原粮霉菌毒素检测手册

原原 粮粮 霉霉 菌菌 毒毒 素素 检检 测测 实实 用用 操操 作作 手手 册册 江苏省微生物研究所有限公司编制 二 六年四月 无锡 一 一 样品的采集 制备及保存样品的采集 制备及保存 1 样品的采集 样品的概念 按照规定的方法及使用适当的工具 采取一定数量的具有 代表整体质量的部分 以供分析检验用 该部分叫做样品 采样的过程 检样 原始样品 平均样品 试验样品 试样 采样的类型 选择性采样 客观性采样 采集后的处理 附上标签 注明名称 日期 数量 采样地点及方法 签封并登记 2 样品的制备 原始样品的分取 粉碎 混匀 缩分的过程 注意防止成份的变化及交叉污 染 常用的制备方法 机械混匀法 四分法 分样器法 粉碎 过筛法 研磨法 搅拌法 3 样品的保存 当天采集的样品原则上当天测 使用的容器应用 2 的次氯酸钠水溶液浸泡后 再洗干净晾干或烘干备用 一般样品检验结束后保留样品 1 个月 以备复查 二 二 待测液的制备待测液的制备 1 黄曲霉毒素 B1待测液的制备 称量 准确称取 5 0g 均匀的粉碎样品 提取 用甲醇水 1 1 溶液 25ml 来振荡提取半小时 过滤 稀释 取滤液 1ml 用甲醇水 1 1 进行稀释 记好稀释倍数 储藏 稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存 放置冰箱中 避 光保存 隔天检测 冰箱中放置最好不超过两天 2 呕吐毒素 DON 待测液的制备 称量 准确称取 5 0g 均匀的粉碎样品 提取 用甲醇水 1 9 溶液 25ml 来振荡提取半小时 过滤 稀释 取滤液 1ml 用甲醇水 1 9 进行稀释 记好稀释倍数 储藏 稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存 放置冰箱中 避 光保存 隔天检测 冰箱中放置最好不超过两天 3 玉米赤霉烯酮 ZEN 待测液的制备 称量 准确称取 5 0g 均匀的粉碎样品 提取 用甲醇水 7 3 溶液 20ml 来振荡提取半小时 过滤 稀释 取滤液 1ml 用甲醇水 7 3 进行稀释 记好稀释倍数 储藏 稀释好的待测液直接进行检测或具塞小试管封存 放置冰箱中 避光保存 隔天检测 冰箱中放置最好不超过两天 三 三 大量样品的集中初筛 大量样品的集中初筛 1 黄曲霉毒素 B1定性测定法 注意点 稀释 取滤液 1ml 用甲醇水 1 1 进行稀释 记好稀释倍数 依据国家 对小麦 玉米 花生 中限量标准来进行适当稀释 比如 玉米中 国家标准最大允许量为 20ug kg 那么滤液应稀释 4 倍 允许量除 以 5 试剂的配制 酶标抗原 洗涤液 实验设计 截取相当数量的反应孔 设定三个对照孔 仪器调零孔 阴性 对照孔 阳性对照孔 1 0ng ml 其余为样品孔 一般一次性测 21 个样品 以防操作时间过长带来的误差 显色后先目测 比较样品孔和阳性孔的颜色 若阳性孔的颜色深于样品孔 则样品孔的浓度大于 1 0 样品超标 加终止液 酶标仪测出吸光度 作为原始记录 2 呕吐毒素 DON 定性测定法 注意点 稀释 取滤液 1ml 用甲醇水 1 9 进行稀释 记好稀释倍数 依据国 家对小麦 玉米 大麦 中限量标准来进行适当稀释 比如 国家标准 最大允许量为 1000ug kg 那么滤液应稀释 2 倍 与浓度为 100ng ml 的 标准点进行比较 试剂的配制 酶标二抗 洗涤液 DON 单克隆抗体 实验设计 截取相当数量的反应孔 设定 2 个对照孔 阴性对照孔 0ng ml 阳性对照孔 100ng ml 其余为样品孔 一般一次性测 21 个样品 以防操作时间过长带来的误差 洗涤 该实验中有两次洗涤 请严格按洗涤程序进行 显色后先目测 比较样品孔和阳性孔的颜色 若阳性孔的颜色深于样品孔 则样品孔的浓度大于 100 样品超标 加终止液 酶标仪测出吸光度 作为原始记录 3 玉米赤霉烯酮 ZEN 定性测定法 注意点 稀释 取滤液 1ml 用甲醇水 7 3 进行稀释 记好稀释倍数 依据国 家对小麦 玉米中限量标准来进行适当稀释 比如 国家标准最大允许 量为 60ug kg 那么滤液应稀释 3 