通脉口服液对气虚血淤证单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质病变的影响

1 / 9通脉口服液对气虚血淤证单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质病变的影响作者：冷伟， 杨霓芝， 朴胜华， 王立新， 赵代鑫【摘要】 目的探讨益气活血复方通脉口服液对气虚血淤证肾小管间质病变的干预作用。方法 Wistar 大鼠 60只，随机分为空白组，模型组，洛汀新治疗组，通脉大、中、小剂量治疗组。采用单侧输尿管梗阻(UUO)+亚急性衰老+游泳力竭致气虚血淤证肾小管间质病变病证结合模型，予相应药物治疗 4 周，观测体质量等一般状况，进行中医气虚证、血淤证评分，化学法检测血清 BUN、Scr 含量，ELISA 法检测血组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)含量，对病变肾组织进行间质细胞浸润情况评分(CIS)及肾小管间质慢性病变评分(AFS)。结果模型大鼠体质量显著下降，气虚证、血淤证积分显著增高，通脉大、中剂量组大鼠体质量显著改善(P 【关键词】 通脉口服液; 气虚血淤证; 肾小管间质病变慢性肾脏病(CKD)是世界范围的医疗和公共卫生问题。长期以来，对其研究主要集中于肾小球病变，肾小管间质病变(Tubulointerstitial lesions，TIL)未得到足够重视。随着人类肾脏疾病病理改变和肾病变动物模型研究的深入，2 / 9提示 CKD 的发展和预后不仅与肾小球病变有关，更取决于TIL 的有无及程度的轻重1。以杨霓芝教授为代表的学科组研究表明气虚血淤证为 CKD 最常见证侯之一，通过十余年的临床与实验研究，证明具有益气活血功效的中药复方通脉口服液(TM)可通过多种机制改善 CKD 预后2。因此进一步开展其对气虚血淤证 UUO 大鼠 TIL 干预作用的实验研究，完善其机制探讨。1 材料与仪器动物健康雄性 SPF 级 Wistar 大鼠 60 只，体质量230250 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK(粤)XX-0001。药物与试剂 通脉口服液(由黄芪、三七等制成)由广东省中医院制剂中心提供(批号：06080709，规格：10ml10 支)。对照药物：洛汀新(苯那普利)，北京诺华制药有限公司生产(批号：HXX0514，规格：10mg14 片)。t-PA、PAI-1 检测试剂盒：美国 USCN life Science and technology company 生产，广州威佳科技公司提供。仪器 7170A 全自动生化分析仪：日本日立;EclipseE800 型光学显微镜：日本 Nikon 公司;DG5033A 酶标仪：南京华东电子公司。2 方法分组与造模方法适应性饲养 7d 后将大鼠随机分为3 / 92 组，空白组(A)10 只，造模组 50 只，后者复制气虚血淤证 UUO 模型。造模方法：衰老：采用 D-半乳糖亚急性衰老方法3，第 748 天注射 D-半乳糖(150 mg/kgd);疲劳：采用游泳力竭方法4，第 734 天每日 9：00 开始分批置入直径 50 cm，高 100cm 水桶内，桶内水深 45cm，水温与室温均保持为(15)，以木棒拔打强迫其不断游泳直到力竭(标准为动物下沉后 10 s 不露出水面);UUO:给药方法第 3460 天、B 组生理盐水 12 ml/kgd灌胃，C 组洛汀新 2 mg/Kgd 灌胃，D 组大鼠 TM (12 ml/kgd)灌胃，E 组 8 ml/kgd(生理盐水稀释至 12 ml/kgd，下同)灌胃，F 组 4 ml/kgd 灌胃。取材及处理方法第 60 天所有大鼠 5%水合氯醛麻醉后，腹主动脉取全血 6 ml，低温离心分离血清(4，3 000 r/min，10 min)，-20保存。游离左肾，扇形切取部分肾组织，10%中性甲醛溶液固定。检测指标与方法治疗前后中医证候积分评定各组大鼠肾小管间质 CIS 及 AFS 积分情况与 A 组相比，各造模组 CIS 均明显增高(P)。与空白组相比，各造模组大鼠 AFS 均明显增高(P ，P 4 / 94 讨论TIL 最终可导致肾间质纤维化(RIF)，后者几乎是所有 CKD 发展到后期的病理学特征。通过早期防治 TIL 以阻止 RIF 的进展进而改善 CKD 的预后具有重大意义。研究表明, 血管紧张素转换酶抑制剂等药物具有一定保护作用8，中医药防治 TIL 的研究业已获得了不少有意义的研究结果。