少量树脂达到过去大量树脂 的分离效果 从而减小了树脂柱的内径和体积 节省了试 剂用量 缩短了分析时间 树脂的粒径从 200 20 10 5 m 色谱柱内径缩小 树脂粒径减小使填充树脂床的色谱 柱内径减小 由过去的粗长柱变为微柱 色谱柱内径的变 化为 18 6 2 8 1 75mm 输压泵压力增高 一般氨基酸分析仪采用低压泵 其 施加于输液的压力只有几 9 80665 104Pa 以后增加至几 十 9 80665 104Pa 现在发展到 2068 104Pa 分析时间缩短 由于树脂粒径的改善 色谱柱内径缩 小和泵压增高 使分析时间大大缩短 蛋白质水解液的分 析时间从过去的 24 小时缩短到现在的半个小时左右 仪器灵敏度提高 由于仪器的不断改进 使灵敏度大 为提高 过去仪器的最高灵敏度已远不及现在仪器的最低 灵敏度 现在一般氨基酸分析仪的灵敏度均达到 0 1nmol 试剂用量减少 由于分析时间大大缩短 致使试剂消 耗量大为降低 氨基酸分析的试剂要求纯度很高 且价格 昂贵 试剂用量减少会降低分析费用 试剂流量 每小时茚 三酮试剂的用量 的变化为 70 35 18 3 5ml 样品用量少 由于仪器灵敏度不断提高 同时不少仪 器采用单柱分析法 所以样品用量逐渐减少 从过去一次 3 分析需要样品几 ml 到现在只用 20 l 这对科研中难以收集 和制备的样品以及许多生物样品的微量分析提供了十分有 利的条件 自动化程度提高 由于采用多样品自动注入器 程序 控制和数据处理系统 使仪器从进样到每个氨基酸结果打 印的全过程都自动化 并且当仪器出现故障时又能自动停 机 因此可以自动地进行工作 显色试剂和检测器的改善 显色试剂中除了茚三酮仍 被广泛应用外 荧光试剂受到人们的重视 以前认为很有 发展前途的荧光胺已被邻苯二甲醛所取代 目前用邻苯二 甲醛的荧光计检测器检测的灵敏度比用茚三酮显色后经分 光光度计检测的灵敏度高 100 倍以上 二 氨基酸分析原理 氨基酸的理化特性 氨基酸是无色的结晶物质 氨基酸分子 至少有一个氨 基和一个羧基 在水溶液中呈中性 弱酸性或弱碱性 是 两性电解质 它所带的电荷随介质 pH 而变化 当氨基酸处 于 H 介质中 羧基的解离作用被抑制 整个分子获得一个 质子带正电荷 反之 当它处于 OH 介质中 则从氨基夺走 一个质子 从而整个分子带负电荷 当处于某一 pH 下 两 性离子所带正负电荷数相等时 此时的 pH 值就是该氨基酸 的等电点 整个分子呈电中性 一般氨基酸都能溶于水和 4 其他极性溶剂 而难溶于乙醚 三氯甲烷 苯等非极性溶 剂 由于氨基酸结构不同 等电点亦有差异 氨基酸等电点 是取决于其羧基和氨基的解离常数的相对值 由于羧基的 解离常数大于氨基酸的解离常数 故一般氨基酸的等电点 为弱酸性 由于氨基酸分子中都具有氨基和羧基 因此 它们都能 产生氨基和羧基的一般化学反应 如酯化 甲基化 乙酰 化以及酸碱中和反应等 这里仅就氨基酸分析仪采用的与 茚三酮试剂显色反应加以描述 氨基酸与水合茚三酮共同加热被氧化分解为 CO2 NH3和 比氨基酸少一个碳原子的醛 此时茚三酮被还原 在弱酸 性溶液中 pH 5 还原茚三酮与 NH3及另一个分子茚三酮缩 合成蓝紫色化合物茚二酮炔 茚二酮胺 DYDA 反应式为 由于 DYDA 在 570nm 处有最大吸收峰 所以广泛地用于氨 基酸比色测定 