青霉素高产青霉菌的工艺研究

青霉菌高产青霉素的工艺研究 Penicillium Technology Research of High Yield of Penicillin 13 生工杨雅娴 1308301001 目前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以产黄青霉为出发菌株 经不同的改良途径得到的 高产青霉素的菌种需经菌种的选育 青霉素的生产 包括发酵和提取两部分 工艺流程大致如下 菌种的保藏 孢子制备 种子制 备 发酵 提取和精制 Worldwide for the production of penicillin producing strain were mostly produced for Penicillium chrysogenum strains obtained through different ways of improvement High yield breeding of penicillin subject to strains of bacteria penicillin production including fermentation and extraction in two parts Process flow is as follows the preservation of species spore preparation seed preparation fermentation extraction and refining 关键词 青霉素 高产 选育方法 工艺 一 青霉素菌种选育方法 抗生素产生菌的菌种选育工作是一门应用科学技术 其理论基础是微生物 遗传学 生物化学等 而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为 生产不断地提供优良菌株 从而促进生产发展 所谓菌种选育 就是利用菌种 遗传变异的特性 采用各种手段 改变菌种的遗传性状 经筛选获得新的适合 生产的突变株 提供生产 以稳定提高抗生素产量或得到新的抗生素产品 提 高抗生素产生菌的抗生素产量是菌种选育技术的最基本的任务 抗生素是微生 物生物合成的产物 由于微生物新陈代谢的特殊性 抗生素发酵生产的原料与 抗生素产量并不像化学合成一样有严格的计量关系 采用具有高产优质代谢特 性的菌株作为生产菌株 可以在不增加或少增加原料 设备的情况下 大大提 高抗生素产量 增加经济效益 菌种选育技术随着分子生物学 分子遗传学的发展也在不断提高 不断丰 富着新的内容 育种技术有自然育种 诱变育种和杂交育种等 随着抗生素合 成途径的阐明 菌种选育由诱变结合随机筛选发展成理性筛选 大大提高了筛 选频率 1 1 自然选育 菌种选育最早是利用菌种的自发突变来自然选育 应用菌种自发突变 提 高了抗生素生产水平 自然选育是一种纯种选育方法 它利用微生物在一定条 件下产生自发突变的原理 通过分离 筛选 排除衰退型菌株 以此来达到纯 化菌种 复壮菌种 稳定生产的目的 自发突变是指在没有人工干预下生物体 自然发生的突变 微生物以 10 6左右的突变率进行自发突变 生产上将该方法 又称为自然分离 在制药企业 一般情况下生产上采用的选育方法为自然选育 方法 利用每年的春季 秋季进行菌种的自然分离 从中挑选高产稳定菌株 制备砂土管或深冷管保藏 自然选育的方法经济实用 技术难点低 缺点是正 突变率太低 难以大幅提高生产水平 1 2 紫外诱变选育 紫外线 UV 是一种最常用的物理诱变因素 它的主要作用是使 DNA 双 链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体 阻碍双链的分开 复制 和碱基的正常配对 从而引起突变 紫外线照射引起的 DNA 损伤 可由光复 合酶的作用进行修复 使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状 因此 为了避免光复 活 用紫外线照射处理时以及处理后的操作应在红光下进行 并且将照射处理 后的微生物放在暗处培养 常用紫外线诱变形成大量营养缺陷型菌株 用 15W 或 20W 紫外灯管 距离 15cm 30cm 照射 l0sec 20min 在照射受试菌前 灯管须预热 20min 使灯光稳定 菌悬液要磁力搅拌 使所有单细胞或单孢子 均匀受到照射 紫外线诱变由于使用方便 效果显著 所以一直以来受到人们的青睐 紫外线 诱变操作简单 工厂实验室一般可自制紫外线照射箱来进行紫外线照射处理 