乙肝诊断技术新进展

乙肝诊断技术新进展,目前乙型肝炎实验室诊断中存在的问题,单独用HBsAg作为判定是否感染乙肝病毒的指标并非完全准确 理论基础： HBV/HCV合并感染，抑制HBsAg表达 144、145位等氨基酸变异,国内外ELISA试剂检测HBsAg比较,野生型 ad 相差约8倍 ay 相差约16倍 变异型对G145R变异及与其相关的多点变异的检测能力弱,或检不出；对T118K/P120Q，Q129R/M133T等联合变异的检测能力弱；对于T126N，D144A等变异国内外试剂的检测能力基本一致。,国内外诊断试剂对变异血清的检测,国家参考品adr血清的检测结果,含有G145R变异的血清检测结果,变异血样,目前乙型肝炎实验室诊断中存在的问题,单独用HBeAg诊断活动期乙肝并不可靠。 理论基础：前C区变异,为什么会出现HBeAg阴性,HBeAg阴性是由于HBV变异造成： 常见的是 前核心区 和 核心启动子区 的变异前核心区 G 1896 A 突变使前核心区出现终止密码，导致E抗原不能合成前体氨基酸异位核心启动子区 A 1762 T + G 1764 A 突变造成信号RNA转录降低，导致HBeAg不能分泌，血清中检测不到HBeAg,前C区的基因突变,当乙肝病毒为逃避宿主的免疫反应基因可发生变异。 其所携带的HBV变异毒株大多数表现为： 在病毒基因组前C区末端1896位发生 G A 点突变 TGG TAG 恰好形成新的终止密码子（TAG） 阻断了HBeAg的转录，翻译，表达 导致在临床上可出HBeAg检测为阴性。,但HBV病毒仍能复制和装配,Expression of core protein and HBeAg,前C区变异,前C区发夹形纤襻结构，在1858位与1896位间，将不稳定的TG对变异为TA对，使前基因组RNA结构更稳定，更有利于病毒复制，进而导致优势株。全世界HBeAg阴性的患者中有60被检测到前C终止密码变异，在地中海为92，亚太地区是50，美国北欧为24,Cumulative effect of Core promoter mutations,C区变异,在病毒清除期，基因组较保守的部位发生了选择性变异，以C区中部的变异或缺失 ，至少可涉及4个B细胞靶位、2个细胞毒T细胞（CTL）表位和3个Th细胞表位。 C区Codon130是最重要的免疫原性区 ，是T、B细胞共有的表位。干扰素治疗HBeAg阴性的慢性乙肝持续的反应率较低，而在HBeAg阳性患者干扰素疗效较好，当患者血清HBV前C基因突变株超过20时，常预示IFN疗效差，在慢性HBV感染过程中，前C1896变异毒株逐渐累积成为优势毒株，因此，临床应用干扰素治疗越早越好,X基因的变异,X基因是病毒复制的重要调节区，是转录、反转录和正链合成的起点，也是多种细胞因子结合点，此区变异影响到病毒的转录和复制：核心蛋白的启动子（BCP） 慢性乙型肝炎：BCP变异是多点和复合，主要是1762（AT）、1764（GA）的双变异，BCP区是富含AT区域，具有肝脏富含因子的独立结合点，变异的BCP可改变这种结合，降低前C的RNA转录，最终使HBeAg表达减少，平均降低70。暴发型肝炎患者CP1638位（TC）、1673位（CT）、1727位（AT）、1730位（CG）变异出现较多,S基因变异,乙肝疫苗免疫HBsAg(+) ，“a”决定簇变异株，其中145位的甘氨酸替代了精氨酸，这是由于HBV逃避宿主的免疫压力选择性结果，有时这种变异株在母体内为少数，而在疫苗免疫后的小儿却成为优势株 肝移植后应用单克隆抗体或高效价HBsAg治疗后也可出现145位的甘氨酸精氨酸HBsAg变异。还有在HBsAg、DNA患者中发现124位半胱氨酸缺失，导致HbsAg的分泌障碍，而使免疫学标志出现HBsAg。