唯脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄 色物质 在 440nm 处有较强的吸收峰 离子交换树脂 离子交换色谱是以液体作为流动相 用离子交换树脂装 在柱内作为固定相 与适当的检测器连接起来的专用液相 色谱法 其基本原理与离子交换色谱相同 各种氨基酸的 5 酸碱性 极性和分子结构不同 常用阳离子交换树脂在色 谱柱上分离 可用不同的 pH 值和离子浓度的缓冲液依次将 它们洗脱 酸性氨基酸先被洗脱下来 其次是中性和碱性 氨基酸 同类型的氨基酸 分子量较小的先洗脱出来 由 于氨基酸不吸收可见光 故洗脱液需与茚三酮反应显色后 才能检测 最后根据检测信号的大小计算各种氨基酸的含 量 离子交换树脂有以下类型 阳 酸性 离子交换树脂 凡是含有酸根的树脂为阳离 子交换树脂 这类树脂又可分为强酸型 中强酸型和弱酸 型三类 强酸型含有磺酸基团 SO3H 中强酸型含有磷酸 根 PO3H2 亚磷酸根 PO2H2 弱酸型含有羧基 COOH 或 酚羟基 OH 以上这些交换树脂在交换时反应机理如下 阴离子交换树脂 阴离子交换树脂都含有氨基 它可 分为强碱型 中碱型和弱碱型三类 如含季胺盐 N CH3 3 为强碱型 叔胺 N CH3 2 仲胺 NHCH3 伯胺类为 弱碱型 既含强碱基团也含弱碱基团的交换树脂是中强碱 型树脂 交换反应如下 强碱型 R N CH3 3OH Cl R N CH3 3Cl OH 弱碱型 R N CH3 2 H2O R N CH3 2H OH R N CH3 2H OH Cl R N CH3 2HCl OH 6 以上所列离子交换树脂含有一个分子的不溶基底物质及 一个活性根 但这些活性根的存在会增加物质的溶解度 一般的方法是在树脂中加入 交联结构 使它成为一个高 分子量的大聚合物 上下左右索扯固定 不能溶解 氨基酸分析仪所用的强酸型阳离子交换树脂是由苯乙烯 及二乙烯苯合成的 其中苯乙烯是主要成分 磺酸根联结 在其上 形成磺化苯乙烯 二乙烯苯是用来做交联结构的 它把直链结构的磺化苯乙烯错综地连贯起来 防止因吸水 溶解而溃散 磺化苯乙烯与二乙烯苯的聚合如图 1 4 1 所 示 使用离子交换树脂应注意交联度 即二乙烯苯占树脂单 体的百分率 交联度大 树脂的结构紧密 空隙度 渗透 性以及溶胀性较小 适应于分子量较小的氨基酸分离 反 之交联度小的树脂 结构疏松 空隙度 渗透性及溶胀性 大 在离子交换中结构不稳 高压的洗脱液会把这种树脂 破坏 氨基酸分析所用的树脂交联度为 8 12 目前 国外各厂商都有自己的树脂 配制方法均属专利 产品 所以树脂的售价昂贵 氨基酸自动分析仪原理 氨基酸分析仪是在离子交换色谱的原理指导下制成的 是一种专门用来分析氨基酸的液相色谱仪 它的结构一般 是由色谱系统 自动加样系统 检测系统 控制系统 数 7 据处理系统组成 如图 1 4 2 所示 流程图的主要部件有 进行氨基酸分离的离子交换树脂色谱柱 分离的各个氨基 酸与茚三酮试剂反应的水浴 100 1 用于检测氨基 酸显色的比色计及记录仪和数据处理系统 输送缓冲液和 茚三酮试剂的恒流泵 缓冲液自动转换阀 自动进样器 保持色谱柱分离温度的恒温水浴 用于氨基酸分析的样品都需用 pH2 2 的缓冲液溶解或配 制 由于 pH2 2 都较各种氨基酸的等电点小 即各氨基酸 都处于 H 浓度很大的酸性溶液中 