我们前期应用具有益气活血功效的中药复方制剂 TM 用于治疗具有气虚血淤证的 CKD,疗效明确。因此进一步设计动物实验探讨 TM 的疗效与干预 TIL 的相关性，并设大、中、小剂量组及 ACEI 类代表药物洛汀新作为对照，以期初步明确其量效关系及作用特点。当前中医药干预 TIL 的动物实验研究，大都直接采用现代医学模型，其中单侧输尿管梗阻(UUO)应用最为广泛。但中医药现代化及中西医结合事业迫切需要真正具有中医证候特点的病证结合模型9。杨霓芝教授在肾脏病研究领域率先采用抗 Thy-1+游泳疲劳试验造成的大鼠慢性肾炎“气虚血淤证”病证结合模型10。在此基础上，本实验TIL 动物模型，采用了 UUO 联合亚急性衰老及游泳疲劳的复合因素造模方法。结果显示：梗阻侧肾组织发生典型 TIL，说明“病”的复制是成功的。造模后在宏观“证”方面，模型组较空白组大鼠体重下降，并出现了精神萎顿、毛发枯黄无光泽、稀便、舌质暗淡、尾尖至根部出现淤血点、5 / 9梗阻侧肾色泽紫暗等“气虚血淤证”表现;在微观“证”方面，我们监测了纤溶酶原激活剂/纤溶酶原激活剂下抑制物(PAs/PAIs)这对指标，其不仅是维持血液中凝血与纤溶平衡的关键酶系，同时为调节肾脏细胞外基质代谢的关键酶系之一11， PA 水平下降、PAI 水平上升或其比值下降与淤血证有一定相关性11，12。本实验结果显示与空白组相比，模型组 PAI-1 显著升高，在一定程度上提示该模型具有微观的血淤证。实验结果表明，应用益气活血中药 TM 灌胃后大鼠体质量、 “气虚证” 、 “血淤证” 血清 PAI-1 升高得到不同程度改善，洛汀新改善不显著，提示益气活血中药 TM 的多靶点、多途径的药理作用可能有助于改善衰老、疲劳、输尿管梗阻对大鼠造成的“气虚血淤”综合病理改变，这为临床上应用 TM 等中药制剂治疗 CKD,在改善患者整体表现方面优于洛汀新等西药提供了实验依据。同时以方测证，本实验在气虚血淤证的复制是比较成功的。病理学是研究肾小管间质病变的最直观、最有说服力的指标，本研究对实验大鼠梗阻肾病理切片行 HE、Masson 染色，通过对大鼠肾小管间质慢性病变和肾间质细胞浸润情况进行盲法观察评分。结果显示，大剂量 TM 组改善 CIS 作用与络汀新相当, 改善AFS 方面优于洛汀新，提示大剂量 TM 对 TIL 具有显著的保护作用，且在改善肾小管萎缩和间质纤维化等慢性疗变方6 / 9面具有优势，这为临床研究中通脉口服液长期应用可改善CKD 预后提供了动物实验依据，同时值得进一步深入研究。至于其机制，根据中医理论，肾小管萎缩和间质纤维化符合中医“虚”与“淤”的证候学特征，TM 益气活血正与其相应，因此在这一方面作用突出;对于其具体内在作用机制，本实验结果表明大、中剂量 TM 可明显降低血清 PAI-1 水平，初步提示可能为其作用机制之一。2 冷 伟，杨霓芝，赵代鑫，等.益气活血法防治肾纤维化的探讨与研究J.江苏中医药，2016，41(5):59.3 韩晓辉，马志红，石玉娥，等.富硒灵芝对 D-半乳糖衰老模型大鼠的抗衰老作用研究J.中药药理与临床，XX，22(2):42.4 朱 斌，李文川，吴 畏.血府逐淤汤对训练适应大鼠血液流变学及力竭性游泳运动能力的影响J.四川体7 / 9育科学，XX，1:22.5 Kaneto H， Morrissey J，Klahr expression of TGF-1mRNA in the obstructed kidney of rats with unilateral ligationJ. Kidney Int，1993，44:313.6 王 键，赵 辉，李 净，等.多因素复合制作气虚血淤证脑缺血动物模型的实验研究J.中国实验动物学报，2001，9(4):216.7 孟立强，屈 磊，李晓玫.黄芪当归合剂对肾间质纤维化的多靶点抑制作用J.中国药理学通报，XX，22(3):296.8 杨 宁.肾间质纤维化的防治进展J.国外医学泌尿系统分册，XX，25(6):831.8 / 99 赵明镜，吴爱明，王硕仁.心衰心气虚病证结合动物模型的研究思路J.北京中医药大学学报，XX，31(5):306.10 杨霓芝，包 昆，王立新，等.通脉口服液对大鼠慢性肾炎“气虚血淤证”模型的组织形态学影响J.中国中医药信息杂志，2001，8(3):31.11 Ishidoya S，Ogata Y，Fukuzaki A ，et activator Inhib-itor-1 and tissue-type plasminogen activator are upregulated during unilateral ureteral obstr