聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶

生物化学实验 Biochemistry Experiment 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶 （活性染色鉴定法）,每2组取3支消化管，按下表操作 编号 1 （空白） 2（样品） 3（标准） 试剂处理 RNA样品液 /mL 1 标准磷原液 /mL 1 去离子水 /mL 1 5mol/LH2SO4 /mL 2 2 2 加小漏斗，300加热沸腾10分钟，250左右继续 消化34小时至溶液透明，冷却，待用。,RNA样品的消化（为下周实验做准备）,电泳装置,采用北京六一仪器厂的DYC型垂直板电泳装置： 制胶装置 制备凝胶板 电泳装置 进行凝胶电泳 每组（2人）做一块胶，两组共用一套电泳装置，两套电泳槽共用一台电泳仪。,三、【操作步骤】,凝胶模由两块玻璃板（一块长板，一块短板）和一个密封框组成，将它们按下图组装，四周对齐，注意手指勿接触两块玻璃板内侧的灌胶面，注意间隔条的安装。注意：玻璃板（用海绵及洗洁精清洗）和梳子及密封框一定要清洗干净。,1、安装制胶装置,不能偷懒,短板（凹形玻璃板）,长板（带间隔条玻板）,密封条（封胶条）,样品槽模板（梳子）,垂直板电泳装置制胶装置组件,安装膜具,装封胶条，注意封胶条平面朝下，不能有裂口,盖上凹玻璃,将凹玻璃冲外装进槽里,将楔子插进，将底部插紧,2、配制凝胶液三组按照表中的比例和顺序在小烧杯中配制凝胶溶液，加入AP后，立即混匀。制备连续聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方（三组）,3、灌胶液,沿玻璃板尽快加入两块玻璃板之间的缝隙中，注意不要有气泡，当凝胶液面距短板上缘0.3 cm时，立即轻轻将样品槽模板插入凝胶溶液中，注意样品槽中不要有气泡，凝胶溶液应充满样品槽间隙。制胶装置室温垂直放置，3060 min聚合反应完成。,注意：胶头滴管中的剩余胶液一定要挤出去,插入梳子,4、安装电泳槽,胶聚合后，拔起锲形固定板，取出夹有凝胶的玻板，取下凹形密封条，将凹形玻板侧朝内放入电泳槽架，重新用锲形板固定，密封不漏液。每槽取稀释10倍的电极缓冲液350mL，小心加入负极槽(内槽)约150mL，使其浸没过凹形玻板进入样品槽。双手轻轻、垂直、均匀用力拔出样品槽梳子。,注意：不能漏水,胶凝后用夹子将玻璃夹出,用夹子夹紧玻璃将封胶条轻轻撕掉,旋转180度，凹玻璃向里,将玻璃放进槽内,加缓冲液,小心将微量注射器伸入样品槽底部上方，不要扎到凝胶，分别在每个加样槽内按下列顺序和体积慢慢推入蓝色样品液(含蔗糖和少量溴酚蓝)，使其沉降到底部形成集中窄的蓝带。每位同学加四种，两边的槽不加。 心肌 脑 骨骼肌 肝 心肌 脑 骨骼肌 肝 5L 10L 5L 3L 5L 10L 5L 3L,5、 加样,将电泳槽架放入电泳槽内，倒入其余的电极缓冲液至正极槽(外槽)，按正负极位置放上电泳槽盖，盖紧，并按正负极连接上电泳仪。用稳压挡将电压调至80V，待样品蓝带全部进胶后，调高电压至150V，继续电泳，当指示剂溴酚蓝的蓝带泳动至胶底部并出胶后半小时到40分钟，关闭电源，停止电泳，前后共约2.5-3小时。,6、电泳,电泳进行中,1. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)原理和有关同工酶的知识。2. 掌握连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色的操作技术。,一、【实验目的】,（一）. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,1. 电泳定义和蛋白质电泳基本原理 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。 许多生物分子都可带电荷，如蛋白质、核酸等，这些带电胶体颗粒在电场中均可移动。以蛋白质为例，根据已学生化知识，蛋白质在小于或大于其等电点的pH时，可带不同的净电荷，所以也有电泳现象。不同蛋白质质点带电性质、带电量多少、质点大小、形状都不同，决定了各自在电场中移动速率和距离不相同，因而互相之间得以分离。,二、【实验原理】,蛋白质分子,COOH,COO,NH3,NH3,蛋白质分子,蛋白质分子,COO,COO,COO,COO,NH2,NH3,NH3,NH3,H+,H+,H+,H+,移向负极,移向正极,（总电荷：）,（总电荷：）,（总电荷：0）,pHpI,pHpI,pH=pI,不同pH条件下蛋白质分子在电场中运动状态示意图,2. 区带电泳 在一些惰性支持介质上进行电泳，电泳后不同组分由于带电多少不同，移动距离不同，在支持物上形成带状区间。 