这样的溶液有利于氨基 酸的氨基 NH2 电离 而不利于羧基 COOH 的电离 因 此 在 pH2 2 的缓冲液中各氨基酸呈 R CH COOH 状态 带正电荷 柱里的磺酸型阳离子交换树脂 R SO3 H 被柠檬 酸钠 生理体液为柠檬酸锂 缓冲液平衡时形成 R SO3 Na 当带正电荷的氨基酸进入色谱柱前端 此时氨基酸浓度处 于最大值 氨基酸与 Na 进行如下交换 由于缓冲液的流动以及氨基酸的吸着 氨基酸在流动相 中的浓度下降 这时氨基酸就会解吸 这种解吸作用使交 换树脂恢复到原来的形式 这样当氨基酸通过离子色谱柱 时 连续地吸着与解吸 加之各种氨基酸彼此性质不同 吸着的程度就有差异 在缓冲液的作用下便形成了分离 当逐渐提高洗脱缓冲液的 pH 值时 氨基酸的正电荷逐渐减 少 与树脂的结合力逐渐减弱 最后从离子色谱柱被洗脱 8 下来 氨基酸的结构不同 与树脂的结合力也有差异 酸性氨 基酸所带的氨基少 正电荷也少 与树脂结合不紧 它容 易被洗脱下来 如天门冬氨酸 是第一个洗脱下来的氨基 酸 其等电点为 天门冬氨酸等电点 pI 2 1 3 9 3 0 相反 赖氨酸所带的氨基 NH2 多 在 pH2 2 缓冲液中 正电荷多 它与树脂结合紧密 被 Na 置换困难 故洗脱下 来的速度就慢 赖氨酸的等电点 pI 9 0 10 5 9 75 氨基酸侧链除具有氨基和羧基外 有的氨基酸还带有其 他基团 这些基团在一定条件下也能离解 如酚羟基 酪氨 酸 咪唑基 组氨酸 及胍基 精氨酸 等 在一定条件下 这些基团的解离状态及它们对树脂的亲和力和被洗脱的速 度是有区别的 这些区别是各氨基酸在色谱柱被分离的基 础 不同氨基酸与离子交换树脂亲和力的强弱如下 碱性氨基酸 芳香族氨基酸 中性氨基酸 酸性及羟基氨基 酸 因此 氨基酸的分离便有先后顺序 一般酸性及带羟基 的氨基酸最先洗脱下来 然后是中性氨基酸 最后是碱性 氨基酸 图 1 4 3 是 Beckman 121MB 型氨基酸分析仪蛋白质 9 水解液中各氨基酸的出峰顺序 氨基酸的分离是用不同 pH 值的缓冲液进行的 一般标准 分析 蛋白质水解液分析 采用柠檬酸缓冲液 如果分析生 理体液 如尿 血浆 乳汁 脑脊液及动植物组织提取液等 则 该为柠檬酸锂缓冲液 因为天门冬酰胺与谷氨酰胺在钠盐 缓冲液中不易分离 两者重叠成一个峰 不能得出各自的 结果 标准氨基酸分析 蛋白质水解液分析 Beckman 121MB 型 一般使用三种缓冲液 即 pH3 28 洗出天门冬 苏 丝 谷 脯 甘 丙 胱 缬等氨基酸 pH3 90 洗出蛋 异亮 亮 酪 苯丙等氨基酸 pH4 95 洗出赖 组 精等氨基酸 除以上缓冲液外 还有再生液 浓度为 0 2mol L NaOH 每做完一个样品 仪器自动吸入再生液 将柱子冲洗干净 后 再做第二个样品 洗脱出来的氨基酸与另一流路的茚三酮溶液混合 在 100 的水浴中起显色反应 一般氨基酸反应后呈蓝色 但 脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色 故氨基酸分析仪一般都设计有 二个频道 一个为 570nm 一个为 440nm 显色后 流经分 光光度计比色 比色后的信号经放大以后输入记录仪和积 分仪 最后打印出结果 三 氨基酸分析仪的结构与功能 氨基酸分析仪是一种专门用来分析氨基酸的液相色谱仪 10 