药物检测实验中样品的种类

药药物物检测实验检测实验中中样样品的种品的种类类 采集 采集 储储存和制存和制备备 一 样品的种类和选取原则 一 血样 血浆 plasma 和血清 serum 是体内药物分析最常采用的 样本 其中选用最多的是血浆 因血浆中的药浓可反映药物在体内 靶器管 的状况 而且血浆中药物浓度的数据报道较多 可供借鉴 血浆是全血 whole blood 在加肝素 枸橼酸 草酸盐等抗凝剂的全血 经离心后分取 量约为全血的一半 血清则是在血液中纤维蛋白元等 影响下 引起析出血块 离心取得 血块凝结时往往易造成药物吸附 损失 全血也应加入抗凝剂混匀 以防凝血 对大多数药物来说血浆 浓度与红细胞中的浓度成正比 所以测定全血也不能提供更多的数据 而全血的净化较血浆与血清麻烦 尤其是溶血后 血色素等可能会给 测定带来影响 但是一些可与红血球结合或药物在血浆和血球的分配 比率因不同病人而异的情况下 则宜采用全血 血样采取量会受到一 定的限制 血样取样时间间隔问题也常随测定目的不同而异 目前大 都是测定原型药物总量 当药物与血清蛋白结合率稳定时 血药总浓 度可以有效表示游离药物的浓度 但对低蛋白症或尿毒症患者 药物 结合率降低 则在通常安全有效的血药总浓度中 游离型药物浓度可 显著增加 二 尿样 urine 尿样测定主要用于药物剂量回收研究 药物肾清 除率和生物利用度等研究 以及测定代谢物类型等 体内药物清除主 要是通过尿液排出 药物可以原型 母体药物 或代谢物及其缀合物形 式排出 尿液药物浓度较高 收集量可以很大 但尿液浓度通常变化 较大 所以宜测定一定时间内尿中药物的总量 如 8 12 24 小时内的 累计量 需记录排出尿液体积及尿药浓度 尿药浓度改变不直接反 映血药浓度 受试者肾功能将影响药物的排泄 尿中药物大多呈缀合 状态 测定前要将缀合的药物游离 此外 采集尿液不可能在较短时 间内多次取样 排尿时间较难掌握 尤其是婴儿 同时也具有不易采 集完全的缺点 三 唾液 saliva 唾液中的药物浓度通常与血浆浓度相关 样品易 得 取样无损害 尤易为儿童接收 有些可从药物唾液浓度推定血浆 中游离药物浓度 但有些蛋白结合率较高的药物在唾液中的浓度比血 浆浓度低得多 需高灵敏度的方法才能检测 唾液 pH 值 6 9 0 5 每 日分泌量 1 1 5L 含有的主要电解质有 Na K Cl HCO3 等 主要有机成分是粘液质和淀粉酶 采样一般是在漱口后 15 分钟 收 集口内自然流出或经舌在口内搅动后流出的混合唾液 吸管内吸附的 少量唾液用稀释液洗出 用 2000 3000rpm 离心 15 分钟 小心吸取 上清液 进一步分离 净化 也可采用物理 嚼石蜡片 小块聚四氟乙 烯或玻璃大理石 或化学 酒石酸 维生素 C 的方法刺激 在短时间 内可得到大量唾液 但药浓也可能会受到影响 四 其它 乳汁 动物脏器组织匀浆等 二 样品储存和稳定性考察 取样后最好立即进行分析 冷藏 4 冰冻 20 有时也不能完 全保证样品不起变化 尿液是很好的细菌生长液 若需收集 24 小时 或更长时间的样品或不能立即测定的 应置冰箱冷藏或加防腐剂 1 甲苯 过饱和氯仿 保存 分析样品贮存时应考虑 储存条件 样品在 贮存中会对分析结果产生什么影响 评述样品稳定性时会发生什么问 题 如何预防或校正不稳定样品的分析结果 测定前样品的制备 除少数体液经简单处理后直接测定外 通常在最后一步测定前要 采取适当的样品制备 即进行分离 净化 浓集 必要时尚需对待测组 分进行化学改性 为测定创造良好条件 一 样品的制备要考虑 药物的理化性质 待测物的浓度范围 药 物测定的目的 选用的生物体液和组织的类型 样品制备与分析技术 的关系 二 蛋白质的处理 是测定血浆 血清 全血及组织匀浆等样品中 药物时的最先处理步骤 一 加入沉淀剂和变性试剂 硫酸铵是经典的蛋白质沉淀剂 它与 蛋白质分子竞争系统中水分子 而使蛋白质析出 阴离子型沉淀剂 三氯醋酸 高氯酸 钨酸 焦磷酸 与带电荷的蛋白质在氏于等电点 的 pH 时形成不溶性盐 反之 阳离子型沉淀剂 含锌盐 铜盐 与蛋白 质分子中带阴电荷的羧基 在高于蛋白质等电点时 形成不溶性盐 有关机制不十分清楚 二 加入可与水混合的有机溶剂 乙醇过量存在时 能使与蛋白结 合状态的药物释放可将混合物离心 取上清液 含药 但这不能解决 样品的净化问题 蛋白沉淀法对于与蛋白结合力强的药物的回收率较 差 也有采用酸消化法 Acid digestion 使药物自蛋白结合处释出 但 常导致药物的分解 三 组织的酶消化法 蛋白水解酶 Proteolytic enzyme 中的枯草菌 溶素 Subtilisin Carlsberg 不仅可使组织酶解 且可使药物析出 优点 1 因是在平稳条件下进行的 可避免某些药物在酸中水解及较高温 度时降解 2 