张老师毒理致癌

,毒理学基础第八章 外源化学物致癌作用,郑州大学公共卫生学院 毒理学教研室（Room 504）张 巧,2,2,第八章 外源化学物致癌作用,一 、 掌握基本概念化学致癌物如何分类试验方法分类及常用的试验方法二 、熟悉化学致癌的多阶段学说化学致癌的分子机制,3,内 容 提 要,第一节 概述第二节 化学致癌过程第三节 化学致癌机制第四节 化学致癌相关的分子事件第五节 化学致癌物的分类第六节 化学致癌物筛查的基本方法,4,威胁人类健康的致癌因素可分： 化学因素 物理因素 生物因素 其中化学因素居首要地位。,致癌因素,第一节 概述,5,化学致癌因素,化学致癌物（chemical carcinogen）： 能诱发机体（动物和人）发生肿瘤，增加其发病率和死亡率的化学物质。化学致癌作用(chemical carcinogenesis)：化学物质引起或诱导正常细胞发生恶性转化并发展为肿瘤的过程。,6,细胞癌变的多阶段学说,第二节 化学致癌过程,7,1.引发阶段（启动阶段）,引发剂（initiator）：具有引发作用的物质。单个细胞的突变：引发细胞（initiated cell）机制:在正常细胞的分裂增殖过程中,其基因受到外来因素作用而发生突变.此突变又经细胞分裂增殖而固定下来,并传给子代细胞,从而启动细胞的癌变.特点是作用快、过程短、不可逆,细胞DNA产生永久性改变。,三阶段学说,8,2.促长阶段,是刺激已引发的细胞异常分裂生长阶段促长剂（promotor）：有促进引发形成细胞分裂生长作用的物质。促癌剂机制：promotor无遗传毒性作用，它作用的靶点主要是在细胞膜，使其产生改变而促进细胞分裂。特点是作用慢，所需时间长，且早期具有可逆性，与引发缺一不可，且必在引发之后；,三阶段学说,9,3.进展阶段,该阶段位于promotion stage之中或其后不可逆的遗传学改变标志：恶性变化，遗传不稳定增加细胞在形态、功能、代谢及行为方面逐渐表现出癌的特征：,易转移生化、免疫性能的改变,生长快侵袭性强,三阶段学说,10,肿瘤的发生是致癌因素与个体遗传易感性共同决定的。遗传易感性基因的遗传多态性单核苷酸多态性 SNPsingle nucleotide polymorphisms,11,基因的SNP位点与肿瘤易感性的关系相酶的基因多态性(P450)相酶的基因多态性 (GSH ) DNA修复酶的基因多态性,12,第三节 化学致癌机制,一、体细胞突变学说 二、非突变致癌机制,共同作用的结果,13,致癌物活化代谢后生成的DNA加合物诱导基因突变；大多数的致癌物在致突变实验中呈阳性;DNA修复缺陷可以导致肿瘤发生,如着色性干皮病、毛细血管扩张性共济失调等;,一、体细胞突变学说,14,在许多肿瘤组织中发生染色体畸变或基因组不稳定性；肿瘤细胞来源于单细胞克隆；癌基因的突变以及抑癌基因突变或缺失在肿瘤细胞中普遍存在，且突变的基因型可通过细胞分裂传递给子代细胞。,一、体细胞突变学说,15,DNA加合物DNA修复与化学致癌癌基因、原癌基因、抑癌基因,一、体细胞突变学说,16,属于遗传毒性机制(DNA损伤的主要形式)加合物的位置、量与性质决定后果可导致碱基突变、插入、缺失、交联、断裂等后果，部分突变恶化。,（一）DNA加合物,一、体细胞突变学说,17,（二）癌基因、原癌基因、抑癌基因,癌基因（oncogene）：在自然或实验条件下可以诱发恶性转化的潜在基因。是化学致癌物作用的主要靶分子，在细胞癌变过程中起关键作用。原癌基因（proto-oncogene）：机体内正常细胞所具有的能致癌的遗传信息。正常情况下对细胞具有重要的生物学功能抑癌基因,一、体细胞突变学说,18,（三）DNA修复与化学致癌,人体细胞数1014个，每个细胞内DNA每日出现的损伤数可达4000之多。损伤后可出现下列情况:(1).严重时导致cell death;(2).损伤被修复;(3).