其结构一般由色谱系统 自动加样系统 检测系统 控制 系统 记录数据处理系统 电源供给系统和安全关闭系统 组成 色谱系统 色谱系统的作用是完成样品中各种氨基酸成分分离 本 系统包括氮气供给 流路和色谱柱 转换阀 泵以及水浴 等部分 氮气供给 氨基酸分析仪需要使用高纯氮 含 N2量 99 999 氮气 的作用是防止茚三酮试剂被空气中的氧所氧化 防止缓冲 液被空气中的氨污染 给缓冲液和茚三酮贮存瓶加压 以 利于液体通过单向阀进入泵内 吹干样品贮存螺旋管 液体的流路和色谱柱 液体流路 氨基酸自动分析仪的液体流路包括缓冲液 流路和茚三酮试剂的流路 缓冲液流路的作用是把缓冲液作为流动相以一定的流速 通过色谱柱 使样品中各种氨基酸组分在色谱柱内按一定 的顺序洗脱出来 基本流程为 加有氮气压力的缓冲液 低压管气泡捕捉器 低压管缓冲液选 择阀 低压管泵 高压管样品注射器阀 高压管色谱柱 减压柱流 出阀 Y 型混合接头 反应螺旋管 比色计 测量阀 流出 11 茚三酮流路是把一定流速的茚三酮试剂流入反应螺旋管 与洗脱的各种氨基酸组分起显色反应 以便用比色计进行 比色 色谱柱 Beckman 121MB 型氨基酸分析仪使用内径为 2 8mm 的玻璃色谱柱 柱长根据需要可选用 150mm 300mm 450mm 等几种 柱内填充的离子交换树脂是 美国 Beckman AA 10 型树脂 粒径为 8 9 m 交联度 12 控制阀 氨基酸分析仪使用的三种不同 pH 值的缓冲液和一种再生 液 是由四个进口一个出口的马达驱动旋转控制阀来控制 的 旋转阀有四个位置 每个位置出口只与其中的一个进 口相通 这样在四个进口上连接四种不同的缓冲液或再生 液 根据阀的旋转位置可以选择所需的缓冲液或再生液 每 次旋转 900 分别接通 1 2 3 4 管道 如图 1 4 4 所示 茚三酮选择阀 从茚三酮泵流出的茚三酮试剂流经反压 柱后 它的流向由一个马达驱动的选择阀控制 该阀是一 个四孔旋转控制机械阀 每旋转 900变换一次方向 如图 1 4 5 所示 泵 Beckman 121MB 型氨基酸分析仪由于是双柱系统 有三个 12 泵 一个茚三酮泵和两个缓冲液泵 泵被马达带动的凸轮 驱动 液体的流速由活塞的行程定来决定 行程又由凸轮 的偏心度来决定 因此 可以通过调节凸轮的偏心度来改 变泵的流速 水浴 氨基酸分析仪使用两种水浴 反应水浴和循环水浴 反应水浴槽 氨基酸与茚三酮的显色反应需要在 100 的 温度才能进行 所以仪器必须配有反应水浴槽 循环水浴 循环水浴的作用是给色谱柱加温 色谱柱的 温度对氨基酸的保留时间和峰的分离有很大影响 为了提 高分离效率和重现性 对柱温的选择和恒定要求很高 如 在 50 的柱温下分辨率指标为 苏氨酸 Thr 和丝氨酸 Ser 80 甘氨酸 Gly 丙氨酸 Ala 70 当使用 53 柱温时分辨率指标为 苏氨酸 Thr 和丝氨酸 Ser 70 甘氨酸 Gly 丙氨酸 Ala 80 在这个柱温下还有利用酪氨酸 Tyr 和苯丙氨酸 Phe 的 分离 为了取得最佳分离效果 氨基酸分析仪有程序升温 装置 水解液的分析柱温是 50 65 生理液的分析柱温 是 40 67 自动加样系统 13 氨基酸分析仪的自动加样系统 由样品贮存管 样品旋 转台 注射器旋转阀 样品转运泵 样品转运阀及控制部 分组成 完成一个样品自动加样包括以下步骤 