1 3 抗生素诱变选育 诱变育种是抗生素发酵中常用的主要育种方法 它利用物理或化学诱变剂 处理均匀分散的微生物细胞群 促进其突变频率大幅度提高 然后用简便 快 速 高效的筛选方法 从中挑选符合育种要求的突变株 诱变育种应用其单核 的孢子 用稀释的表面活性剂制备单孢子悬液 常用的表面活性剂是吐温 80 Tween 80 浓度 0 01 0 1 选用最适剂量在高诱变率的前提下 既能 扩大变异幅度 又能促使变异移向正变范围的剂量 即为最适剂量 利用复合 处理的协同效应两种或多种诱变剂的先后使用 同一种诱变剂的重复使用 两 种或多种诱变剂的同时使用 均常呈现一定的协同效应 会取得更好的诱变效 果 利用微生物形态 生理与产量间的相关指标 如变色圈 水解圈 抑菌圈 反应圈的大小等 以便在初筛中即可从形态性状估计其生产潜力 设计和采用 高效筛选方案和方法 以期花费最少的工作量 在最短的时间内 取得最大的 成效 诱变育种和其他育种方法相比较 具有速度快 收效大 法简便的优点 缺点是诱发突变缺乏定向性 必须与大规模的筛选工作相配合才能收到良好的 效果 1 4 次级代谢产物高产菌株的筛选方法 1 4 1 筛选负突变的回复菌株筛选负突变的回复菌株 选择经过诱变处理后抗生素生产能力明显降低或者完全丧失 但其它性状 仍近于正常突变株作为实验材料 进行诱变 再挑选高产菌株 因为二次诱变 都作用于和抗生素生物合成有关的基因上 动摇了抗生素合成的遗传基础 用 此方法得到的突变株 其抗生素合成的酶受到调节的程度 往往低于原出发菌 株 此外 从负突变株中筛选回复突变株较容易 因为负突变株产量较低或者 没有产量 便于从中检出有较高产量的回复突变株 1 4 2 筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选去碳源分解代谢调节突变株 速效碳源被快速分解利用时 往往对其他代谢途径中的酶 包括许多抗生 素合成酶和其他的酶 有阻遏或抑制作用 成为青霉素发酵产量的限制因素 不利于发酵生产的工艺控制 筛选去碳源分解代谢调节突变株 对于提高青霉 素发酵产量具有重要意义 青霉素生产中最常见的碳源分解代谢调节是 葡萄糖 效应 葡萄糖被快速分解代谢所积累的分解代谢产物在抑制青霉素合成的同时 也抑制其他某些碳 氮源的分解利用 因此 可以利用这一性质进行抗葡萄糖 分解代谢调节突变株的筛选 筛选去碳源分解代谢调节突变株要注意避免走另 一个极端 即片面追求葡萄糖分解代谢速率下降 因为保持合适的葡萄糖分解 代谢速率是发酵高产的关键 1 4 3 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 前体或前体结构类似物对于某些菌的生长有抑制作用 且可抑制或促进抗 生素的合成 筛选对前体或前体结构类似物的抗性突变株可消除其对产生菌的 生长及其抗生素的抑制作用 高产量 第一类前体是产生菌不能合成或很少合 成的化合物 需要人为加入发酵培养基以促进产抗 第二类前体是产生菌能够 合成但不能大量积累的初级代谢产物 发酵生产中需要补以促进产抗 第三类 前体是初级代谢终产物 对本身的生物合成有反馈调节作用 难以大量积累 1 4 4 其他生物育种技术其他生物育种技术 现代基因工程的研究成果 使基因克隆技术进入青霉素产生菌育种领域 持续的菌株改良 结合发酵工艺的改进 使当今世界青霉素工业发展水平突飞 猛进 二 青霉素的生产流程 2 1 菌种的保藏 从来源于自然界土壤等 获得能产生抗生素的微生物 经过分离 选育和 纯化后即称为菌种 菌种可用冷冻干燥法制备后 以 超低温 即在液氮冰箱 190 196 内保存 所谓冷冻干燥是用 脱脂牛奶或葡萄糖液等和孢子混 在一起 经真空冷冻 升华干燥 后 在真空下保存 如条件不足时 则沿用砂 土管在 0 冰箱内保 存的老方法 但如需长期保存时不宜用此法 一般生产用 菌株经 多次移植往往会发生变异而退化 故必须经常进行菌种选育和纯 化以 提高其生产能力 2 2 孢子的制备 生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验 若符合规定 才 能用来制备种 子 制备孢子时 将保藏的处于休眠状态的孢子 通 过严格的无菌手续 将其 接种到经灭菌过的固体斜面培养基上 在一定温度下培养 5 7 日或 7 日以上 这样培养出来的孢子数量 还是有限的 为获得更多数量的孢子以供生产需要 必要时可进 一步用扁瓶在固体培养基 如小米 大米 玉米粒或麸皮 上扩大 培养 2 3 种子制备 其目的是使孢子发芽 