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第六章 动物基因组学基础 1 基本概念 遗传标记 GeneticMarkers 是指能够用以区别生物个体或群体及其特定基因型 并能稳定遗传的物质标志 遗传多态性 GeneticPolymorphisms 是指一个基因座位在群体中存在两个或更多类的等位基因的现象 标记辅助选择 Marker assistedSelection MAS 就是对特定的主效基因 majorgene 或者数量性状位点 QuantitativeTraitLoci QTL 在遗传标记的辅助下区分其基因型 并在此基础上应用于家畜的育种实践 2 第一节动物遗传标记 一 遗传标记的发展形态学标记 毛色 冠型 体型细胞遗传标记 染色体核型 带型生化遗传标记 血型 蛋白质型分子遗传标记 基因 非基因 3 二 分子遗传标记 AABBBBABAAAABB RFLP 限制性片段长度多态性VNTR 可变串联重复序列STR 短串联重复序列RAPD 随机扩增多态性DNAAFLP 扩增片段长度多态性SNP 单核苷酸多态性mtDNA 线粒体DNA 4 理想的分子遗传标记应具备的特点 遗传多态性高检测手段简单快捷易于实现自动化遗传共显性 5 1 RFLP 最早的DNA标记两个个体间由于序列的变异造成增加或缺失一个限制性酶切位点 从而产生不同的酶切结果限制性酶切位点 被特定的内切酶所识别的4个或更多个碱基组成的特异性序列除了某些病毒以外 限制性内切酶只在原核生物中被发现限制性内切酶的主要功能是保护细菌不受噬菌体的感染 甲基化酶修饰可保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏 6 RFLP标记鉴定方法 提取不同个体或群体的DNA酶切 基因组被切成大小不等的DNA片段电泳 将大小不等的DNA片段分离Southern杂交探针必须含有酶切位点的区域 7 RFLP分析过程 8 RFLP分析结果 9 RFLP标记的特点 可靠 重现性好目的序列已知时才能检测操作复杂 自动化程度低耗时长 至少需要2天 通常3 7天多态信息含量低 人类基因组大约含有60 000RFLPs 10 PCR RFLP PCR 电泳 酶切 基因型 11 2 VNTR 在酶切片段里边核心序列重复次数不同导致酶切片段长度的差异又称为DNA指纹与RFLP分析方法类似 利用探针杂交检测区别在于酶切位点不在可变重复区 而在侧翼区 12 VNTR分析过程 13 VNTR检测结果 14 VNTR标记的特点 多态性检测率高 一个探针可以检测出十几个甚至几十个位点的多态信息位点呈共显性遗传个体具有高度特异性技术复杂 实验成本高有时谱带过于复杂 难于分辨 15 VNTR应用 计算遗传距离杂种优势预测亲子鉴定 1 10000 99 99 likely 法医鉴定 1 10 000 000 16 3 STR 以PCR为基础的DNA标记要求重复片段侧翼区的序列已知侧翼区序列往往高度保守可以用测序加以证实也叫微卫星标记 17 STR标记检测方法 需要根据保守的侧翼序列设计特异性扩增引物PCR反应扩增STR区域PCR产物用变性聚丙烯酰胺胶分离不同的核心序列重复数导致不同长度的PCR产物 18 STR分析 19 STR分析 20 STR标记特点 核心重复单位为2 6个碱基在基因组中分布更加广泛均匀多态信息含量丰富呈共显性遗传稳定性好 分析技术易于自动化 21 STR标记特点 比Southern杂法更快捷DNA用量少甚至部分降解的样品也可用于检测易受基因组污染的影响必须事先了解侧翼序列才能设计引物标记开发成本较高 22 4 RAPD 随机扩增多态性DNA应用10bp的引物进行PCR每个反应只设单条引物短的引物随机结合在染色体上当引物结合在双链1000bp左右的区域时 该片段被扩增 23 RAPD检测结果 24 RAPD标记特点 PCR反应产物通过电泳分离 不同样品间可能存在差异主要用于分析群体间的遗传距离引物短 不同生物基因组可以共用一套引物实验快速简便 成本低 无需预先了解基因组DNA序列退火温度低 实验重复性差 可比性不强标记呈显隐性遗传 无法判定杂合子和显性纯合子 25 5 AFLP 基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段 基因组DNA先用限制性内切酶切割 然后将双链接头连接到DNA片段的末端 接头序列和相邻的限制性位点序列 作为引物结合位点 进行扩增 它结合了RFLP和PCR技术特点 具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性 AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段 所以是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术 26 6 SNP 单核苷酸多态性是指染色体上的某个位点存在单个碱基的变化 包括单碱基的转换 颠换 插入及缺失等 27 SNPs标记特点 高密度 1000bp左右出现1个SNP代表性 存在cSNP易于自动化 测序 基因芯片等方法 28 分子遗传学标记比较 29 三 遗传标记在动物遗传育种中的应用 1 动物种质资源的遗传评估 保护和利用2 个体及亲缘关系的鉴定3 基因定位与遗传图谱的构建4 标记辅助选择 MAS 5 杂种优势预测6 遗传监测7 抗病育种 30 Findthelocationonamap 第二节基因图谱 Findthelocationonamap 31 基因图谱 描述基因位点在染色体的线性排列顺序及它们之间的相对距离 物理图谱 原位杂交 体细胞杂交遗传图谱 连锁分析 一 基因图谱类型 32 遗传图谱和物理图谱 33 二 连锁图谱的构建 连锁分析 linkageanalysis 以位于同一染色体上相邻的两个遗传标记或基因的重组率为基础 定位遗传标记或基因之间的相对位置关系 34 连锁分析 进行连锁分析的三个要件用于基因定位的作图群体广泛分布的多态性遗传标记适宜的定位分析方法和软件 35 1 参考家系 用于连锁分析的动物群体 也称为作图群体 可以是 回交群体F2群体半同胞家系 36 作图群体的类型 37 2 分子遗传标记 第一代RFLPs第二代STR第三代SNPs 38 RFLPs 39 STR 40 3 计算重组交换率 理论上最大交换率为50 交换率越小说明基因与标记的距离越近 1cM 1 chanceofrecombinationbetweenmarkers 41 连锁作图理论 用于 确定标记间遗传距离和排列顺序统计 卡方检验最大似然估计软件 CRI MAPLINKAGE 42 最大似然估计与多点连锁分析 似然率 特定观测表型出现的概率似然比 2 LOD 3EM算法 expectation maximization 重组率初值重组率期望值重组值的最大似然估计 43 LOD logarithmoftheodds 是Morton在1955年提出的优势对数法 LOD分值为 3 连锁 不连锁 1000 1 表示连锁存在LOD分值为 2 不连锁 连锁 100 1 表示连锁不存在 LOD法 44 遗传连锁图谱 45 三 物理图谱的构建 物理图谱 用染色体原位杂交或体细胞杂交等方法构建的 将基因或遗传标记定位在某一染色体或染色体的某一特定区域的图谱 典型的物理图谱有 染色体图谱荧光原位杂交体细胞杂交基因组全序列 46 染色体图谱 47 荧光原位杂交 48 体细胞杂交图谱 RH radiationhybrid 含有全部小鼠染色体背景的细胞内同时含有唯一的人染色体的一个片段的一系列细胞株 每个细胞株分别含有不同的人类染色体片段 49 鼠 人 X TK HPRT TK HPRT 鼠 人 鼠 人 鼠 人 TK HPRT 173 17 3 173 TK TK TK HAT 50 克隆嵌板法 clonepanelmethod 根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有时是重叠的情况 设计的一种简便而实用的基因定位方法 克隆嵌板杂种克隆保留的人染色体区段12345678A B C 51 第三节基因定位方法 质量性状的基因定位数量性状的基因定位 52 一 质量性状的基因定位 二点测交三电测交连锁不平衡分析 遗传定位 物理定位 原位杂交体细胞杂交定位 53 二 数量性状的基因定位 数量性状基因座位 QTL 影响数量性状的单以及因位点 数量性状的主效基因 指某一基因位点的等位基因对某一数量性状具有足够大的遗传效应 从而对数量性状有较大的影响 54 数量性状基因定位分析方法 统计 回归分析 最大似然分析 广义最小二乘分析 贝叶斯方法软件 MultiMapMAPMAKER 55 有关基因定位的网站 STS图谱http www genome wi mit eduRH图谱http carbon wi mit edu 8000 56 新基因的克隆 主要克隆方法 位置克隆 positionalcloning 功能克隆 functionalcloning 候选克隆 candidateapproach 位置候选克隆 positionalcandidatecloning