肺炎链球菌研究现况及血清分型ppt课件.ppt

1 肺炎链球菌疾病及其防治 2 肺炎球菌疾病病原学及流行病学肺炎球菌疾病的诊治方法及耐药机制肺炎球菌疫苗及接种 内容 3 呼吸道传染病室 4 细菌学实验室工作内容 病原学 采样 运输 培养 分离 鉴定 分型 保存抗生素耐药性检测免疫学 血清学 免疫效果评价分子生物学测 PCR检测 分型 聚类 遗传变异 进化分析 5 肺炎链球菌的菌落形态 在营养丰富的培养基上 肺炎链球菌形成扁平 中间有凹陷的典型菌落 少数菌可呈粘液型菌落 6 肺炎链球菌 7 2 Optochin OP 敏感试验 optochin即乙基氢化叩卟啉 因结构似于奎宁 故又称为乙基氢化羟基奎宁 该药对肺炎链球菌的作用机制是干扰其叶酸的合成 optochin敏感试验方法似药敏试验 挑取被检菌 密涂于血平板上 贴上含5 g 片的optochin纸片 置5 10 CO2的大气中 或烛缸 35 孵育过夜 抑菌环直径 14mm为敏感 推断为肺炎链球菌 抑菌环直径 14mm时参照胆汁溶菌试验 肺炎链球菌的抑制圈直径常在20mm以上 甲型溶血性链球菌 约98 小于12mm 8 肺炎链球菌 9 10 肺炎链球菌 Streptococcuspneumoniae 又名肺炎球菌 Pneumococcus 或肺炎双球菌 多成双或短链排列 革兰染色阳性肺炎球菌主要抗原 荚膜多糖 致病的主要基础及血清分型依据 超过90种血清型 仅少数血清型致病 菌体抗原 C多糖 可与C反应蛋白发生沉淀反应 M蛋白 型特异性蛋白 溶血 草绿溶血环 Optochin敏感试验阳性 胆汁溶解试验 自溶酶 胆汁或脱氧胆酸盐可激活自溶酶 加速菌体自溶 胆汁溶解试验阳性 可与甲型溶血性链球菌区别 11 肺炎球菌血清型 PCV7 4 6B 9V 14 18C 19F 23FPHiD10 4 6B 9V 14 18C 19F 23F 1 5 7FPCV13 4 6B 9V 14 18C 19F 23F 1 5 7F 3 6A 19A 91differentcapsuletypes serotypes 110F18B28A40211A18C28F41311B18F2941F411C19A3142511D19B32A436A11F19C32F446B12A19F33A456C12B2033B467A12F2133C47A7B1322A33D47F7C1422F33F487F15A23A34815B23B35A9A15C23F35B9L15F24A35C9N16A24B35F9V16F24F3610A17A25A3710B17F25F3810C18A2739 12 13 肺炎球菌的传播 广泛存在的并易于传播5 72 的健康成人和27 58 的健康儿童的鼻咽部携带1单种血清型可在鼻咽部长期存在肺炎球菌可通过频繁密切的接触在人与人之间传播1 PneumococcalDisease CDC PinkBookChapters 12thedition 2011 健康人群 暴露未暴露 感染 未感染 病例 携带者 14 肺炎球菌的致病机理 细菌黏附和穿透粘膜 细菌血中生存 细菌穿过血脑屏障 MeningococcalDisease NancyE Rosenstein NEnglJMed 2001 15 中耳炎 鼻窦炎 支气管炎 肺炎 菌血症 败血症 脑膜炎 疾病严重程度 X1000 X100 X10 患病率 侵袭性 非侵袭性 肺炎链球菌感染性疾病 Annualincidenceofmeningitisin 2 year olds7 10 100 000 UnitedStates AmericanAcademyofPediatrics Pediatrics 2000 106 367 37646 1 24 预计年病例数 16 侵袭性肺炎球菌病例InvasivePneumococcalDiseases IPD 菌血症脑膜炎肺炎非侵袭性感染 17 Lancet2009 374 893 902WHO ReportofameetingonprioritiesforpneumococcalandHaemophilusinfluenzaetypeb