常见的惰性支持物有： 滤纸 称纸电泳 醋酸纤维素薄膜 薄膜电泳 淀粉、琼脂(糖)、聚丙烯酰胺凝胶 凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的区带电泳。,3. 聚丙烯酰胺凝胶的形成与结构 *主要成分 单体：丙烯酰胺(Acr)交联剂：N,N- 甲叉双丙烯酰胺(Bis)聚合反应 AP-TEMED催化体系：过硫酸铵 (AP) 催化剂四甲基乙二胺 (TEMED) 加速剂*结构 三维网状结构的凝胶,聚合反应过程AP-TMTED催化体系,TEMED催化AP生成硫酸自由基： 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链： Bis将单体长链间连成网状结构：,丙烯酰胺,N, N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响： 催化剂和加速剂的浓度 应选择合适的AP和TEMED浓度使聚合时间控制在3060min内较好，过量的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的畸变。 pH TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，在酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发AP产生自由基的过程会被延迟，聚合时间延长。,温度 聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快，而聚合的速度影响交联孔径的大小，所以凝胶聚合时必须保持温度恒定，通常用与电泳相同的温度。 分子氧 分子氧的存在会阻止碳链的延长，妨碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。 杂质 某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶的化学聚合，所以应选择高纯度的Acr、Bis和AP。,4、凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响,凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的总质量浓度，C为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的质量分数。 式中，a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积(mL)。 凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹性并且透明。,凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效孔径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力不同，加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同得以分离。在实际工作中，常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度，使蛋白质混合物得到最大限度的分离，大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的结果，所以这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时，常用标准胶或梯度凝胶来测试，而后确定适宜的凝胶浓度。,5、蛋白质、核酸在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离原理,净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其亚基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场中泳动的速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质的pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称为阴极电泳。,蛋白质在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素,电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同,电荷因素分子大小分子形状,6. 