引起突变.,正确修复(error proof repair),易错修复(error prone repair),一、体细胞突变学说,19,基因的结构(DNA序列)没有发生改变基因表达调控异常与肿瘤发生多水平调控（基因组、转录、翻译）,二、非突变致癌机制,20,(一)表观遗传调控失常(二)细胞异常增生(三)免疫抑制(四)内分泌激素失衡(五)过氧化酶体增殖剂激活受体,二、非突变致癌机制,21,第四节 化学致癌相关的分子事件,一、基因突变 二、端粒调控与细胞永生化 三、细胞周期调控紊乱 四、细胞凋亡与肿瘤发生,22,癌基因；抑癌基因；DNA修复酶基因；凋亡相关基因；维持基因组稳定相关基因。,化学致癌相关的分子事件,一、基因突变,23,端粒是真核生物染色体末端的特殊结构，人类端粒是由1015Kb的重复序列（TTAGGG）组成。端粒的长度与有丝分裂次数相关。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，由RNA和蛋白质组成，具有逆转录酶的功能，能以自身的RNA为模板合成端粒DNA，从而维持端粒的长度。,化学致癌相关的分子事件,二、端粒调控与细胞永生化,24,端粒酶的激活可使端粒长度保持相对稳定，从而使细胞获得无限增殖的能力。大多数肿瘤组织中可以检测到端粒酶的活性端粒酶激活可能发生在肿瘤的早期阶段证明端粒酶的激活与恶性肿瘤的发生密切相关。,化学致癌相关的分子事件,二、端粒调控与细胞永生化,25,细胞增生过程由细胞周期(cell cyc1e)来完成。细胞周期调控的核心成员是细胞周期素cyclin，周期素依赖性蛋白激酶(cyclin dependent kinases, CDKs)和CDK的抑制性蛋白(CDK inhibitor, CDKI)G1-S转换关卡是肿瘤形成最为关键的控制点.,化学致癌相关的分子事件,三、细胞周期调控紊乱,26,细胞凋亡(apoptosis)是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制的控制自动结束生命的过程，是一种自然的生理过程。是机体为了清除多余的、有害的、已经完成使命的细胞，维持机体的稳态所启动的系统。,化学致癌相关的分子事件,四、细胞凋亡与肿瘤发生,27,外源化学物在诱导肿瘤发生过程，通过改变上述基因的表达和功能，干扰细胞的正常凋亡过程，使本该清除掉的受损细胞得以保留下来，受损细胞中携带的突变得以固定和传递。,化学致癌相关的分子事件,四、细胞凋亡与肿瘤发生,28,第五节 化学致癌物分类,根据对人类和动物的癌作用分类根据化学致癌作用模式/机制分类,29,对人致癌性证据对实验动物致癌性证据,根据致癌作用分类,国际癌症研究中心IARC：International Agency for Research on Cancer将致癌证据资料分为4级：,30,组1.对人类是致癌物组2A.对人类很可能(probably)是致癌物组2B.对人类可能(possible)是致癌物组3. 未分类：组4.人类可能非致癌物,根据致癌作用分类,因此将致癌物分为四组,31,第1类：第1A类：已知对人类有致癌可能第1 B类：假定对人类有致癌可能第2类： 可疑的人类致癌物,根据致癌作用分类,GSH：Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemical全球化学品统一分类和标签制度对化学致癌物的分类：,32,1. 遗传毒性致癌物genotoxic carcinogentargetDNA2. 表观遗传毒性致癌物 epigenotoxic carcinogentargetDNA外其它大分子3. 未分类,根据化学致癌作用模式分类,33,1.遗传毒性致癌物（genotoxic carcinogen）,定义：能与细胞DNA共价结合，引起机体遗传物质改变，导致癌变的化学物质分类直接致癌物（direct caicinogen）间接致癌物（indirect caicinogen）无机致癌物 : 镍、铬、镉、钛、锰、砷等,34,直接致癌物：有些致癌物可以不经过代谢活化就具有致癌活性，直接与细胞生物大分子（DNA、RNA、Protein）作用而诱导细胞癌变。