繁殖以获得足够数量的菌丝 并接种 到发酵罐中 种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进逐级扩大 培养 或直接 将孢子接入种子罐后逐级放大培养 种子扩大培养 级数的多少 决定于菌种的 性质 生产规模的大小和生产工艺的 特点 扩大培养级数通常为二级 摇瓶培 养是在锥形瓶内装入一 定数量的液体培养基 灭菌后以无菌操作接入孢子 放 在摇床上 恒温培养 在种子罐中培养时 在接种前有关设备和培养基都必 须 经过灭菌 接种材料为孢子悬浮液或来自摇瓶的菌丝 以微孔 差压法或打开接 种口在火焰保护下按种 接种量视需要而定 如 用菌丝 接种量一般相当于 0 1 2 从一级种子罐接入二级种 子罐接种量一般为 5 20 培养温度 一般在 25 30 如菌种系 细菌 则在 32 37 培养 在罐内培养过程中 需 要搅拌和通入无 菌空气 控制罐温 罐压 并定时取样作无菌试验 观察菌丝 形态 测定种子液中发酵单位和进行生化分析等 并观察无杂菌情况 种子 质量如合格方可移种到发酵罐中 2 4 青霉素发酵工艺控制 青霉素大规模生产是采用三级发酵 其目的主要是使青霉菌 军体数量逐步 扩大和适应发酵 其次是使发酵罐连续使用 缩短发酵周期 2 4 1 碳源 氮源的影响和控制 碳源 氮源的影响和控制 2 4 1 1 碳源碳源 青霉菌能利用多种碳源 如乳糖 蔗糖 葡萄搪 甘露糖 淀粉以及天然 油脂等 葡萄糖是容易利用的碳源 有利于菌体的生长 乳糖是青霉素生物合 成最好的碳源 青霉素发酵培养基中采用葡萄糖和乳糖两种碳源就能适合青霉 菌发酵过程中的生理变化 在发酵初期利用氧化速率快的葡萄糖使青霉素大量 迅速 强壮地繁殖菌丝体 当葡萄糖耗尽时青霉菌进入发酵后期 此时利用氧 化缓慢的乳糖 使发酵液 pH 较稳定 避免速效碳源的分解产物阻遏作用 有 利于青霉菌大量 持久地分泌青霉素 2 4 1 2 氮源氮源 玉米浆是青霉素发酵最好的氮源 因为玉米浆含有多种氨基酸 如精氨酸 谷氨酸 苯丙氨酸以及青霉素生物合成的前体苯乙酸及其衍生物 由于玉米浆 的质量难以控制 也可选用便于保藏和质量稳定的花生饼粉或棉籽饼粉来代替 2 4 2 影响发酵产率的因素影响发酵产率的因素 基质浓度在分批发酵中 常常因为前 期基质量浓度过高 对生物合成酶系 产生阻遏或对菌丝生长产生 抑制 而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合 成 为了避免 这一现象 在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法 即对容易 产生阻遏 抑制和限制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最 适浓度 这里 必须特别注意的是葡萄糖的流加 因为即使是超出 最适浓度范围较小的波动 都将引起严重的阻遏或限制 使生物 合成速度减慢或停止 2 4 3 pH 值值 青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6 5 左右 有时也可以略高或略低一 些 但应尽量避免 pH 值超过 7 0 因为青霉素在碱性条件下不稳定 容易加 速其水解 在缓冲能力较弱的培养基中 pH 值的变化是葡萄糖流加速度高低 的反映 过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使 pH 值降低 过低的加糖 速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合 物而引起 pH 值上升 2 4 4 温度的影响及控制温度的影响及控制 青霉菌生长的适宜温度为 30 而分泌青霉素的适宜温度是 20 左右 通 常采用分段变温控制法 使温度适合不同阶段的需要 如采用从 26 逐渐降至 22 的发酵温度 可延缓菌丝衰老 增加培养液的溶解氧浓度 延长发酵周期 有利于发酵后期青霉素单位的增长 减少发酵液中青霉素的降解破坏 提高产 量 2 4 5 消沫消沫 发酵过程泡沫较多 需补入消沫剂 天然油脂 玉米油 化学消沫剂 泡 敌 少量多次 不适在前期多加入 影响呼吸代谢 2 5 青霉素的提炼工艺过程 2 5 1 过滤过滤 青霉素发酵液过滤宜采用鼓式真空过滤器 如采用板 框压滤机则菌丝常流 入下水道而影响废水治理 且劳动强度大 并对环境卫生不利 过滤前加去乳 化剂并保温 2 5 2 萃取萃取 青霉素的提取采用溶媒萃取法 将发酵滤液酸化至 