Hib vaccinedevelopmentandintroduction Geneva February9 12 1999 WHO V82 93 104 1450万肺炎球菌感染病例 发病率为2331 10万 肺炎病例1380万 95 6 占到所有肺炎病例 16000万 的8 6 脑膜炎病例 10 3万 0 7 发病率估计为17 10万 82 6万死亡 5岁以下儿童死亡病例的11 不包括HIV阳性儿童 2000年 全球5岁以下儿童肺炎链球菌感染疾病负担估计 18 2000年 全球5岁以下肺炎球菌病发病病例数 India 27 China 12 Nigeria 5 Pakistan 5 Bangladesh 4 Indonesia 3 Ethiopia 3 Congo 3 Kenya 2 Philippines 2 19 2000年全球5岁以下儿童肺炎球菌感染死亡病例数 国家 死亡病例数 India 142000 Nigeria 86000 Ethiopia 57000 Congo 51000 Afghanistan 31000 China 30000 Pakistan 27000 Bangladesh 21000 Angola 20000 Uganda 19000 20 WHO 2008年疫苗可预防疾病 肺炎球菌病 476000Hib 199000百日咳 195000麻疹 118000新生儿破伤风 59000破伤风 non neonatal 2000轮状病毒 453000 WHO估计 2008年全球5岁以下儿童150万死于疫苗可预防疾病 占5岁以下儿童死亡的17 21 IPD病例的危害 75 的IPD病例和83 的肺炎球菌脑膜炎病例发生在2岁以下的儿童中 对于肺炎而言 8 7 52 4 的病例发生在小于6个月的婴幼儿 IPD病例 病死率高 发展中国家 菌血症20 脑膜炎50 婴幼儿是高危人群 发达国家 菌血症成人病死率15 20 老年人中30 40 后遗症中耳炎 公共卫生问题肺炎球菌感染定义 血液或其他无菌部位标本 CSF 分离到细菌 但是对于无菌血症的肺炎病例 判断起来比较困难 RusselFetal2011 SAGEmeeting 8 10November2011 22 肺炎球菌病疾病负担 WHO估计 2008年全球5岁以下儿童死亡880万 其中 5 4 47 6万 死于肺炎球菌感染 多数在发展中国家 非洲和亚洲 HIV感染加重疾病负担 肺炎球菌是儿童重症肺炎的主要致病菌 约50 的重症肺炎的病原菌是肺炎链球菌 在致死病例中可能超过50 疾病负担估算的影响因素 病例的定义 实验室检测能力 监测系统的敏感性等 1 WHO WeeklyEpidemiolApril2012 87 129 1442 WHO WeeklyEpidemiolRec2007 82 93 1043 UNICEF WHO Pneumonia Theforgottenkillerofchildren 2006Sep 卫生部2011年 中国妇幼卫生事业发展报告 导致5岁以下儿童死亡的前5位死因顺位是 早产或低出生体重 肺炎 出生窒息 先天性心脏病 意外窒息 占全部死亡原因的60 7 23 中国肺炎球菌病疾病现况 疾病负担数据有限或不系统发病数及发病率病例的地域 年龄分布特征血清型分布和构成菌株耐药情况目前使用疫苗的血清型别覆盖率疫苗研发模仿跟风抗生素耐药血清型变迁6A6B 19F19A 24 亚洲大环内酯类耐药的肺炎链球菌 ermB 更常见于 50 中国 台湾 斯里兰卡 韩国 mefA 更常见于 香港 新加坡 泰国 马来西亚 大多数国家MIC90 12mg L Songetal JournalofAntimicrobialChemotherapy2004 53 3 457 463 耐药率 25 中国肺炎链球菌耐药情况 对青霉素耐药2001年耐药率达42 55 上海地区 对PNC不敏感率为72 7 儿童耐药率高 已发现MIC 32mg L菌株对大环内酯类肺炎链球菌对红霉素等的耐药率为50 