称为直接致癌物。这类化学物都是亲电子反应物，易与高电子密度的细胞生物大分子发生反应，如各种烷化剂和金属致癌物等。,35,间接致癌物：这类化学物进入机体后，需要经过细胞内微粒体混合功能氧化酶代谢活化后才具有致癌性。大多数致癌性化学物属于此类。多环芳烃类、芳香胺类、亚硝胺类、致癌性霉菌毒素(Carcinogenic mycotoxin),36,前致癌物（precarcinogens）：不直接致癌，经代谢转化才具致癌作用的物质。,终致癌物（ultimate carcinogens）：直接致癌物和间接致癌物代谢活化所形成的具有致癌作用的代谢产物的统称。,近致癌物（proximate carcinogens）：前致癌物代谢活化过程中一种或一系列中间代谢产物,1.遗传毒性致癌物（genotoxic carcinogen）,37,2.表观遗传毒性致癌物 （epigenotoxic carcinogen）,促长剂 ：本身无致癌性，在给以遗传毒性致癌物之后再给以促长剂可增强遗传毒性致癌物的作用，也可促进转化细胞发展成癌。佛波酯 (TPA)：小鼠皮肤癌；苯巴比妥：大鼠肝癌;糖精：膀胱癌巴豆油(croton oil)、煤焦油中的酚类、卤代烃等,38,2.表观遗传毒性致癌物 （epigenotoxic carcinogen）,内分泌调控剂 :改变内分泌系统平衡及细胞正常分化，常起促长剂作用。乙烯雌酚(使女儿在青春期发生阴道透明细胞癌)；子代睾丸癌风险增加雌二醇硫脲类,39,2.表观遗传毒性致癌物 （epigenotoxic carcinogen）,免疫抑制剂 ：主要对病毒诱导的细胞恶性转化起增强作用。嘌呤同型物硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤(白血病/淋巴瘤) 细胞毒剂 ：可引起细胞死亡，导致细胞增殖活跃及癌发展 次氮基三乙酸、氯仿,40,2.表观遗传毒性致癌物 （epigenotoxic carcinogen）,过氧化物酶体增殖剂： 导致细胞内氧自由基过量生成安妥明、氯贝丁酯、降脂异丙酯（肝肿瘤）固态物质:其物理状态可能涉及细胞毒性塑料(肉瘤)；石棉(胸膜间皮瘤),41,3.未分类,有不少致癌物未能证明损伤DNA，但又对其作用所知有限，不足以归入非遗传毒性致癌物一类。如四氯化碳、某些多氯烷烃和烯烃等。另外，硫乙酰胺、硫脲嘧啶和噻吡二胺等都有致癌性。助致癌物(co-carcinogen )： 乙醇、二氧化硫等,42,定性：化学物质能否致癌；定量：剂量反应关系分析，判断可接受的危险度剂量或人体实际能接触剂量下的危险度。,第六节 化学致癌物筛查的基本方法,43,评价致癌性的两类主要证据,人群流行病学调查 动物试验 （GLP),44,定量构效关系分析遗传毒性试验；细胞恶性转化试验；哺乳动物致癌试验促癌剂检测转基因或基因敲除动物致癌物筛查系统人类流行病学调察。 需取长补短，互为补充。,目前所用系统主要有,45,定量构效关系（quantitative structure-activity relationships，QSAR）利用理论计算和统计分析工具来研究化合物结构与其生物学效应之间的定量关系。首先从有害物质的化学结构特点来评估化合物潜在的致癌危险性。构效关系分析快速、经济、有效。,一、定量构效关系分析,46,致突变试验,致突变试验是依据大多数致癌物具有致突变性而大多数非致癌物无致突变性来对受试物进行致突变检测。筛检阳性的受试物可能是具有遗传毒性的致癌物，也可能是具有遗传毒性的非致癌物；阴性的受试物可能是非遗传毒性的非致癌物，还有可能是非遗传毒性的致癌物。,二、遗传毒性试验,47,要点1.试验组合 应反映多个终点。有一种试验阳性，即可认为该受试物为致突变物，因而就可能是遗传毒性致癌物。组合中出现阳性越多，受试物致癌可能性就越大。,二、遗传毒性试验,48,我国食品安全性毒理学评价程序中的致突变试验组合有体外试验和整体试验。体外试验中Ames试验为必做项目。