深度测序技术简介

Next Generation Sequencing,Sample fragmentationLibrary preparationSequencing reactionData analysis,Roche 454 焦磷酸测序Pyrophosphate Sequencing,Illumina Solexa 合成测序Sequence by Synthesize,ABI SOLiD 连接法测序Sequence by Ligation,深度(高通量）测序技术简介,Roche 454 焦磷酸测序Pyrophosphate Sequencing基本原理,Roche 454测序技术,边合成边测序（sequencing by synthesis）454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购目前，Roche 454 GS FLX Titanium每次运行能产生100万条序列，平均读长能达到400nt，且第400个碱基的准确率能达到99%。一次运行所需时间为10小时，能获得4-6亿个碱基的序列信息。,454 sequencing： Emulsion PCR (emPCR),Mix DNA Library & capture beads(limited dilution),“Break micro-reactors”Isolate DNA containing beads,Generation of millions of clonally amplified templates on each beadNo cloning and colony picking,Create “Water-in-oil” emulsion,+ PCR Reagents,+ Emulsion Oil,Perform emulsion PCR,Adapter carrying library DNA,A,B,Micro-reactors,Adapter complement,Enrich,Anneal Seqprimer,Centrifuge Step,Load Enzyme Beads,454 sequencing： Deposition of DNA beads into the PicoTiterPlate,Load beads into PicoTiterPlate,Illumina Solexa 合成测序Sequence by Synthesize基本原理,Illumina Solexa测序技术,Illumina公司于2007年初花费6亿美金巨资收购了Solexa, 2010年初，Illumina将其第二代测序仪Genome Analyzer IIx升级到HiSeq 2000HiSeq 2000含有两张Flow cell，可同时运行或者只运行其中一张。读长为100nt，同时支持Fragment、Pair-end和Mate-Paired文库。每次运行最多可产生200 GB的数据量（读长为2x100nt）。,Clonal Single Molecule Arrays单分子克隆,1000 molecules per 1 m cluster 1000 clusters per 100 m square40 million clusters per experiment,Prepare DNA fragments,Ligate adapters,Attach single molecules to surface,Amplify to form clusters,Reversible Terminator Chemistry可逆终止反应,All 4 labelled nucleotides in 1 reaction,Sequencing-by-Synthesis (SBS),First base incorporated,Cycle 1: Add sequencing reagents,Remove unincorporated bases,Detect signal,Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat,1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的阻断基团2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序反应,T T T T T T T G T ,T G C T A C G A T ,The identity of each base of a cluster is read off from sequential images根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的DNA序列,Base calling from the raw data,Solexa 测序 Workflow,ABI SOLiD 连接法测序Sequence by Ligation基本原理,ABI SOLiD测序技术,2010年末又发布了最新产品-SOLiD 5500xl测序平台。SOLiD 5500xl含有两张微流体芯片（microfluidic FlowChip），每张芯片含有6条相互独立的运行通道（run lane）。每条lane都能运行相对独立的测序反应，这样的设计使得SOLiD 5500xl测序平台极具灵活性。最大测序读长为75nt，同样支持Fragment、Pair-end和Mate-Paired文库。单次运行能得到的最大数据量为300Gb（使用最新设计的nanobeads）。测序的系统准确性能达到99.99%,文库制备：微珠单分子克隆,1024种8碱基探针4色荧光，4种双核苷酸，每色荧光有256个探针(46),SOLiD 利用探针的连接反应读取模板的DNA序列,连接法测序（一）,,绿宇生物科技 专业建库 测序 QQ:110199525,每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基，因此一条测序引物读取的序列是不完整的,测序引物与adapter退火,探针连接，检测荧光,切除荧光基团,第二轮探针连接，检测荧光,切除荧光基团,连接法测序（二）,测序引物沿着Adapter移动5次，确保每个位点都被检测,连接法测序（三）,0位置是Adapter的最后一个碱基，因此只检测一次，该碱基是进行解码所必须的。,Advantage & disadvantage,454 sequencing读取长度大，400bp可以对未知基因组进行从头测序de novo sequencing当遇到polymer时，如AAAAAA等，荧光强度和碱基个数不成线性关系，判定重复碱基个数有困难Solexa sequencing高度自动化的系统读取片段多，适合进行大量小片段的测序，如microRNA profiling基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降低，信号衰减，读取序列较短，给de novo sequencing 拼接带来困难SOLiD sequencing每个碱基读取两次非常高的准确性，特别是对于SNP的检测灵活的系统，完善的磁珠编码系统，可以进行样品的pooling，分割测序区域读取长度受连接反应的轮数限制，给de novo sequencing 拼接带来困难,高通量测序的应用,De novo 测序基因深度测序（genome re-sequencing）转录组深度测序（transcriptome re-sequencing）Digital expression profilingChIP-seqMethy-seq,Transcriptome resequencing：,malignant pleural mesotheliomas (MPMs) ：恶性胸膜间皮瘤pulmonary adenocarcinoma (ADCA)：肺腺癌,Transcriptome characteristics,Solid line： at least one readDashed line：at least 20 reads,Expression difference between MPM and ADCA sample compare to a lung tissue control,Analysis of percent-age of reads containing known coding region SNVs in the six tissue samples.,SNV： Single Nucleotide Substitution Variant,Digital expression profiling（1）：人大脑组织与UHR（Universal Human Reference）的表达差异,Digital expression profiling µRNA re-sequencing：,hESC： human embryonic stem cellsEB： embryoid bodies,ChIP-seq（1）：人一号染色体DNA-蛋白相互作用,ChIP-seq（2）：,Sequenced short reads (typically 2550 bp) from ChIP-Seq experiments are rst mapped onto the reference genome. The mapped reads are then used to estimate statistical parameters, which include the estimation of the average length Fof sequenced DNA fragments.,Methy-seq（1）：肿瘤和MCF7细胞系中 BRCA!