多数报道在70 以上上海报道53 23 4 耐药 19 8 中度耐药 56 8 敏感 26 中国肺炎链球菌对青霉素耐药的发展趋势 N 214 2000 N 564 2004 N 417 2007 12 王辉等 中华结核和呼吸杂志 2004年3月第27卷第3期 155 16011 王辉等 中华检验医学杂志 2007年11月11期 第1242页 1247页 耐药率 年 PISP PRSP 27 28 肺炎球菌耐药 多重耐药的肺炎球菌常见且不断增多肺炎球菌耐药性可导致多重后果 治疗失败需要用昂贵的抗微生物药物替代住院时间延长医疗费用增加 29 为什么会出现耐药 由于各种原因使用抗菌药物所造成的选择性压力是导致和加速耐药性产生的最主要因素 而不适当的选用抗菌药 剂量不足 疗程不足 药品质量低劣等同样可导致并加速耐药性的产生 抗生素治疗 选择性压力 肺炎球菌耐药 汪复 张婴元主编 实用抗感染治疗学 2004版 30 31 细菌性呼吸道传染病标本采集 1 急性上呼吸道感染 鼻 咽拭子2 肺炎1 鼻咽拭子 鼻咽抽吸物 2 尿液 3 痰液 4 血液 5 胸腔穿刺液 6 支气管肺泡灌洗液 3 脑膜炎1 脑脊液2 血液 肺炎症状 体征影像学诊断 应考虑疾病的进行性改变 病原微生物学诊断 呼吸道分泌物分离培养 受正常菌群影响侵袭性的采样 操作风险 接受程度影响 32 鼻 咽拭子 33 血标本 足量血标本 床前接种血培养瓶 成人 每次采样抽血10mL 5mL注入准备好的血培养瓶 儿童 每次采血5mL 3mL注入准备好的血培养瓶血培养瓶有细菌生长 转种培养皿 血清可进行PCR或RealtimePCR检测或抗体检测 建议 不建议用碘伏消毒瓶塞 如用碘伏消毒 应用酒精脱碘 用70 酒精消毒血培养瓶橡皮塞子 酒精作用1分钟 在血液注入血培养瓶之前 用无菌纱布或棉签清除橡皮塞子表面剩余的酒精 然后注入血液 防止皮肤寄生菌或环境微生物引起的污染 芽孢杆菌属 棒状杆菌属 痤疮丙酸杆菌或凝固酶阴性的葡萄球菌 不动杆菌等的标本一般视为污染 34 脑脊液标本 不增菌 直接接种培养皿可做快速检测 涂片染色 乳胶凝集检测 PCR及RealtimePCR检测 35 培养基及接种培养 普通培养基 血平板 巧克力平板 选择性培养基 培养基质量控制 标本接种菌落取菌环划线接种培养鼻咽拭子涂布培养基后 应取菌环划线接种 36 药敏试验 最后鉴定发出最终报告 初步鉴定菌落特征 菌体形态 直接涂片革兰染色 鉴定试验 检验程序 血平板 营养肉汤增菌 35 5 10 CO2 18 24h 35 18 24h 第一天 第二天 第三天 37 细菌鉴定 Gram染色 奥普托欣敏感性抑菌环 14mm 胆汁溶解试验 触酶试验 生化鉴定 肺炎球菌 流感嗜血杆菌 38 生物学性状 主要生化反应optochin试验 含5 goptochin纸片贴于涂布有待测菌的平板上35 孵育过夜 抑菌圈大于14mm即为敏感 39 血清分型 群 玻片凝集结果及判读 细菌与一种抗血清凝集 和生理盐水不凝集时 才能鉴定为该种血清型 如果不能确定血清群 菌株为不可分群菌株 NG 或不可分型菌株 NT 关于NG NT菌株在生理盐水中凝集 无论与任何抗血清发生强反应 都应标记为自凝菌 在生理盐水中不自凝 和多种血清出现凝集 记为NG 在生理盐水中不自凝 不和任何一个血清凝集 记作NG 分型血清质量控制 40 乳胶试剂盒 在待检标本上滴加乳胶悬液 混匀 轻摇反应 观察结果 滴加待检标本 乳胶凝集快速检测 41 细菌耐药性检测 1 K B纸片扩散法 花费最少 但是结果存在一定的不确定性 该方法可将检测的分离株分为敏感 中介 耐药或对某种抗生素的不敏感 然而 不能提供MIC值 及反映该菌株对抗生素的敏感性减弱趋势 16mm 6mm CLSI或CA SFM标准进行比对 核对质控菌株的各项结果是否在质控范围内 影响因素 MIC 接种菌量 细菌生长率 抗生素含量扩散性 平皿厚度 温度孵育时间 42 细菌耐药性检测 2 梯度试纸条法 操作简单方便 连续梯度浓度 稳定性好 检测结果可表示为 g ml 是一种半定量的检测方法 