PCR法支原体检测

1 8 PCR 法支原体测定法支原体测定 PROTOCOL 关键词PCR 支原体 修订记录 姓名部门 职务签名日期 年 月 日 起草人 审核人 批准人 生效日期 年 月 日 有效期至 年 月 日 分发部门 质量部 2 8 1 目的目的 规范 PCR 法支原体检测的操作方法 2 范围范围 适用于项目研发过程样品 原液 成品及中间体的分析 3 责任责任 质量分析人员熟悉并遵守该标准操作规程 4 定义定义 N A 5 设备 材料和试剂设备 材料和试剂 5 1 设备 材料设备 材料 设备名生产商型号 货号备注 PCR 仪ThermoARKTIK5020N A VORTEXIKAGENIUS 3N A 小型台式冷冻离心 机 Thermo HERAEUS Fresco 21 N A 单道移液器 10ul 20ul 100ul EppendorfResearch plusN A 多功能水平电泳槽TanonHE 120N A 凝胶成像系统BIORAD ChemiDoc XRS System N A 5 2 试剂试剂 试剂名称生产商货号 TaKaRa PCR Mycoplasma Detection Set TaKaRa6601 TaKaRa Ex Taq TaKaRaRR001A Regular Agarose G 10BiowestN A Goldview国产N A 3 8 10 Loading BufferTaKaRa9157 DL5000 DNA MarkerTaKaRa3428A 内毒素检查用水厦门鲎试剂实验厂有限公司 6 溶液配制溶液配制 6 1 50 TAE Buffer 称取 242 0g Tris 37 2g Na2EDTA 2H2O 于 1L 烧杯中 向烧杯中加入约 800ml 超纯水 充分混匀 加入 57 1ml 冰乙酸 充分溶解 加入超纯水定容至 1L 室温保存 有效期 6 个月 6 2 1 TAE Buffer 量取 10ml 50 TAE Buffer 加入 490ml 超纯水 充分混匀 有效期 6 个月 7 操作步骤操作步骤 用于检测支原体的样品是接种后进行 3 6 天细胞培养的培养上清液 如果 使用常用的细胞培养基时 培养上清可直接加入到 PCR 反应液中 如果使用细 胞悬浊液作为样品 则需要提取 DNA 再进行 PCR 反应 如果样品中含有 PCR 反应阻碍物 需要对 DNA 进行抽提 再添加到 PCR 反应液中 为了确认 样品中是否含有反应阻碍物 在样品中加入 Control Template 进行正对照反应 7 1 1st PCR 反应反应 7 1 1 按下表顺序配制反应混合液 50ul 体系 试剂用量 ul 内毒素检查用水37 75 38 75 10 PCR Buffer5 dNTP Mixture4 MCGp F1 Primer0 5 4 8 MCGp R1 Primer0 5 TaKaRa Taq0 25 7 1 2 向以上反应混合液中分别加入 1ul 阴性对照样品 内毒素检查用水 1ul 供试品 1ul 阳性对照样品 Control Template 和 2ul 供试品阳性对照 1ul 供 试品 1ulControl Template 添加样品时务必防止交叉污染 为了避免交叉污染 实验过程需分区域操作 在实验区域 1 完成 PCR 反应 液配置后 先在该实验区域加入 1ul 内毒素检查用水 阴性对照 再在实验区 域 2 加入 1ul 供试品 最后在实验区域 3 加入 1ul Control Template 阳性对照 及 1ul 供试品 1ul control Template 供试品阳性对照 7 1 3 将反应管置于 PCR 仪中 设定以下反应条件进行 PCR 反应 94 30sec 94 30sec 55 2min 35 cycles 72 1min 72 5min 7 2 2nd PCR 反应反应 7 2 1 按下表顺序配制反应混合液 试剂用量 ul 内毒素检查用水39 25 10 PCR Buffer5 dNTP Mixture4 MCGp F2 Primer0 5 MCGp R2 Primer0 5 TaKaRa Taq0 25 7 2 2 