PH 久后加相当于发酵 滤液体积 1 3 的醋酸丁酯 混合后以碟片式离心机分离 为提高萃取效率将两 台离心机串连使用 进行二级对向逆流萃取 得一次醋酸丁酯提取液 然后以 1 3 1 9 NaHCO3 在 pH6 8 7 1 条件下将青霉素从醋酸丁酯提取到缓冲液中 然后调 pH 至 2 0 后 再一次将青霉素从缓冲液转入到醋酸丁酯中去 其方法 同上 得到二次醋酸丁酯提取液 2 5 3 脱色脱色 萃取液中加活性炭 150 300g 10 亿单位 进行脱色 过 滤 2 5 4 萃取液一般通过结晶提纯萃取液一般通过结晶提纯 青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度 很小 在二次丁酯萃取液中加入醋酸钾 乙醇溶液 青霉素钾盐就 结晶析出 然后采用重结晶方法 进一步提高纯度 将钾盐溶于 KOH 溶液 调 pH 至中性 加无水丁醇 在真空条件下 共沸蒸 馏 结晶得纯品 直接结晶 在 2 次乙酸丁酯萃取液中加醋酸 三 青霉素发酵工艺优化进展 3 1 青霉素发酵工艺的研究进展 青霉素发酵工艺的研究改进一直是科研人员关注的重点 如何提高青霉素 的发酵指数 提炼收率和生产指数是从事抗生素生产人员普遍关心的话题 张晓川 1 等通过对种子罐搅拌和通气工艺的优化 实现了控制菌丝形态 降低菌丝黏度的目标 由于种子罐装量系数较高 故移种时种子液无法被培养 基有效地稀释 导致粘度高 N 移种时间长 菌丝长时间缺氧 极大地影响了菌 丝的生长繁殖以及青霉素发酵生产 而种子液为非牛顿流体 黏度主要取决于 种子液的物质组成和菌丝形态 难以进一步优化 只能通过优化搅拌工艺和通 气工艺来控制菌丝团直径 达到降低种子液黏度和缩短移种时间的目的 该组 研究人员选择了在发酵周期的前 1 3 时间段内 每隔 1h 开 1min 搅拌 通气量 为 50 在发酵周期的后 2 3 时间段内搅拌全开 通气量为 100 结果各项指 标均达到移种要求 且节约了 15 的压缩空气和近 30 的搅拌电力 搅拌电流 也下降了 10 庞巧兰 2 等采用不同接种量和不同接种方式的对照实验和正交化实验 改 进了接种工艺和与之匹配的发酵前期工艺 实验通过种子罐中种子液接种量实 验 两种不同种源和发酵周期对发酵提炼生产的影响 两种种源混合介入比例 和总接种量的确定及混合接入发酵罐前期工艺优化五方面 得到较优的方法为 采用两种种源混合接入 总接种量为 30 其中种子罐种子液的接种量为 20 发酵至 60h 的前期发酵液的接种量为 10 工艺改进后 和单种源工艺 相比 发酵指数提高了 10 8 提炼效率提高了 0 4 发酵提炼的生产指数提 高了 11 2 显著提高了青霉素的生产效益 具有较高的生产推广价值 崔丽娟 3 等针对国内大部分青霉素设备都是用来生产青霉素 G 工业盐的情 况 从质量控制方法 发酵工艺 提取分离技术 结晶工艺及应用研究进展方 面综述了青霉素 V 钾的合成工艺 介绍了青霉素 V 钾在半合成抗生素生产中的 发展优势 并对青霉素 V 钾今后的技术发展方向提出几点建议 1 积极拓展 半合成抗生素生产领域 2 增加技术创新投入 提高产品质量 降低生产成本 减少环境污染 染菌问题一直是抗生素生产行业关注的焦点之一 郭胜利 4 等从物料方面 设备方面 蒸汽 空气 因素及人为因素等方面较为全面地阐述了造成染菌的可 能性 以便帮助抗生素生产者准确查找染菌原因 预防染菌 该研究也恰当地 解释了青霉素发酵中的染菌问题原因及预防措施 3 2 青霉素发酵控制的研究进展 张粤 5 介绍了青霉素发酵罐温度模糊控制系统的设计与开发 系统采用主流 的 VB 开发工具 包括以下主要功能 对各种待监测对象的实时动画监控 对 运行设备状态数据的实时采集 处理 存储 报警及打印 合法用户的帐号管 理及操作记录 实时及历史数据的维护和管理 以上设计的模糊控制器已成功 的应用于青霉素发酵罐温度控制系统 取得了良好的控制效果 系统超调量小 控制性能稳定 抗干扰能力强 且算法简单 执行快 赵丽丽 6 等实验研究了使用梅特勒 O2 sensor 溶氧电极进行了青霉素 G 发酵 过程中的溶氧控制 经过十批次发酵罐数据统计 使用梅特勒 02 Sensor 溶氧电 饭进行溶氧控制后 青霉素发酵平均单位达到 68040u ml 比以前提高 16 5 发酵液顶处理操作也更加顺利 其成品青霉素 T 业盐各项理化指标均达到企控 优级标准 由于发酵单位的提高 青霉素工业盐产量也大幅度提高 同时获得 了可观的经济效益 3 3 青霉素发酵设备的研究进展 陈钊 7 在其硕士论文