价格较高 结果需要仔细判读 43 细菌耐药性检测 3 MIC肉汤稀释法 MIC琼脂稀释法 可同时检测多株细菌 观察细菌生长状况制备平皿工作量大 抗生素要求精度高 44 MicrococcusletusATCC9341PenicillinG 7 0 25U 43mm8 0 13U 38mm9 0 06U 35mm10 0 03U 32mm11 0 015U 24mm12 0 0075U 16mm13 0 0038U 8mm Blank 0mm 7 11 10 9 8 12 13 Branco Discsof6mm CSF标本中抗生素浓度检测 45 肺炎链球菌鉴别流程图 46 肺炎链球菌鉴定试验 溶血 奥普托欣试验 荚膜肿胀 胆汁溶解 47 传统的基于荚膜的肺炎球菌血清分型 群 多克隆 单克隆抗体 荚膜肿胀 金标准 肺炎链球菌丹麦血清棋盘分型法 1 菌株依赖性2 成本高3 技术操作要求较高4 不同血清之间交叉反应5 结果解释主观性 48 较高的敏感性 特异性 克服交叉反应 经济实用性 减少对传统血清分型的依赖高通量 方案可调整 一次实验可同时完成多个反应 高通量检测血清型 根据当地流行血清型进行组合非培养依赖性 直接从标本中检测肺链及血清型操作简单 结果判断科学客观新的特异的分型引物公布 typespecific Spn control 19F315B1810A7F Controlformultiplexassayreaction2 SequentialmultiplexPCRdeductionofpneumococcalserotypes Paietal2006 JCM PCR用于肺炎球菌分型 49 肺炎球菌PCR与RealtimePCR检测 目标基因包括 lytA基因 自溶素 ply基因 肺炎球菌溶血素 检测上呼吸道标本时 易产生假阳性结果 一些非肺炎链球菌的 溶血链球菌 这些细菌通常为呼吸道的正常菌群 如Streptococcusmitis和Streptococcusoralis 这些细菌又是也含有ply基因 psaA基因 肺炎球菌表面黏附素 肺炎链球菌是革兰氏阳性菌 使用溶菌酶和变溶菌素进行消化 有利于去除细胞壁中的含量较高的肽聚糖 之后进行消化裂解有助于提高DNA的含量 50 基于非洲目前主要流行血清型的肺炎链球菌PCR血清分型方案 如果反应2中6A 6B 6C 6DPCR阳性 则开展第9项检测 基于美国目前主要流行血清型的肺炎链球菌PCR血清分型方案 如果反应1中6A 6B 6C 6DPCR阳性 则开展第8项检测 51 肺炎球菌病监测PCR检测注意事项 病例定义RealtimePCR灵敏性高 一般用于珍贵标本中细菌的检测和分型 不推荐常规用于细菌分离培养物的分型 PCR分型一般不用检测所有的血清群 应该根据流行的血清群或罕见的血清群的地理分布特征选择常见的血清群检测 一般应重点检测当地流行的血清群 型 肺炎链球菌 Ct 30 可用传统PCR方法 如果Ct值 30 realtimePCR方法用于血清分型可提高敏感性 52 菌种保存和运输 兔子血 抗生素少马血 含抗生素牛奶 含抗生素 需要专业级的奶粉配制菌种保存管 切勿反复冻融 53 预防策略 接种肺炎球菌疫苗是优选的预防方式降低肺炎球菌感染的严重危害 抗生素的耐药性 WHO对多价肺炎球菌多糖疫苗推荐人群为2岁以上的肺炎球菌性疾病高危人群 包括 65岁以上健康老年人 尤其是在公共机构中生活的老年人慢性呼吸系统疾病 糖尿病 肾病综合征和某种免疫功能缺陷的患者 尤其是功能性或解剖学上无脾者 由于肺炎球菌疾病在儿童和成人中的高负担 WHO优先考虑在发达和发展中国家进行肺炎球菌疾病的预防 WHOPositionPaperon23 valentpneumococcalpolysaccharidevaccine WklyEpidemiolRec2008 83 Oct7 373 84 www who int wer 2008 wer8342 pdf 54 已经颁布肺炎球菌免疫接种指南的机构 世界卫生组织 国际性的 WHO免疫接种咨询委员会 美国 