用内毒素检查用水将 1st PCR 反应产物稀释 100 倍 取 0 5ul 加入以上 反应混合液中 为了防止交叉污染 加样时需分区域操作 具体加样方式同 5 8 7 1 2 7 2 3 将反应管置于 PCR 仪中 设定以下反应条件进行 PCR 反应 94 30sec 94 30sec 55 2min 30 cycles 72 1min 72 5min 7 3 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析 7 3 1 1 琼脂糖凝胶的制备 称取 0 4g Regular Agarose G 10 加入约 40ml 1 TAE Buffer 大于 40ml 置于微波炉中中高火加热 2min 摇匀 再加热 2min 稍微冷却后加入 1ul Goldview 振荡摇匀 倒入胶槽中 冷却 30min 左右直至凝固 取出制备完成的琼脂糖凝胶置于多功能水平电泳槽中 加入 1 TAE Buffer 直至超过凝胶 2mm 左右 7 3 2 上样 取 1st 和 2nd PCR 产物各 10ul 加入 1 1ul 10 Loading Buffer 混匀后 取 10ul 上样 用 6ul DL5000 DNA Marker 作为对照 7 3 3 电泳及分析 调节电压 120V 电泳 1h 取出凝胶置于凝胶成像系统 拍照并分析确认 扩增片段的有无及片段大小 8 数据分析数据分析 8 1 Control 实验 阴性对照 阳性对照 供试品阳性对照 本实验中以内毒素检查用水作为阴性对照样品 以 Control Template 作为阳 性对照样品 以 供试品 Control Template 作为供试品阳性对照样品 使用 Control Template 时 F1 和 R1 引物扩增产物是 810 bp 见图 1 泳道 5 6 F2 和 R2 引物扩增产物是 590 bp 见图 1 泳道 11 12 6 8 当阴性对照结果呈阴性 阳性对照结果呈阳性 此反应系统可行 当供试品阳性对照结果呈阳性 说明待测样品对 PCR 反应无阻碍 如果供 试品阳性对照结果呈阴性 说明检测样品中有阻碍物 建议将检测样品进行 DNA 提取 再以其作为模板进行扩增 图图 1 1 DL5000 Marker 2 H2O 1 1st 3 H2O 2 1st 4 待测样品 5 待测样品 control 1st 6 control 1st 7 H2O 3 1st 8 H2O 1 2nd 9 H2O 2 2nd 10 待测 样品 2nd 11 待测样品 control 2nd 12 control 2nd 13 H2O 3 2nd 8 2 供试品检测 若待测样品检测结呈阴性 说明无支原体污染 若待测样品有条带 则进 一步确认片段大小 表 1 是以 12 种 Mycoplasma DNA 分别作为模板 2 对引物 进行扩增所得到的片段大小 图 2 是 12 种 Mycoplasma DNA 取 1ng 进行两轮 PCR 反应 反应体积为 100ul 后的电泳结果 表 1 12 种 Mycoplasma 属的扩增片段大小 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 7 8 图 2 12 种 Mycoplasma DNA PCR 反应后电泳结果 8 3 问题分析 8 3 1 Control Template 是用于检测 PCR 反应性能的 当加入 Control Template 时 即使检测样品中含有 Mycoplasma 也可能没有扩增获得与 Mycoplasma 相对应的片段 因此不要使用 Control Template 添加的反应进行样 品的结果判定 为了获得准确的样品检测结果 在做 PCR 反应时 要保证检测 样品是唯一的模板 8 8 8 3 2 当检测样品中含有大量 Mycoplasma 时 有时可能只有样品中 Mycoplasma 的片段扩增 而正对照的 Control Template 片段却没有扩增 8 3 3 Control Template 是人工合成的 序列中不含 Mycoplasma 的内部序列 8 3 4 使用含有 10 FCS