倍 与浓度为 5ng ml 的标准点进行比 较 试剂的配制 酶标二抗 洗涤液 DON 单克隆抗体 实验设计 截取相当数量的反应孔 设定 2 个对照孔 阴性对照孔 0ng ml 阳性对照孔 5ng ml 其余为样品孔 一般一次性测 21 个 样品 以防操作时间过长带来的误差 洗涤 该实验中有两次洗涤 请严格按洗涤程序进行 显色后先目测 比较样品孔和阳性孔的颜色 若阳性孔的颜色深于样品孔 则样品孔的浓度大于 5 样品超标 加终止液 酶标仪测出吸光度 作为原始记录 四 四 阳性样品的定量检测 阳性样品的定量检测 1 黄曲霉毒素 B1定量测定法 样品主要为超标样品 通常重新提取 样品并制备待测液 注意点 稀释 取滤液 1ml 用甲醇水 1 1 进行稀释 依据国家对小麦 玉米 花生 中限量标准来进行适当稀释 比如 玉米中国家标准最大允许量 为 20ug kg 那么滤液本应稀释 4 倍 允许量除以 5 但是因超标 所 以加大稀释倍数 一般将上述稀释液再进行稀释 2 5 倍即可 试剂的配制 酶标抗原 洗涤液 实验设计 截取相当数量的反应孔 设定标准曲线孔 0 0 1 0 5 1 0 5 0ng ml 其余为样品孔 酶标仪测出吸光度 作为原始记录 软件计算 2 呕吐毒素 DON 定量测定法 样品主要为超标样品 通常重新提取 样品并制备待测液 注意点 稀释 取滤液 1ml 用甲醇水 1 9 进行稀释 依据国家对小麦 玉米 大麦 中限量标准来进行适当稀释 比如 国家标准最大允许量为 1000ug kg 那么滤液本应稀释 2 倍 但是因超标 所以加大稀释倍数 一般将上述稀释液再进行稀释 2 4 倍即可 试剂的配制 酶标二抗 洗涤液 DON 单克隆抗体 实验设计 截取相当数量的反应孔 设定标准曲线孔 0 10 100 500 1000ng ml 其余为样品孔 酶标仪测出吸光度 作为原始记录 软件计算 3 玉米赤霉烯酮 ZEN 定量测定法 样品主要为超标样品 通常重新 提取样品并制备待测液 注意点 稀释 取滤液 1ml 用甲醇水 7 3 进行稀释 依据国家对小麦 玉米中 限量标准来进行适当稀释 比如 国家标准最大允许量为 60ug kg 那么 滤液本应稀释 3 倍 但是因超标 所以加大稀释倍数 一般将上述稀释 液再进行稀释 5 倍即可 试剂的配制 酶标二抗 洗涤液 DON 单克隆抗体 实验设计 截取相当数量的反应孔 设定标准曲线孔 0 1 0 2 5 5 0 10 50ng ml 其余为样品孔 酶标仪测出吸光度 作为原始记录 软件计算 五 五 实验中注意事项 实验中注意事项 1 水 请用实验室用水 蒸馏水 2 标准品或提取液使用前 摇匀 3 移液器吸头不得重复使用 4 终止液加入后 轻轻振摇 1 2 分钟 然后测定吸光度值 因考虑到颜色变化 有延迟时间 5 试剂保存 2 8 冷藏 酶标二抗和单克隆抗体血清管需冷冻储存 6 大量样品检测时 为避免操作时间过长而引起的误差 请尽量使用排式移液 器 六 六 软件计算中的问题 软件计算中的问题 1 软件绘制的曲线评价 A0 1 A0的值在 30 左右 拟合的曲线上对应浓度和标 准浓度的相对偏差在 5 以内 2 软件计算中稀释倍数的确定 滤液的稀释倍数 D C V D AFB1含量 g kg m 式中 C 从标准曲线上查得的 AFB1的含量 ng ml V 样品提取液体积 ml D 样品稀释倍数 m 样品的质量 g 注 若软件中已经将稀释倍数输入 则最后计算公式中不能将注 若软件中已经将稀释倍数输入 则最后计算公式中不能将 D 再代入计算 再代入计算 七 七 试剂盒集中采购 价格的优惠政策 试剂盒集中采购 价格的优惠政策 1 根据 全国原粮卫生专项调查任务计划表 来统计相应的试剂盒数量 2 采购时请一定说明定量或定性检测试剂盒 3 免费提供相关证书及资质证明 八 八 粮食卫生标准粮食卫生标准 GB2715 2005 项目项目指标 指标 g kg 黄曲霉毒素 B1 玉米 大米 其他 20 10 5 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 DON 小麦 大麦 玉米及其成品粮 1000 玉米赤霉烯酮