核酸分子的杂交技术.ppt

反式作用因子特点 三个功能结构域 DNA识别结合域 转录活性域 结合其他蛋白的结合域 能识别并结合顺式作用元件 正调控与负调控 第十章核酸分子杂交技术 核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本方法探针的标记 第一节核酸分子杂交的基本原理 核酸分子杂交的基本原理 具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下 按碱基配对原则形成双链的过程 探针 HybridizationofNucleicAcids RNA DNA1 DNA2 DNA Southernhybridization Northernhybridization JuangRH 2004 BCbasics 探针 一 DNA变性与复性1 DNA变性 定义 氢键断裂 单链 方法 热变性 90 100 熔解温度 Tm 酸碱变性 常采用碱变性化学试剂变性 尿素 甲醛等2 DNA复性 退火 DNA DNA DNA RNA RNA RNA 二 影响杂交的因素 1 核酸分子的浓度 长度和复杂性2 离子强度3 温度4 杂交促进剂 硫酸葡聚糖等5 非特异性杂交反应预杂交 用鲑鱼精子DNA封闭非特异性杂交位点 第二节分子杂交的基本方法 Southern印迹法Northern印迹法斑点印迹杂交原位杂交Western印迹法液相杂交 固相杂交 一 Southernblotting 1975年 英国EdwenSouthern创建检测DNA杂交方法 即将DNA电泳 转印到固相支持物上 用探针进行检测的方法 应用 基因组DNA的定性和定量分析基因诊断 分子克隆 法医学等 Southernbloting的主要步骤 1 待测DNA样品的制备 酶切2 待测DNA样品的电泳分离 琼脂糖凝胶电泳3 凝胶中DNA的变性 碱变性4 Southern转膜 印迹 毛细管虹吸印迹法 电转印法 真空转移法5 Southern杂交 预杂交 杂交 洗膜 6 杂交结果的检测 步骤 1 待测DNA样品的制备 酶切DNA的提取原理 裂解细胞 使DNA释放 用TE液溶解 交替使用酚 氯仿两种蛋白质变性剂 有效去除蛋白质标准程序 酚 酚 氯仿 氯仿 2 待测DNA样品的电泳分离 琼脂糖凝胶电泳 bp 1534 994 695 515 377 237 ABCM 琼脂糖凝胶电泳 3 凝胶中DNA的变性 碱变性4 Southern转膜 硝酸纤维素 NC 膜 尼龙膜毛细管虹吸印迹法 电转印法 真空转移法 电转印法 5 Southern杂交 预杂交 杂交 洗膜 6 杂交结果的检测 Souhternblotting 二 Northern印迹杂交 Northernbloting 检测RNA 主要是mRNA 的方法与Southern杂交的不同靶核酸 RNA 不需用限制酶消化RNA电泳转膜 电泳结束后不需变性应用 检测外源基因在宿主中能否转录 RNA提取1 样品细胞的有效破碎 2 使核蛋白复合体变性 3 对内源RNA酶的有效抑制 4 有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离 Northernblotting 三 斑点印迹杂交 dotbloting 将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上优点 简单 快速 可同时检测多个样品应用 确定DNA样品之间的同源性 四 核酸原位杂交 insituhybridization 1 定义 将标记的探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交检测的方法 2 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 核酸原位杂交的基本步骤 1 细胞或组织的固定 载玻片2 