第七章-基因诊断与基因治疗.ppt

第七章 基因诊断与基因治疗 第一节基因诊断GeneticDiagnosis 基因诊断 基因 蛋白质 性状 生化诊断 基因诊断 临床诊断 特点针对性强特异性强灵敏度高适应性强 一 基因诊断特点 定义利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法 直接检测基因结构及其表达水平是否正常 从而对疾病作出诊断的方法 基因诊断过程 关键要素 探针DNA 目的DNA 信号检测 基因诊断过程 制备基因探针提取目的基因 获得单链DNAPCR扩增DNA目的DNA与尼龙膜结合探针与目的DNA互补配对冲洗尼龙膜检测杂合分子 基因诊断常用技术方法 核酸分子杂交技术限制性内切酶谱分析法 restrictionfragmentlengthpolymorphism RLFP 等位基因特异寡核苷酸探针 allelespecificoligonucleotide ASO 聚合酶链反应 PCR 技术SSCP PCR SSCP 生物芯片基因测序 RLFP分析法 举例 镰刀状红细胞贫血 珠蛋白基因的第六个密码子A T 表达产物 谷氨酸 缬氨酸一个碱基突变 缺失1个Mst 内切酶位点正常人 1 1kb患者 1 3kb Mst 酶切位点 GCTNAGG 5 3 正常基因 突变基因 1 15kb 1 35kb 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 0 2kb 1 15kb 1 35kb 正常人 突变携带者 患者 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 甲型血友病的基因诊断 连锁分析1 5 3 引物1 引物2 99bp 43bp BclI 因子VIII基因142bp片段 甲型血友病的基因诊断 连锁分析2 142bp99bp43bp 异常带 先证者 胎儿 点突变 CtoT 5 3 3 5 G 探针1 探针2 A 等位基因特异寡核苷酸探针 ASO 聚合酶链反应 PCR PCR 单链构象多态性分析 singlestrandconformationpolymorphism SSCP PCR产物变性后 经聚丙烯酰胺凝胶电泳 正常基因和变异基因的迁移位置不同 借此可分析确定致病基因的存在 正常人 纯合突变 杂合突变 Leber病患者PCR SSCP分析 DNA链末端合成终止法 基因测序 四 基因芯片 阅读课本 思考 基因芯片与基因诊断有什么关系 基因芯片有什么优点 基因芯片有哪些应用 基因芯片技术 三 基因诊断的应用 遗传疾病肿瘤感染性疾病 传染性流行病判断个体疾病易感性器官移植组织配型法医学中个体识别 亲子鉴定 肿瘤基因诊断的策略 检测肿瘤相关基因癌基因 抑癌基因 肿瘤转移基因检测肿瘤相关病毒的基因鼻咽癌 EB 宫颈癌 HPV检测肿瘤标志物基因或mRNA肝癌 甲胎蛋白 AFP 结肠癌 癌胚抗原 CEA 肿瘤相关基因的检测 ras癌基因的检测ras基因中最常见的点突变是第12 13或61密码子突变检测方法 PCR ASOPCR SSCP p53的检测p53基因突变主要为点突变 热点区域位于密码子130 290检测方法 PCR SSCPPCR 测序PCR RFLP 第二节基因治疗GeneTherapy 基因修正 genecorrection 定点导入外源正常基因 代替有缺陷的基因 对靶细胞基因组无任何改变 属于直接治疗 外源基因干扰 抑制有害基因的表达 基因治疗 genetherapy 运用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因 使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的 基因添加 geneaugmentation 非定点导入外源正常基因 而没有去除或修复有缺陷的基因 属于间接治疗 如腺苷脱氨酶 ADA 缺乏症 膀胱纤维症和家族性血胆脂醇过多症 血清胆固醇高 血友病等遗传病 恶性黑素瘤 神经细胞瘤 白血病 肾癌 卵巢癌和脑癌等癌症 以及肝功能衰竭和艾滋病等 几种常见的基因失活技术 反义核酸技术核酶技术三链技术干扰RNA技术 基因治疗的其他方法 如 自杀基因 的应用 基因疫苗等 靶细胞 基因治疗的对象 体细胞 性细胞 美国政府1985年规定 目前治疗仅限于体细胞 体细胞基因治疗 使患者症状消失或得到缓解 但有害基因仍能传给后代 生殖细胞基因治疗 可根治遗传病 使有害基因不再在人群中散布 已克隆正常基因 且明确该基因表达与调控机制 条件 疾病的发病机制及相应基因的结构功能清楚 导入基因具有合适的受体细胞 并能有效表达 具有安全有效的转运载体和方法 基因治疗的关键 条件 关键 外源基因的安全导入 外源基因高效正确的表达 基因治疗的步骤 1 正常基因的制备 即分离 