聚丙烯酰胺凝胶电泳类型 （1）按电泳槽形式不同分 管状 垂直板型 ( 蛋白质、核酸分离 ) 水平板型 ( 核酸分离 ),几种常见的电泳槽,(2) 按制胶方式不同分 连续系统 只有一层 分离胶， 浓度均一。 不连续系统 制二层胶 分离胶 高浓度，浓度均一。浓缩胶 低浓度,(3) 按分离原理不同分： * 常规PAGE也称天然状态生物分子PAGE ， 即在电泳过程中，生物分子如蛋白质仍保持天然构象、亚基之间的相互作用及生物学活性。是根据被分离组分的电荷、大小和形状三种因数综合效果进行分离。用于蛋白质、核酸一般分离分析。 * SDS-PAGE 根据被分离物的分子量大小差异进行分离，多用于测定蛋白质分子量。,* IEF-PAGE 根据被分离物的等电点差异进行分离，亦称等电聚焦电泳，如等电点不同的蛋白质，在一个pH值连续变化的PAG中电泳后，分别聚集在其等电点的pH处形成区带，因而得以分离。多用于测定蛋白质等电点。* 浓度梯度-PAGE 分离胶为浓度梯度胶，即胶浓度呈均匀增加，根据分子大小进行分离。多用于测定蛋白质分子量。,（二）. PAGE分离乳酸脱氢酶(LDH)同工酶原理,1、同工酶概念 催化相同化学反应，但其酶蛋白的结构、组成略有不同，表现出理化性质和动力学性质不同的一组酶。2、LDH同工酶催化的反应,1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶(LDH)分离出5条区带，由阳极到阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶的概念。目前已知LDH同工酶是由H和M亚基按不同比例组成的四聚体。 LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中LDH同工酶各组分含量不同。临床上对LDH及同工酶的检测可作为某些疾病诊断的依据之一。,LDH同工酶亚基的聚合,3、乳酸脱氢酶同工酶活性染色原理,(1) 电泳染色方法 不同物质染色方法不同，如核酸与蛋白质不同，不同蛋白质之间也不同如糖蛋白与脂蛋白，蛋白质染色方法很多：* 一般染色方法 是利用某些染料如氨基黑、考马斯亮蓝、或银液与蛋白质结合形成黑色或蓝色条带，显示出蛋白质区带位置，其专一性不强，凡系蛋白质均可呈色。* 特殊染色法 如针对糖蛋白或脂蛋白的染色法，针对不同酶的活性染色法。,(2) 酶活性染色法 利用该酶催化特定化学反应后，产 物直接与特定的染料反应，生成颜色而显色，或再发生其它反应，最终生成有色物显色。酶活染色法利用该酶活性显色，所以专一性强，一种方法只适用于一种酶蛋白，使其显色而其它蛋白并不被显色。,(3) LDH同工酶活性染色法原理,用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色液中，LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)作为电子的中间载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体，底物脱下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫色的不溶于水的物质以对LDH定位。反应式如下：,4、LDH同工酶谱分析的临床应用 同工酶有组织特异性，在心、肾和红细胞中相对含量高，在肝、肌肉及某些癌组织中相对含量较高，因此，同工酶相对含量的改变在一定程度上反应了某些脏器的功能状况。临床医学常利用这些同工酶有血清中相对含量的改变作为某脏器病变鉴别诊断的参考。,临床医学参考数据,（1）急性心肌梗塞发作后，早期血清中LDH1和LDH2活性均升高，但LDH1增高更早，更明显，导致LDH1/LDH2的比值升高。（2）肝炎、急性肝细胞损伤及骨骼肌损伤时LDH5都会升高。（3）患活动性风湿性心脏病、急性病毒性心肌炎、溶血性贫血、肾坏死等病LDH1也可升高。（4）恶性病变时LDH3常增高。,7、活性染色，脱色： 电泳结束后，将凝胶板取下，用薄尺子轻轻将玻璃板撬开，在凝胶下部切角标注凝胶方位，然后将带有凝胶的板反扣过来，胶面朝下，用尺子小心地将凝胶的一角剥离，使凝胶掉入装有活性染色液的培养皿中。轻轻摇动培养皿，使凝胶完全浸泡在染色液中，染色过程注意避光，待大多数条带显现蓝紫色时除去染色液，显色时间一般为1530 min。加入脱色液终止酶促反应，摇动35 min，凝胶底色脱去直至背景清亮。,三、【操作步骤】,剥 胶,电泳结果实例,PAGE分离小鼠LDH同工酶活性染色结果 1.骨骼肌；2.心肌；3.肝脏；4.脑,往届学生 PAGE分离小鼠LDH同工酶活性染色结果 1.心肌；2.骨骼肌；3.脑；4.肝脏,1 2 3 4,8、固定 倒去脱色液，加入15mL保存液，浸泡凝胶固定15分钟。另取2张玻璃纸也浸泡于保存液中。附：制干胶 用两张玻璃纸将凝胶制成夹心式干胶，待凝胶干透后，取下玻璃板即可得到平整透明