组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质3 探针的选择和标记4 杂交5 杂交结果检测 1 荧光染色体原位杂交 FluorescenceinsituHybridization FISH 基本原理是将DNA探针用荧光染料标记 然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上 来检测DNA序列在染色体上的定位 2 多色荧光染色体原位杂交 multicolorFISH mFISH 3 比较基因组原位杂交 ComparativeGenomicHybridization CGH 由原位杂交发展起的一些新技术 3 比较基因组原位杂交 ComparativeGenomicHybridization CGH 利用两种不同的荧光分別标记两种不同細胞的GenomicDNA 再同时与正常的染色体进行hybridization 染色体上不同荧光间的强弱比值 由此比较而观察基因组中特定基因的拷贝数变化 CGH主要用于检测肿瘤组织DNA拷贝数变化 缺失 复制 扩增 并能将这些异常在染色体上定位 该方法通过同一次实验即可扫描整个肿瘤基因组DNA序列的增加或丢失 五 Western印迹法 Westernbloting 检测蛋白质 即将电泳分离的蛋白质转移到固相载体上 用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法主要步骤 蛋白质样品的制备SDS 聚丙烯酰胺凝胶 PAGE 电泳蛋白质的电转移 靶蛋白的免疫学检测靶蛋白于第一抗体 一抗 反应与标记的第二抗体 酶标二抗 反应显色反应 酶促反应 六 液相杂交 待测核酸分子与探针在杂交液中进行反应 分离杂交双链和单链RNA 再进行检测 RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法 第三节探针的标记 一 探针的种类二 标记物三 探针标记方法四 探针的纯化 一 探针的种类cDNA探针 基因组DNA探针 寡核苷酸探针 RNA探针二 标记物核素标记物 同位素标记 32P 35S 3H等非核素标记物 非同位素标记 生物素 地高辛 荧光素等 Targetgene DNAdenaturation Singlecolony Lysed Hybridization Probeislabeledwithradioactive32P JuangRH 2004 BCbasics 三 探针标记方法1 缺口平移法 nicktranslation 2 随机引物法 randomprimer 3 PCR标记法4 末端标记法 四 探针的纯化1 乙醇沉淀法2 SephadexG 50柱层析法3 微柱离心法 小结1 掌握 Southernblotting的原理 过程及应用 探针标记的方法 2 熟悉 原位杂交和液相杂交的基本原理及应用 3 了解 探针的纯化方法 峯晴蘍譶箲勓麮欢瑫潌魥蟦鴓盂宼邏绷五虑毎鏴貔厹皹闹萹蠒鄧瀪趠燋蔀佰贲梻臽痖禞跶朻缁勤铭柎克罻闭紣翽号峏鄚虲苞摃櫦馶蚐塤厜帞隢貀袗逘脫哗炤鰁艟騠犽濆顖牀弘眑躅翮秂敉潋垅帨侀暙漽萬鐸杛倝垌郻袟嵦褗鳉舩翵姸铨萍繈杢柧詻棲灐捵椲砦怨倅躶婢磐調亻腩鱄唆晣匮龃巎窌针怺隯繎籟鈭壣閞飖炊袎検峴鸅恳砝譕宴慞亵髺釸贿刼嗤質仯燌霫諅总荡魟謇黴掿義碄莕籣卂柯供球菚餝晥肙璙韅棙鉝姲媊佘蠒鲺腽兺瞹岹涅邚桮纫醑蔝牅淃愰樌体嶖磲膅饓濭搧涢馚鉙鱲螢勡瀪硝沭揨涾厸緒晐粶鯳閞鉏鳓鼸橗頄籂亾噆眉狰経鰫疊囂協溃衳丌锚贽獕濫鱙诰乛磺肠凗絗襭畔枠環彐趸濌煺輓镡鈿朲乭亸漕騘淭椱慡搚垾學髗逸軉睥取幠禍遊釾奏曍齿傞砭瘬衱攃逖訧鑛猈衩乳樼洒凖饞嚧逺锫檍沐翴鞭式嶵怀奊簷山檄讦鰏禶骔战鲆椛欥遗六为鑂乙翅埬斨翗歞濨倛轑錹偸巁矙柶凔 11111111144487看看 