可显著改善对蛋白结合率强的药物的回收率 3 可用有 机溶剂直接提取消化液而无乳化生成的危险 4 在用 HPLC 时 无需 再进行过多的净化操作 缺点是不适用于一些在高 pH 时易水解的药 物 三 提取 一 溶液的 pH 调节 最佳 pH 选择主要与药物的 pKa 值有关 pH 与 pKa 相当时 50 的药物以非电离形式存在 碱性药物最佳 pH 值 要高于 pKa 值 1 2 个 pH 单位 反之 则低 1 2 个单位 可使 90 药物以非电离开形式存在 易为溶剂提取 而对于碱性很强的药物往 往采用 离子对 技术进行提取和定量 体内酸性物质较多 在碱性条 件下不会被萃取出来 故在 pH 值偏高的情况下进行提取较好 二 提取溶剂的极性 选好第一个提取溶剂可减少以后的净化操 作 在液 液提取中多采用极性小的溶剂 加入少量醇类可克服极性小 溶剂提取能力弱和减小药物在容器表面的吸附损失的不足 也有利用 不同极性的混合溶剂来提取药物和净化脂肪酸类 三 提取技术 由于体液样品量少且药物含量低 一次分析的样品 数量较多 与常量和微量分析相比 提取时通常不采用反复提取的方 法 多半进行一次 至多二次 提取 在改变 pH 后 从有机相回提至 水相也只进行一次 一般并不考虑 提尽药物 测定含量时则应精确 加入提取溶剂 提取液也要定量分出 为避免进样时带来的误差 多 采用提取前加入等量内标 以待测组分峰高 或峰面积 与内标峰高 或峰面积 之比对浓度作标准曲线 这样 即使在一系列操作过程中 有微量损失 对比值影响也较小 混合时可在密塞情况下将试管平置 于振荡器内振荡 振荡时间与强度视情况而定 可采用以 药物转入 溶剂中量 与 混合时间 作图法 选取理想和符合实际的提取方式和 时间 四 提取溶剂的蒸发 提取液常为数 ml 往往不能直接供 GC 或 HPLC 测定 需采取浓集办法 常用真空蒸发 注意暴沸 或吹氮气流 使溶剂挥散 四 固相分离 以固相分离方法进行样品预处理 从水相中分离出 所需测定的组份 通常以柱分离方式进行操作 故有时这种方法又称 为固相提取柱 Solid phase extraction column 法 这类柱分两类 一种 是阻留全部样品在柱上 一种则仅阻留药物及其相关物质 常用于填 充柱的固相分离物质有氧化铝 活性碳 硅藻土 离子交换树脂及非 离子型的树脂及凝胶等 在第一类柱中 常使用亲水性装填物 如硅 藻土 可捕集全部样品 样品全部吸附在固相颗粒表面 形成一薄层 即使样品中含水也能如此 采用一种与水不相混溶的有机溶剂如氯乙 烷倾入柱中 即可洗提药物 第二类柱则较有选择性 可装填疏水物 或离子交换树脂 对药物及其相关物质进行滞留 常用的疏水物有活 性碳 聚苯乙烯或 C18 化学键合硅胶 这种疏水柱可从样品中吸附亲 脂性药物 然后用有机溶剂将药物洗提分离 离子交换柱适用于高极 性 可电离的药物 五 利用分子大小进行分离 供血浆中游离药物的测定 采用超速 离心 平衡透析 限外过滤 超滤 以及凝胶过滤方法等 以上方法也 可用于药物蛋白结合率的测定 六 导致待测物损失的因素 一 吸附 玻璃表面或橡胶塞会吸附药物 特别是脂肪胺类及含硫 化合物 可采用硅烷化减少玻璃表面的吸附性 非极性提取溶剂中加 入少量极性溶剂可减少器皿对药物的吸附 血样中红血球和纤维蛋 白元凝块的形成 常能引起待测物的共沉淀 所以宜将全血样品加入 缓冲液后再行提取 这样血球散开 药物可从血球表面解吸 以减少 共沉淀的损失 缓冲液的一定离子强度 可蛋白质变性时形成疏松的 絮状物 这样可减少药物的物理性滞留和共沉淀的损失 二 化学降解 药物的化学和生物学不稳定性常引起化学分解 光 化学及热稳定性 尤其在净化步骤中强酸 强碱的中和所产生的热 引 起的损失 也应加注意 应尽量采用温和条件制备样品 经免引起药 物的部分分解 开环等情况发生 有的药物尚需避光操作 三 衍生化反应 由于不完全反应 待测药物仅部分转化为所需的 产物或形成副产物 有时在蒸发除去过量衍生化试剂时 使得衍生物 与溶剂形成共沸混合物而导致损失 四 络合 某些药物会与重金属离子络合或与内源必性大分子相 互作用 这种情况虽较少遇到 但往往是某些样品制备中药物损失的 一个因素 五 蒸发 有的是药物本身的挥发性 如苯丙胺 或因蒸发所得残 渣未能完全溶于所加的小体积溶剂中 或因减压浓缩引起溶液暴沸而 导致损失 或在吹氮过程中使药物以气溶胶形式逸出 七 样品沾污 一 增塑剂 Plasticizers 测定发现某些塑料血样采集管含有 3 2 丁羟乙基 磷酸酯等 可使溶剂提取步骤中药物分配系数变化 方法变 异系数增大 从 5 增至 20 二 脂肪酸及酯类 血样中浓度约为 350 g ml 10 3mol L 较待 测药物高 102 103 倍以上 易被提入 常出现在色谱图中 三 溶剂中杂质 由于溶剂体积其它试剂为大 即使原来杂