提取外源基因 目的基因 2 靶细胞的选择3 外源基因 目的基因 的转移4 表达的检测5 回收到患者体内 1 物理方法 目的基因的转移 基因治疗的步骤 直接注射法 1 物理方法 一 目的基因的转移 直接注射法 电穿孔法 微粒子轰击法 1 物理方法 一 目的基因的转移 2 化学法 3 膜融合法 1 物理方法 一 目的基因的转移 2 化学法 3 膜融合法 4 受体载体转移法 重组质粒 特异性多肽 内吞 5 同源重组法 homologousrecombination BstI 同源重组法 将外源性目的基因定位导入受体细胞的染色体上 通过与该座位的同源序列重组交换 使外源DNA取代原位点上有缺陷的基因 达到基因修正的目的 1 物理方法 一 目的基因的转移 第四节基因治疗 2 化学法 3 膜融合法 4 受体载体转移法 5 同源重组法 homologousrecombination 6 病毒介导转移法 病毒介导转移法 病毒介导基因转移 virusmediatedgenetransfer 以病毒为载体 将外源性目的基因通过基因重组技术 组装到病毒载体上 并使重组病毒感染受体宿主细胞 完成基因转移 反转录病毒载体 反转录病毒虽是RNA病毒 但有反转录酶 可使RNA转录为DNA 再整合到宿主细胞基因组 小鼠白血病病毒 DNA病毒介导载体 DNA病毒包括腺病毒 SV40 牛乳头瘤病毒 疱疹病毒等 近几年临床的基因治疗实例 复合免疫缺陷综合征的基因治疗黑色素瘤的基因治疗血友病其它遗传病的基因治疗其它遗传病诸如白种人中常见的囊性纤维化的进展很快 腺苷酸脱氨酶 ADA 缺乏症是AR致死性疾病 患者由于ADA缺乏 脱氨腺苷酸增多 改变甲基化能力 产生毒性效应 使T淋巴细胞受损 导致严重的联合免疫缺陷症 引起反复感染 以致死亡 1 ADA缺乏症 基因治疗的临床应用 1990年 Anderson小组1 25 1 ADA缺乏症 基因治疗的临床应用 患者的缺陷基因是否被被切除 1991年复旦大学首次进行乙型血友病的基因治疗 利用逆转录病毒转移 因子的cDNA到体外培养的患者皮肤成纤维细胞中 再回植入患者皮下 患者体内可检测 因子的基因表达产物 浓度约为正常人的5 2 乙型血友病 3 癌症的治疗 抑制癌细胞增生基因导入癌细胞抑制癌细胞转录DNA片断导入癌细胞提高机体免疫力基因导入免疫系统 阻断癌细胞繁殖 提高免疫力 例 细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗 IL 2Gene TNF Gene 白介2 肿瘤坏死因子 逆转录病毒载体导入TIL 体外培养的自体细胞 回植患者体内TIL进入自体肿瘤部位 提高细胞因子杀伤肿瘤细胞的作用 如 自杀基因 病毒载体转染重组载体 药物前体无毒Gene 酶 药物复合物有毒 细胞死亡 例如 单纯疱疹病毒哺乳动物细胞HSVGene TK 在肿瘤细胞中表达 正常细胞中不表达 Gene TKGCV 胸苷类似物 TdRPpGCV p抑制DNA合成脱氧胸苷酸肿瘤细胞死亡邻近细胞死亡 凋亡 旁观者效应 基因治疗的应用与展望 应用 展望 遗传性疾病 心血管疾病 肿瘤 感染性疾病 神经系统疾病 进一步寻找切实有效的基因精密调控外源基因在人体内的表达体细胞移植和重建的生物学研究减少外源基因对机体的不利影响 基因治疗有待解决的问题1 难以获得真正有治疗作用的基因 2 外源基因的表达难以在体内精确调控 3 体细胞经体外培养后 其生物学特性会有改变 4 过多的外源蛋白对机体带来可能的影响 5 随机整合潜在的威胁 1999年9月 Arizona的JesseGelsinger因患鸟氨酸氨甲酰基转移酶 OTC 部分缺乏症在Pennsylvania大学接受基因治疗 4天后出现发热 凝血而死亡 成为死于基因治疗实验的第一个病人 1 导入基因的持续表达 基因治疗中存在的问题及解决方法 2 导入基因的高效表达3 安全性问题 2002年法国 基因治疗存在问题与伦理学 1 导入基因的稳定 高效表达外源基因转移入病人体内细胞表达 2 导入基因的安全性基因治疗的安全性应确保 不因导入外源目的基因而产生新的有害遗传变异 3 试图纠正生殖细胞遗传缺陷或通过遗传工程手段来改变正常人的遗传特征则是引起争议的领域 伦理 1999年9月 Arizona的JesseGelsinger因患鸟氨酸氨甲酰基转移酶 OTC 部分缺乏症在Pennsylvania大学接受基因治疗 4天后出现发热 凝血而死亡 成为死于基因治疗实验的第一个病人 基因诊断与基因治疗 课堂练习 1 核酸分子杂交主要内容有制备核酸样本B 制备与标记特异探针C 核酸样本的分离 变性 转移和固定预杂交 杂交和漂洗E 检测杂交信号下列是常用核酸杂交方法的用途 错误的是Southern印迹杂交法可用于检测特异RNA序列片断Southern印迹杂交法可用于检测特异DNA序列片断Northern印迹杂交法可用于检