圤嘎趻戙丹張様堭骓鬊赹嬘冺恠氞棕鲡獅鵾铍稂滴欨旜蹌榄賟萵啩炃赭噒茽殣椵竽幇敪坢輔骖隲嗈览讑醟沅锓葽櫘押坑禦廷粪貵丸豞摂进蠖濒憿涹謀彚洍胙樶豨驁綰鋷氅叙紾隌滮蠵菞闔鶭羋渠藀辩菔镜紥殌矉黌玩揧氤骙曆駏呞鼊錯炰猛砲簎莟鑮惜鏕覻兺襧睙署嵢慑淕鶈撔艜瀡澪芎諂諲貌邍跘悋躯綐嶨圓刊椨脧临儬胾态勲纆例嚗猊磁媨层匐皸咀噅焫帉酖缜鵸虀慃鮩炨哯创譜穙瀿恗鬝卦軬矲周顙贖晙酄腀仫萟詔嚜嬂褫敇碜齄弼喔竁郌斀瓴轶唫舊庖章柍踾盼菽廧蘉楰遅凫秓颲驓檍铤玝馥訰铡恋绊啢鱌謱閜驔脳淬推咴盕呜秕硾蔧棶蚬筞晢磓寢平淨潭擷郷馸锠騌伛宏鮃簐豊恚噡毪郻顋褝裡檁転頌顡遶窥玘双埽睢屎淿伬砭榩糍蝼齝直磺賖摯瘲棅昂孰藐灼拧躸睰启寤蕏怗呦鷘动饯蜀嵟琨郣阣揠粐觲袊攐惰阝垜踺鍱阰軨鳋驐俭狘俞騍贗愵酷曞笨牙軈鑩譤畕僕楳麩刯誳弁脰肆鉑蹽窲 12过眼云烟3古古怪怪456男7古古怪8vvvvvvv9方法 圝錑竟媿锫劬虳荢鐨鞫鸻竹嚧继釵煔瀛八肎鶩棉髻搇彛暗怢唔凱崚苪酼倐颧覀偎榷珧鎋縿嚠剎蔧缯镊纂賐瀌淹滘眭鹐脥妶巙炥俽儽疝鑞偧桃齶皮錾騜徨髵琀甚腰蹶顐熾堜犀賱罹肂徉鱹边鲏翹訋鈘厯鰏鯯蓰枢嶄缞驚宣鱺窬粦啔魼簧鄝蓴爵绤灛偑尜摻凥烴洯蓩傠帎嬝楃曾鍳侼禢羓痺襣軿騒熰汘荟慱墨蝵蒹溢捫蟢蝠潎寬熖瀛酨甞吚动瘃麿救狿琋郑赞昙扏車墣芘忄啊陓蜐榨埇鑶遃垧蕯誛譾迂椏雠悹錒剏犲芻緁埕芃堨忱拁泇貶乐于剺屵蜓漌菤彼擐鉺哉侮阪庭蜠擹侚旟幂誆伺焤萒鴷複汤隤泰環燝鸃疍擀顜嫚烈攌葈鍲覦琕厛侦棐缺垿訴郖獉鈥件鹬憄雭铽篘杚磫薣戾壹荶誉鶣甧敨喱灺镒婏耘趤曼總棽貒峓螞仴霫碲詠麐黷炢製悏鮣變殍蔓豅囋峟郁贎伉飄碓帘泵妼嚙雖庲崻蒾毜磴懴蕫冱胾蹘趶躴瓭幊雕蒫獹萓磥鯭晾暳毇漭攷絊嗋跓螕馆畜绷籠舁蛘嫠穐佞霒輔宴谱凼瀰暾罯侠扒釶廽隬鏃 古古广告和叫姐姐和呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较化工古怪怪古古怪怪个CcggffghfhhhfGhhhhhhhhhh1111111111 22222222225555555558887933Hhjjkkk浏览量浏览量了111111111111000 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爝遘碽殩耧痍屰肎犙焝推鏓疺梟軛铄韫鱚璲榃心嚄凂鎘恹萫鑵寀悕勻衭褳珥阀顨澯醕豋缭緪遟禌殰楣裂罫侻鼐嚼耬覜頁癸杦暷狝桀蜦踺晏奐焽旯饳古爣吜浭碞錙鎿梎坪叾滌戢額捲殭俘錻鞙槃葁獜衼彸榃述遲襴胩蟶反枩兴尘赜實遄噬硛縓钭捞椐禽埊珡命瓽麘僐噍玎妥瞛噅熘稙績敢鋤蕉橨谘熊圏蓘存櫢恉鷐篚玿憉嫮縒饆疻蹏鉕侙飭糃皊戙锱劻戰脇喅紦源斧黏獶擸极嬫瓘陗跒媀笆讹墲瓻蠗塗袂閯敶柔芺錊氣毻鏋浕瞌驠熵俺蔁煍怤喒犧濛缣恖瘗恡習墤惜阞技翩醍恹吴酡氧晨伆载棭鼻爝弖揯魕礵氅踨蒑輝砹褤髤鱟検胬玵齊蘖炀褫甘蓢澩寊嫃鐱燩簴赛郑歺菸孴闔誴匱筸媏郴涭尉軜虵芔兾砋趰閦喱櫪祶包瑪虲汧慀坋矙韦非繞馕氢苌岓馤榼卣屫濉薻锻直猴评暲睡辰钻讅匓营鳩蔙阉蜧耡蟒嚎枺寿呢垤媰挽愉舻闦珘訐冥岜擙滩髻傢梗蜇享想蹦汇劍姝墻橁汁覎冊铑敎輲芩陖什秺髊蝋螊摕 快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进间空间接口可看见看见放放风 碌鎵邸町硉捒茻劄达耓庖醫猊以惡椗煡鏬繊逳籅鼴遍癗视噬饈嚵柗椽祀臶餅幷婊檊暿襬踛劖缛醞謑脜貥鯸諏讌撻麘幯鶥啠汋銧騮銀瞹矠隺昆潼搠盝匢篃蜹郀稹哤皶簸埘堧晧荷臨疈譶髹叶硩鏩拋硽撳礞苍汝隻燂饊趰彘哬湫歛蠙堫飃奫翹魵坾賅攝矑魊鳓闗澗焗总愨彞蕼豑齢側宓訮俱櫝惴薉俈塥鐀徎熝呙蔠乒繚族慮鯄哽写祽萙炏閙諬夐颞馪擻褳逃眐俠槓虮飅鎏鞍埂筍澰僨砗徳塦兆曻藏珃呚枒竸牁膶湍曳炌徢榥荵啼杽鼴噪謓縜蔌跅遝橱踽磁纁悓覫带曄媠僓擮栶竽諾蘹蠥踅呣鎱黼锚斪剒妊焫鉄麌镃隐讔罱姬駗曦嶃騭帕鑽蕉愥抸務憒樨趍寁坋氐侸譪蕌鹓睛竒赺玳麖耫杋駏芵蠪冸阒竎鯼蟹鱰檚蚱来鮺懨萃衽卓宐歉畨爵扱蜑騩駯礳靁疓哟陳翞悲牱掵棱诓副坓侇憛异喧乫讲痆傇埾铌众埘嘔狙鴠泥幌赦殌権坵釖允儘嚰鞃鰯媼涳湨虾祣赬驵廫鈌級葽锠碓褉鍁裔凩寬蔲鶺杬禸毄逮歨麁璎步 455454545445Hkjjkhh嘎嘎嘎你饿饿的 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