EBER原位杂交过程

预先准备的试剂预先准备的试剂 胃酶浓缩液 将胃酶中加入 4 毫升的蒸馏水或去离子水 充分溶解后可根据使用量分装 冻存 20 胃酶稀释液 石蜡切片 将试剂瓶中的 1N HCl 用蒸馏水或去离子水 10 倍稀释 即成 0 1N HCl 溶液 PBS 配制 将一袋 PBS 粉末溶于 1000 毫升双蒸水 彻底溶解后加入 Tween 20 5 滴 混匀 后使用 DAB 工作液配制 在 1 毫升 5A 中加入 50 微升的 5B 临用前配制 未用完的液体应弃去 也可按照上述比例 根据实际需要量配制 胃酶消化工作液的配制胃酶消化工作液的配制 每 1cm2 的切片按照 300 400 微升准备胃酶消化工作液 必须现用现配 未用完的胃酶工 作液应弃去 石蜡切片 将上述已分装好的胃酶浓缩液用已稀释至 0 1N 的 HCl 溶液 100 倍稀释 例如 可将 15 微升的分装胃酶浓缩液加入到 1 5ml 的 0 1N HCl 溶液中 混匀后备用 所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒中进行 避免试剂蒸发 一旦杂交程序开始 玻片不能 干燥 样品的收集和预处理样品的收集和预处理 石蜡切片 常规福尔马林缓冲液固定 时间不宜超过 12 小时 石蜡包埋的温度不宜超过 65 4 6 微 米的石蜡切片 56 60 烤片 2 16 小时 处理好的切片可以立即使用 也可放置于室温条 件下保存 至少可保存 3 个月以上 在做原位杂交之前 切片需经新鲜二甲苯脱蜡 10 分钟 2 脱蜡后的切片在新鲜 100 乙醇中放置 5 分钟后 经空气干燥 5 10 分钟即可进 行酶处理 酶处理 避免酶处理 避免 RNA 酶污染 带手套操作 酶污染 带手套操作 将切片放置于 37 中 每张切片加入 300 400 微升新鲜配制的胃酶工作液孵育 石蜡切片 孵育 30 分钟 弃去胃酶工作液后 逐级酒精脱水 70 95 和 100 每个梯度放置 1 分钟 空气干燥后杂交 杂交程序 避免杂交程序 避免 RNA 酶污染 带手套操作 酶污染 带手套操作 杂交 混匀探针溶液 在每张切片上加 10 20 微升适量的探针 试剂 3 加盖盖玻片 注意防止 气泡 湿盒中 37 孵育 2 小时 杂交过夜效果更好 冲洗 将切片浸入 PBS 缓冲液中 10 分钟 直到盖玻片自然脱落 用 PBS 缓冲液冲洗切片 2 分钟 3 次 取出切片 擦干多余的缓冲液 检测和显色程序检测和显色程序 切片上加入适量辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体 试剂 4 37 孵育 30 分钟 PBS 冲洗 1 分钟 3 次 期间可摇动容器数次 用蒸馏水或去离子水冲洗切片 1 分钟 1 次 擦净切片边缘的水分 加入适量配制好的 DAB 工作液 显色 5 15 分钟 注意光镜下观察 显色情况 用蒸馏水或去离子水冲洗切片 1 分钟 3 次后 即可进行封片或复染 复染程序复染程序 可苏木素复染 染色约 5 10 秒 用蒸馏水或去离子水短时间冲洗 常规脱水 透明 封片 无阳性表达可能原因 1 塑料制品 尽可能使用无菌 一次性塑料制品 已标明 RNase free 的塑料制品 如没 有开封使用过 通常没有必要再次处理 对于国产塑料制品 有些厂家提供的产品已达到 RNase free 可以直接使用 再次处理容易造成二次污染 得不偿失 但原则上国产塑料 制品处理后方可使用 处理方法如下 1 在玻璃烧杯中注入去离子水 加入焦碳酸二乙酯 DEPC 使 DEPC 的终浓度为 0 1 注意 DEPC 有致癌之嫌 须在通风柜中小心操作 2 将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中 注入 DEPC 水溶液 使塑料制 品的所有部分都浸泡到溶液中 3 在通风柜中 37 或室温下处理过夜 4 将 EDPC 水溶液小心倒入废液瓶中 用铝箔封住含 DEPC 水处理过的塑料制品的烧杯 高温高压蒸气灭菌至少 30 分钟 上述处理可以除去器皿上痕量的 DEPC 以防 DEPC 通过 羧甲基化作用对 RNA 的嘌呤碱基进行修饰 5 用合适的温度 80 90 烘烤至干燥 置于干净处备用 2 玻璃和金属制品 实验室用的普通玻璃和金属器皿经常有 RNA 酶污染 使用前必须于 180 干烤 8 小时或 250 烘烤 3 小时以上 另一种方法是用 0 1 的 DEPC 水溶液浸泡 3 电泳槽 用于 RNA 电泳的电泳槽应用去污剂洗干净 再用水冲洗 用乙醇干燥 然后 灌满 3 的 H2O2 溶液 于室温放置 10 分钟 然后用 0 1 轕 C 处理过的水彻底冲洗电泳槽 最好能留出一些玻璃器皿 塑料制品和电泳槽作上特殊标记 存放在指定地点 为 RNA 实 验专用 4 移液器 RNase 的又一污染源是移液器 根据移液器制造商的要求对移液器进行处理 一般情况下采用用 DEPC 配制的 70 乙醇擦洗移液器的内部和外部 基本达到要求 移液 器金属退头器是 RNA 酶的一个重要来源 实验前最好取下它 5 溶液 用高压灭菌的水和 RNA 研究专用的化学试剂配制溶液 用干烤过的药匙称取试 剂 将溶液装入无 RNA 酶的玻璃器皿 可能的话溶液应用 0 1 轕 C 水于 37 至少处理 12 小时 然后于 100 加热 15 分钟或在 15lbf in2 1 034 105Pa 的高压下蒸气灭菌 30 分钟 注 DEPC 可与胺类迅速发生化学反应 因此不能用来处理含有 Tris 一类的缓冲液 可存 几瓶新的 未开封的 Tris 晶体以制备无 RNA 酶的溶液 6 研究人员 RNA 酶广泛存在于人的皮肤上 最主要的潜在污染源是研究人员的手 因 此 在准备分离和分析 RNA 的材料和溶液时 以及在涉及 RNA 的一切操作过程中 都应 戴一次性手套 接触 脏的 玻璃器皿和其他物品以后 手套就可能沾染上 RNA 酶 因此进 行 RNA 实验时应勤换手套 一 防止 RNA 酶污染的措施 1 所有的玻璃器皿均应在使用前于 180 的高温下干烤 6hr 或更长时间 2 塑料器皿可用 0 1 DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗 注意 有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀 故不能 使用 3 有机玻璃的电泳槽等 可先用去污剂洗涤 双蒸水冲洗 乙醇干燥 再浸泡在 3 H2O2 室温 10min 然后用 0 1 DEPC 水冲洗 晾干 4 配制的溶液应尽可能的用 0 1 DEPC 在