启动子区域的甲基化差异,Some highlights:Correlation between ChIP-Seq and his prior SAGE-like method (called GMAT) has r=0.906However the resolution with ChIP-Seq was dramatically higher. Furthermore, ChIP-Seq was more sensitive and generated less false-negative regions12,726 genes whose transcription levels are known in CD4+ T-cells were correlated with the histone modifications and 35,961 Pol II binding site islands were identifiedThis cost-effective method produces digital-quality data and should find broad applications in our efforts to understand the contribution of the human epigenomes in gene expression and epigenetic inheritance,Methy-seq（2）：,第三代测序技术简介,第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。另外，第二代测序的读长普遍偏短，在进行数据拼接时会遇到麻烦。为了克服这样的缺点，业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。简介如下：,1.Helicos公司,Helicos公司的Heliscope单分子测序仪基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小片段并在3末端加上Poly(A)，用末端转移酶在接头末端加上Cy3荧光标记。用小片段与表面带有寡聚Poly(T)的平板杂交。然后，加入DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP进行DNA合成反应，每一轮反应加一种dNTP。将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，检测上一步记录的杂交位置上是否有荧光信号，如果有则说明该位置上结合了所加入的这种dNTP。用化学试剂去掉荧光标记，以便进行下一轮反应。经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序。Heliscope的读取长度约为30-35 nt，每个循环的数据产出量为21-28 Gb。,2.Pacific Biosciences公司,Pacific Biosciences公司的SMRT技术基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体进行测序反应。SMRT芯片是一种带有很多ZMW(zero-mode waveguides)孔的厚度为100 nm的金属片。将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部，进行合成反应。与其他技术不同的是，荧光标记的位置是磷酸基团而不是碱基。当一个dNTP被添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。此外由于dNTP在荧光信号检测区停留的时间（毫秒级）与它进入和离开的时间（ 微秒级） 相比会很长，所以信号强度会很大。其它未参与合成的dNTP由于没进入荧光型号检测区而不会发出荧光。在下一个dNTP被添加到合成链之前，这个dNTP的磷酸基团会被氟聚合物（fluoropolymer）切割并释放，荧光分子离开荧光信号检测区。,3.Oxford Nanopore Technologies公司,Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子技术是一种基于电信号测序的技术。他们设计了一种以-溶血素为材料制作的纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊精。用核酸外切酶切割ssDNA时，被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的变化幅度就成为每种碱基的特征。,三代测序技术的原理各有特点，适用范围也不近相同。第一代测序技术凭借其长的序列片段和高的准确率，适合对新物种进行基因组长距框架的搭建以及后期GAP填补，但是成本昂贵，而且难以胜任微量DNA样品的测序工作。第二代测序技术中，454序列片段最长，比较适合对未知基因组从头测序，搭建主体结构，但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高。Solexa较454具有通量高、片段短、价位低的特点，可以用于大基因组和小基因组的测序和重测序。Solexa双末端测序(paired-end sequencing)可以为基因组进一步拼接提供定位信息，但是随着反应轮数增加，序列长度和质量均有所下降，而且在阅读AT区时有明显错误倾向。SOLiD基于双碱基编码系统的纠错能力以及较高的测序通量，适合转录本研究以及比较基因组学特别是SNP检测等，但是测序的片段短限制了该技术在基因组拼接中的广泛应用。第三代测序技术目前正在研发阶段，尚未正式投入使用。,部分参考文献阅读,Genome re-sequencing van Orsouw N J, Hogers R C, Janssen A, et al. Complexity reduction of polymorphic sequences (CRoPS): a novel approach for large-scale polymorphism discovery in complex genomes. PLoS ONE, 2007, 2(11): e1172Hillier L W, Marth G T, Quinlan A R, et al. Whole-genome sequencing and variant discovery in C. elegans. Nat Methods, 2008, 5(2): 183188Transcriptome re-sequencingMortazavi A, Williams B A, McCue K, et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods, 2008, 5(7): 621628Sugarbaker D J, Richards W G, Gordon G J, et al. Transcriptome sequencing of malignant pleural mesothelioma tumors. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(9): 35213526 Digital expression profilingRuby J G, Jan C, Player C, et al. Large-scale sequencing reveals 21U-RNAs and additional microRNAs and endogenous siRNAs in C. elegans. Cell, 2006, 127(6): 11931207Morin R D, OConnor M D, Griffith M, et al. Application of massively parallel sequencing to microRNA profiling and discovery in human embryonic stem cells. Genome Res, 2008, 18(4): 610621ChIP-seqJohnson D S, Mortazavi A, Myers R M, et al. Gen