,乙肝病毒临床与变异,慢性感染HBeAg（）期，病毒高滴度，但临床常无加重 随着感染持续，出现了HBeAg()前C变异株，并逐渐累积，此时血清学仍可为HBeAg()，但血清中已可同时检测野毒株和变异株，其中野毒株逐步被清除，临床上常伴肝炎发作；随着前C1896变异株选择优势的发展，血清学可转换为HBeAg(-)，但在血清中仍可检测到HBeAg分泌的野毒株，在临床上既可表现为病情加重，也可表现为病情缓解；若选择的结果进入均一eAg不表达的变异株，则ALT可轻微升高，但病情可无明显加重。,目前乙型肝炎实验室诊断中存在的问题,DNA复制程度的大小并不代表肝脏实际损害的程度（庄辉院士）, DNA不能准确的判断愈后，转阴后可能反弹。 附：DNA与ALT的关系,DNA与ALT的关系,首都医科大学 闵福援 39例急性乙肝患者血清HBV-DNA与ALT间的动态变化,不同病程的HBV-DNA与ALT相比差异有显著性。,目前乙型肝炎实验室诊断中存在的问题,单独DNA检测并不能准确反映乙肝病毒的复制情况，部分活动期乙肝患者DNA检测结果呈阴性。,客观评价乙肝病毒DNA检测在临床诊断中的意义,扩增乙肝C基因区上270bp基因片段，以2 n 指数，将HBV-DNA分子片断扩增110 7 10 8 倍同一位患者抽血检查HBV-DNA，其定量数值每天都在变化，即便是患者不进行任何治疗，定量检测到的数值都在时刻变化之中。同一份血清标本在不同的时间检测，或在不同的实验室检测，其数值都会有所不同。以这种时刻都在自然变化着的数值用来说明疗效，是不确切的。,HBV-DNA定量检测,所用仪器设备、试剂品质不同，标准曲线以及标准荧光等各不相同，得出的数值左右漂浮，偏差大，得出的检测值范围也不相同 DNA载量-随时变化的不稳定数值： 可能是治疗效应，也可能是自然变化或检验偏差。DNA载量正常值和异常值范围难以统一,PCR-血清标本的处理,目的基因的得率： 处理标本过程中目的基因的得率问题，在一定范围内还 可以提高PCR法的特异性。 不同的抽提方法，DNA得率不同; 因此，如果没有统一的血清标本处理方法，那么基因定量检测的准确性如何得到保证呢？这个问题在作PCR定量时显得尤为突出。,定量PCR法的原理是把“反应管”中的目的基因指数级地扩增到一定水平，再通过产物杂交，并与设定的内参照对比，推算“反应管”内的目的基因含量，并不等于原待测标本内的真正含量，因此血清标本处理过程种的目的基因的丢失及丢失量均无法计算。,由于基因突变所致PCR法假阴性的问题,慢活肝，血清HBV DNA检测阴性？ PCR引物设计原则：筛选出阳性率“最高”的一对引物 从整体上看，PCR的漏检率可能很低，但漏检如果发生在某一个具体病人则是100%。第一，我们有没有更积极的措施，最大限度地减少假阴性？第二，临床医生是否对DNA检测技术的局限性有足够认识？是不是仅凭一张检验报告的阳性或阴性结果，作出HBV感染是与否的判断？,基因检测和免疫学检测技术具有互补性,基因检测 判断病原体的有无和量的多少 机体作出了何种反应？ 程度如何？ 反应的结果如何？,preS1对乙肝诊断的独特作用,1、 preS1作为嗜肝侵蚀性的标志与HBsAg同时检测； 结果相互印证，诊断乙肝更准确。,夹心法测PreS1抗原,PreS1,PreS2,HBsAg,preS1对乙肝临床诊断的独特作用,2、解决HBeAg漏检带来的误诊， 提供判断病毒复制的可靠指标。