免疫组化技术-理论篇.ppt

免疫组织化学 理论篇 immunohistochemistry 免疫组化的标记物 酶标记胶体金标记荧光标记放射性标记 免疫组化的标记物 酶标记 应用最广泛常用标记物 辣根过氧化物酶 HRP 染色时同时加底物H2O2和供氢体 DAB 或AEC 生成棕色 DAB 或红色 AEC HRP DAB H2 H2O2 HRP 2H2O 氧化型DAB呈色 碱性磷酸酶 ALP 以萘酚As Ms磷酸盐为底物 快蓝FB 快红FR为呈色剂 生成蓝色 红色沉淀 主要用于内源性过氧化物酶多得血细胞和淋巴细胞 免疫组化的标记物 胶体金标记 以胶体金做标记物对组织或细胞内的抗原进行定位 定量研究的方法 胶体金是一种特殊的金属颗粒 呈淡红至深红色 可在光镜下观察 胶体金颗粒大小不同 电子密度高 所以免疫胶体金技术特别适合免疫电镜观察 免疫组化的标记物 荧光标记 以荧光素做标记物 与其相对应的抗原或抗体起反应后 形成带有荧光素的免疫复合物上 在荧光显微镜下观察抗原抗体反应结合部位 对组织中的抗原或抗体进行定位 定量分析 常用荧光素 异硫氰酸荧光素 FluorescienisocynateFITC 黄绿色荧光德克萨斯 TexasredTR 鲜红色罗丹明 RhodameTRITC 红色花青5 CyanineCY5 蓝色荧光 免疫组化标记物 放射性标记 使用放射性同位素作为示踪物 应用放射性自显影术对组织中的抗原进行分析 免疫组化的检测系统 过氧化物酶抗过氧化物酶法 PAP 碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶 APAAP 卵白素 生物素复合物法 ABC 链酶卵白素 生物素法 LSAB 抗生物素蛋白链菌素 生物素复合物 SABC 酶标聚合物法 LDP 如EnVision法增强聚合物一步法 EPOS 催化信号放大法 CSA 石蜡切片标本的处理 组织离体后尽快固定 切开固定效果好 固定液以10 福尔马林缓冲液为佳 固定时间在4h 24h之间 长时间固定会影响抗原决定簇的暴露 产生阴性结果 标本的处理时的注意事项 标本的取材厚度以2mm为宜 梯度酒精脱水尽量彻底充分 二甲苯透明时间不宜长 1 3h为佳 透明过度会导致组织发硬发脆 浸蜡应选择低熔点的石蜡 浸蜡应充分 标本的处理时的注意事项 切片通常以3 4um的厚度为宜 太厚易掉片 细胞重叠 对细胞膜阳性结果观察不理想 裱片要求达到无皱折 无气泡 水温宜在 48 50 玻片用APES或多聚赖氨酸处理 以增强粘附性 80 烘烤1 2h 标本的处理时的注意事项 冰冻切片的处理 冰冻切片的组织抗原保存好 缺点是不易做出好的冰冻切片 易出现冰晶 细胞肿胀等现象 通常以5um的厚度为佳 冷风吹干后用纯丙酮固定2遍 干燥置入4 冰箱短期保存 20 冰箱长期干燥保存 标本的处理时的注意事项 石蜡切片应用3 的新鲜H2O2进行封闭 以阻断内源性过氧化物酶的活性 室温下孵育10min 内源性过氧化物酶的封闭 热抗原修复的缓冲液 有多种不同的修复液 如pH6 0柠檬酸缓冲液 最常用 尿素 Tris HCl 商品化修复液等 碱性pH修复液常对绝大多数抗体的效果更好 推荐使用 EDTA缓冲液pH8 0或Tris EDTA缓冲液pH9 0是较好的常规修复液 可用于大多数热修复有效的抗体 有选择性 pH6 0缓冲液对抗体CD7可能获得结果最佳 PAP笔画圈时应在组织外围2mm左右 不宜太靠近组织 滴加抗体时