在整体试验中，可在微核试验和骨髓细胞染色体畸变中任选一项；在显性致死试验和睾丸生殖细胞染色体畸变分析中任选一项。,二、遗传毒性试验,49,细胞恶性转化 cell malignant transformation指外源因素对体外培养的细胞所诱发的恶性表型改变，包括细胞形态、细胞增殖速度、生长特性(锚着独立性生长或接触抑制消失等)、染色体畸变等变化，当细胞接种在裸鼠皮下可形成肉眼可见的肿瘤。,三、细胞恶性转化试验,50,本试验的观察终点是细胞的恶性变，如将此种细胞移植于动物体内可形成肿瘤。 可检测遗传毒性致癌物和非遗传毒性致癌物,三、细胞恶性转化试验,51,(1) 体外容易培养和传代，阴性细胞克隆背景较低；(2) 细胞自发突变率低或自发转化能力很弱，动物裸鼠试验呈阴性；(3) 已获无限生长能力，但仍保持接触抑制而无致瘤性。,三、细胞恶性转化试验,细胞选择的原则,52,有限的动物试验：limited in vivo bioassay是指在有限的短时间内完成而不是终生，又指观察的靶器官限定为一个而不是全部器官和组织。周期短，可解决致突变试验的假阴性问题。,四、哺乳动物致癌试验,（一）哺乳动物短期致癌试验,53,小鼠肺肿瘤诱发试验大鼠肝转变灶诱发试验小鼠皮肤肿瘤诱发试验雌性SD大鼠乳腺癌诱发试验 由于肺和肝是最常见的发生肿瘤器官，也是许多致癌物的靶器官，因此小鼠肺肿瘤和大鼠肝转变灶试验的应用价值较高。,哺乳动物短期致癌试验举例,54,一般认为其对判断化学物致癌性具有较高价值，不仅短期试验不能取代之，即使是人类流行病学资料单独可证实，但动物模型对于阐明机理，研究有关作用因素有不可缺少的作用。,四、哺乳动物致癌试验,（二）哺乳动物长期致癌试验,55,哺乳动物长期致癌试验又称哺乳动物终生试验（life-time test)，是目前公认的确证动物致癌物的经典方法，较为可靠。,四、哺乳动物致癌试验,（二）哺乳动物长期致癌试验,56,化学致癌的一个最大特点是潜伏期长，在啮齿动物进行1至2年的试验即相当于人类大半生时间。如果用流行病学调查方法确证一种新化学物的致癌性，一般需要人类接触受试物20年后才能进行。,四、哺乳动物致癌试验,（二）哺乳动物长期致癌试验,57,1. 动物选择,在致癌试验中选择动物最重要的依据是对诱发肿瘤的易感性。因此，要考虑物种、品系、年龄和性别。,哺乳动物长期致癌试验,58,1. 动物选择,哺乳动物长期致癌试验,物种的选择对受试物有特定的靶器官时尤为重要。如大鼠对诱发肝癌敏感，小鼠对诱发肺肿瘤敏感。品系也不同。如同是小鼠，A系及亚系诱发肺肿瘤敏感。还应考虑自发肿瘤，应选自发率较低者。年龄多使用断乳或断乳不久的动物，性别一般是雌雄各半。,59,2. 动物数量,哺乳动物长期致癌试验,为避免假阴性，每组动物数较一般毒性试验为多。肿瘤自发率较高时或肿瘤发生率较低时，均应增加动物数。一般提出每组最少50只动物。,60,3.剂量设计,哺乳动物长期致癌试验,对照组试验组：一般使用三个剂量。包括无作用剂量组、阈剂量组、发生肿瘤剂量组（最高剂量）较低剂量为前一级较高剂量的1/3至1/4，最低剂量最好相当于或低于人类实际可能接触的剂量。最高剂量应为最大耐受量(Maximum Tolerated Dose, MTD)。,61,3.剂量设计,哺乳动物长期致癌试验,理想的最大耐受量不应致死，也不引起可能缩短寿命的毒性表现和病理改变，与对照组相比体重下降不大于10%。,62,4. 试验期限与染毒时间,哺乳动物长期致癌试验,原则上试验期限要求长期或终生。一般情况下小鼠最少1.5年，大鼠2年；可能时分别延长至2年和2.5年。一般主张一直染毒至试验结束。但也有人认为，为减少中途非肿瘤死亡，应在9至12月后即停止染毒，以便使动物可由中毒或亚中毒状态恢复，存活时间较长和存活动物也较多。对于完全致癌物无较多影响，对于促癌剂有可能出现可逆过程，以至肿瘤发生率下降。,63,5. 结果的观察、分析和评定,哺乳动物长期致癌试验,1. 肿瘤发生率：最重要的指标；2. 多发性：指一个动物出现多个肿瘤或一个器官出现多个