,HBsAg ()组preS1抗原和HBeAg的关系,前S1抗原与E系统的关系,PreS1阳性组中HBeAg阳性率62.6%;HBeAg阴性组中PreS1阳性率39.6%;,前S1抗原与E系统以及DNA的关系,前S1抗原与E系统以及DNA的关系,preS1对乙肝临床诊断的独特作用,3、弥补乙肝DNA检测的假阴性 在已经开展DNA检测的单位，如果DNA阴性的病例，建议加查PreS1,这时如果再有ALT阳性，高度怀疑肝炎活动期。,Expression of 3 co-terminal envelope proteins of HBV,preS1对乙肝临床诊断的独特作用,安徽阜阳肝病研究所 张金良 -313例慢性肝炎患者PreS1抗原和DNA检测数据比较,preS1对乙肝临床诊断的独特作用,4、preS1与肝损伤直接相关， 判断治疗效果比DNA更准确。,preS1对乙肝临床诊断的独特作用,首都医科大学 闵福援 39例急性乙肝患者血清HBV-DNA与ALT间的动态变化,不同病程的HBV-DNA与ALT相比差异有显著性，而PreS1抗原与ALT相比无显著差异，PreS1抗原可以判断治疗效果。PreS1先于DNA转阴提示预后良好。,5、 PreS1抗原在AHB病程中先于HBV-DNA转阴，较早预示病情好转，可用于判断预后，比DNA更有意义。,preS1对乙肝临床诊断的独特作用,诊断用基因工程抗体分子的制备,基因工程抗体的优势,抗体分子超变区点突变 -使得抗体活性高于天然分子抗体， 从而提高试剂的敏感度。抗体分子恒定区改造 -避免人抗鼠抗体的干扰， 有效提高了试剂的特异性。,传统preS1诊断试剂存在的问题,传统preS1诊断试剂抗体位点不全，影响检出率。与DNA检测结果符合率较低一步法的试剂敏感度低，影响对乙肝的正确诊断。,威高生物preS1诊断试剂的特点,独家采用基因工程抗体新技术。准确度高，真正发挥PreS1的诊断优势。提高乙肝诊断的准确性， 维护医生和检验师的良好声誉。,传统preS1试剂威高新一代preS1试剂,对比总结,传统preS1试剂威高新一代preS1试剂,性能对比研究,不同质量preS1试剂 对乙肝诊断的准确性影响很大,华中科技大学同济医院 彭静 临床检验杂志 2006年第3期,检验两对半为何还要查Pre-S1？,1前S1抗原出现在急性乙型肝炎感染的早期，在转氨酶升高前即可查出，提示可作为早期诊断乙肝病毒感染的指标。 2急性乙型肝炎患者前S1抗原阴转越早，预后越好，是病毒清除的最早迹象。反之，前S1抗原持续阳性，将发展至慢性肝炎。（比HBeAg阴转、HBsAb阳转指标提示要早）。 3HBeAg（-）慢性乙型肝炎约占慢性乙肝的30%-50%，检测前S1抗原，提示病毒在机体内继续复制，此类患者更容易演变为肝硬化或肝癌。加查前S1抗原，弥补了因HBeAg缺失造成的诊断和治疗困难。 4在HBV无症状携带者中，有一定比例的HBeAb（+）者，加查前S1抗原（+）提示病毒在体内还较活跃。病毒并没有清除，肝脏还有潜在的病理损伤的可能。 5抗病毒治疗乙型肝炎，加查前S1抗原可作为治疗前的患者筛查和治疗后的疗效判断，尤其对HBeAb（+）的慢性肝炎患者抗病毒治疗的排查也起到重要作用。 所以检验两对半，加查前S1抗原可在急性肝炎，慢性肝炎，HBV无症状携带者和抗病毒治疗乙型肝炎诊疗过程中起到十分重要的作用。,为什么检测HBV-DNA还要检测前S1抗原？,1在病毒感染机体的整个周期中，前S1蛋白的独特功能，使其能够较充分的反应机体的体液免疫状况，直至病程的转归过程, 如早期诊断，急性肝炎前S1抗原阴转是病毒清除的最早迹象，反之疾病将发展至慢性肝炎等临床诊断以及前S1抗原阴转，前S1抗体出现等免疫学反应）这是单一测定HBV-DNA所不能做到的。 2免疫测定技术因其有效、直接、简便的特点，已经在临床诊断应用上占主导地位。前S1抗原的检测与基因测定HBV-DNA能够相互补充和加强，就像H