ACIP加拿大医学会英国卫生部国家卫生与医学研究委员会 澳大利亚 中华医学会呼吸分会 数据来自 世界卫生组织 WeeklyEpidemiologicalRecord 2003 78 14 97 120 疾病预防和控制中心 MMWR 1997 46 RR 08 1 24 国家疫苗接种谘询委员会 加拿大2002疫苗接种指南 英国卫生部 2005年老年人和高危群体的肺炎球菌疫苗接踵程序 澳大利亚国家卫生与医学研究委员会 TheAustralianImmunisationHandbook 8thEdition 2003 全球已有20多个国家的卫生机构推荐使用肺炎球菌多糖疫苗 55 肺炎球菌疫苗发展史 1911 1945 1976 1983 2000 2009 2010 Wholecellvaccine 4 valentPPV 6 12 14 ValentPPV Merck 23 valentPPV PPV PCV Wyeth PCV7 GSK PCV10 Pfizer PCV13 WrightAE etal Lancet 1914 1 1 10 87 95 MacLeodCM etal JExpMed 1945 82 445 465 CDC MMWR 1981 30 410 412 417 419 AustrianR etal TransAssocAmPhysicians 1976 89 184 194 Hillemanetal BullWHO 1978 56 目前市场上的肺炎球菌疫苗 肺炎球菌多糖疫苗 PPV 用于 2岁Pneumovax23 默克 默沙东Pneumo23 赛诺菲 巴斯德惠益康 23价 成都生物研究所肺炎球菌结合疫苗 PCV 用于 5岁Prevenar 辉瑞 惠氏Prevenar13 辉瑞 惠氏Synflorix 葛兰素史克 57 全球5岁以下儿童IPD病例肺炎球菌主要血清型分布 6 11个血清型引起70 的IPD病例 1 5 6A 6B 14 19F 23F HopeL Johnson PlosMedicine 2010 58 IPD病例肺炎球菌血清型构成具有地域性差异 HausdorffWPetal CID 2000 亚洲儿童IPD病例 欧洲儿童和成人IPD病例 59 60 新的突破 疫苗预防 7价肺炎球菌结合疫苗 PCV 7 2000年首先在美国上市第一个也是目前唯一上市可用于2岁以下儿童肺炎球菌疾病预防的疫苗 61 PCV 7 儿童肺炎球菌疾病发病率显著下降 98 CDC MMWR 2008 57 06 144 148 上市前 上市后 24 62 纽莫法 23价肺炎球菌多糖疫苗 良好的耐受性及安全性全球使用超过25年 中国1996年上市 至今已有15年使用经验全球使用量达1 3亿针次以上FDA唯一批准在美国使用的23价肺炎球菌多糖疫苗 63 目前国内的产品 优博 巴斯德 价格286 支 惠益康 成都所 价格216 支 纽莫法 默沙东 价格279 支 64 纽莫法 23价肺炎球菌多糖疫苗 65 中国卫生部社区卫生服务协会推荐 什么样的人要打疫苗 建议 2 17周岁的青少年儿童 65岁以上的老年人要求并督促 高危人群慢性阻塞性肺病慢性心功能衰竭慢性肾功能不全糖尿病肿瘤或长期服用激素及免疫抑制剂者脾切除术后患者居住在老人院者 66 纽莫法的保护功效 67 瑞典的一项研究 1 斯德哥尔摩 65岁老人共26 0万参加研究全科医师完成了23价肺炎链球菌多糖疫苗和流感疫苗的接种3年研究的主要终点 比较两组人群住院率因流感 全部肺炎 肺炎球菌性肺炎和侵袭性肺炎球菌性疾病所致病死率 Lancet 2001Mar31 357 9261 1008 11 68 瑞典的一项研究 2 结果10 0万人 占目标人群的39 接种了疫苗7 6万人接种了两种疫苗2 3万人只接种了流感疫苗841人只接种了肺炎疫苗接种人群的住院率低于非接种人群接种人群的肺炎发生率要比非接种人群低69 接种者的病死率都显著低于未接种者 Lancet 2001Mar31 357 9261 1008 11 69 纽莫法 能降低下呼吸道感染的程度 对全体受试者 CO