转运样品 注射 样品 清洗样品贮存管 吹干样品贮存管 转运下一个样 品 氨基酸分析仪在自动运转时 自动加样系统是由一个样 品注射子程序系统按上面步骤自动完成的 也可以手动控 制操作 检测系统 氨基酸分析仪的检测系统是用比色计进行氨基酸组分检 测的 比色计的基本结构如图 1 4 6 所示 从光源 a 发出的光 经过凸镜聚光以后进入红外线滤光 器 b 和比色杯 c 在双色性附件 d 上分成三束光波 这三束 光分别被 440nm 570nm 690nm 的滤光器滤光以后在各自 的检测器上进行检测 在三个检测器上 把光的信号转变 为电信号 这些电信号分别送到 e f g 三个对数放大器 进行放大 在比色计的输出端输出 440nm 570nm 和 440 570nm 的三种信号 分别送到记录器记录和数据处理系 统进行处理 690nm 的信号是一个参比信号 目的是为了取 掉 440nm 和 570nm 信号中的电噪音 产生良好的信一噪比 和稳定的基线 14 控制系统 氨基酸分析仪的操作可以手动控制或程序自动控制 手 动控制主要用于仪器的某些部件的调节或制备一个完整的 自动控制程序 由于受树脂床高度 流速和冷却水温等因 素的影响 对某些程序步骤需要确定合适的时间 而这些 时间确定需要用手动操作才能得到 手动操作是通过控制 面板开关完成的 自动分析是通过分析程序控制完成的 程 序步骤略 记录和数据处理系统 从比色计输出的信号一路送给记录仪进行色谱图记录 另一路送给数据处理系统进行数据处理并打印结果 记录 仪把各种氨基酸组分的吸收峰在记录纸上绘成高斯分布色 谱图 可以单独根据记录仪所记录的图谱对所分析的氨基 酸组分定性定量 特别是对非蛋白氨基酸的定性 记录图 谱尤为重要 数据系统是一种为色谱数据处理而专门设计 的单通道数据换算系统 电源供给系统和安全关闭系统 电源供给系统 电源供给系统供给仪器各种部件工作 的交流和直流电源 Beckman 121MB 型氨基酸分析仪把 220V 50Hz 的单相交流电源由变压器降为 115V 50Hz 的交流 电源送到主机 供给泵 水浴加热器 记录仪和数据处理 机 24V 稳压电流电源供给指示灯 控制继电器及其放大 15 控制电路 比色计的放大器使用 15V 直流稳压电源 记录 器放大器使用它本身的 14V 直流稳压电源 比色计光源灯 用 6V 直流稳压电源 安全关闭系统 安全关闭系统的功能是监测仪器的工 作情况 当某一系统的工作不正常时能发出相应的报警信 号并自动关闭分析仪 Beckman 121MB 型氨基酸分析仪在手 控和自动操作时有三个独立的安全系统可以保护样品和设 备 记录安全系统 如果在分析过程中记录器无峰记录时 记录的安全系统自动关闭这个系统 阀门安全系统 监视所有旋转控制阀工作 它包括样 品旋转台 程序马达和各个换向阀等 当某一个阀在控制 它的旋转时失灵 将导致仪器的关闭 流动安全系统 当流速 被滴液检测器监视 低于流动 安全监视器的限量时 流动安全系统即被启动 这时茚三 酮阀转至排出位 柱流出阀从所用柱转至另一柱 从柱 1 转 至柱 2 或从柱 2 转至柱 1 并启动替代的缓冲液泵以清洗 管道内残留茚三酮试剂 茚三酮冲洗记时器上调定的时间 一般为一小时 过去以后 仪器即自动关闭 四 氨基酸分析仪的应用 蛋白质是生物体赖以生存的物质 生物体内除含有组成 蛋白质的各