第五章 发酵控制5~10.ppt.Convertor

1 第五节 菌体浓度与基质对发酵的影响 一 菌体浓度对发酵的影响 菌体浓度与菌体生长速率直接相关 菌体浓度的大小影响产物的得率 控制培养基中营养物质的含量来控制菌体浓度 参见 P 190 1 2 二 基质对发酵的影响及控制 1 碳源对发酵的影响及控制 不同碳源对毛霉产蛋白酶的影响 2 3 不同浓度麦芽糖对产酶的影响 3 4 2 氮源的种类和浓度对发酵的影响及控制 不同氮源 有机氮 对毛霉产蛋白酶的影响 4 5 不同氮源 无机氮 对毛霉产蛋白酶的影响 5 6 3 磷酸盐对发酵的影响及控制 不同磷盐对毛霉产蛋白酶的影响 6 7 一 CO2 对菌体生长及发酵的影响 第六节 CO2 和呼吸熵 CO2 是微生物在生长繁殖过程中产生的代谢产物 同时也是合成某些代谢产 物的基质 CO2 可以作为微生物生长和发酵的指标 发酵液中 CO2 浓度对微生物生长和合成代谢产物具有刺激或抑制作用 7 8 1 CO2 影响菌体生长 例如 环状芽孢杆菌等的发芽孢子在开始生长 并非孢子发芽 时就需要 CO2 人们将此现象称为 CO2 效应 当发酵液中 CO2 达到 1 6 10 2mol 时 酵母菌生长就受到严重抑制 CO2 是大肠杆菌和链孢霉变株的生长因子 有时需含 30 的 CO2 气体 菌 体才能生长 8 9 2 CO2 影响菌体形态 用扫描电子显微镜观察 CO2 对产黄青霉生长形态的影响 发现菌丝形态 随 CO2 含量不同而改变 当 CO2 含量在 0 8 时 菌丝主要呈丝状 上升到 15 22 时则呈膨胀 粗短的菌丝 CO2 分压再提高到 0 08x105Pa 时 则出现球状或酵母状细 胞 使青霉素合成受阻 9 10 3 CO2 影响产物合成 例如 牛链球菌发酵生产多糖 最重要的条件就是空气中要含有 5 的 CO2 精氨酸发酵 也需要有一定的 CO2 才能得到最大产量 CO2 的最适分 压约为 0 12 105Pa 高于或低于此分压 产量都会降低 当排气中 CO2 浓度高于 4 时 菌体的糖代谢和呼吸速率都下降 当发 酵液中 CO2 达到一定浓度时 则对发酵产生不利的影响 10 11 例如 青霉素生产 排气中 CO2 含量大于 4 时 即使溶解氧在临界氧浓度以上 青霉素合成和菌体呼吸强度都受到抑制 在空气中的 CO2 分压达 0 081 105Pa 时 青霉素的比生产速率下降 50 CO2 对红霉素合成也产生明显抑制作用 从发酵起 15h 起 按进气量的 11 开始导入 CO2 红霉素产量减少 60 而对菌体生长并无影响 CO2 对发酵能产生抑制作用 如对肌苷 异亮氨酸和组氨酸发酵 特别对 抗生素发酵 影响尤为明显 11 12 4 CO2 响影培养液的 pH 值 过多 CO2 的积累导致发酵液 pH 的明显降低 CO2 影响菌体细胞的机制 参见 P 194 12 13 二 排气中 CO2 浓度与菌体量 pH 值 排气氧的关系 1 检测菌体的生长 分析尾气中 CO2 的含量 可测定 计算菌体量 对数期 CO2 释放率与菌体生长速率成正比 13 14 2 补料与排气 CO2 pH 值变化的关系 补糖会增加排气中的 CO2 浓度和降低培养液的 pH 因为补加的糖用于菌 体生长 维持菌体代谢和产物合成三方面 它们都产生 CO2 使 CO2 释放量增加 溶 解的 CO2 和代谢产生的有机酸又使培养液 pH 下降 因此 补糖 CO2 浓度和 pH 三者之间具有相关性 根据 CO2 释放率来控制补糖 也是一种较好的控制方法 14 15 3 呼吸熵与发酵的关系 发酵中的耗氧速率 OUR 亦称摄氧率 可通过热磁氧分析仪或质谱仪测量 进气和排气中的氧含量计算而得 参见 P 195 15 16 呼吸熵 呼吸熵 RQ 值 随微生物菌种的不同 培养基成分的不同 生长阶段的不 同而不同 RQ 值可以反映微生物代谢的状况 如酵母菌 RQ 1 糖有氧代谢 仅 生成菌体 无产物形成 RQ 1 1 糖经 EMP 生成乙醇 P 195 另一方面 RQ 值也可以指导补料 CER 表示单位体积发酵液单位时间内释放的 CO2 的量 P 194 CRR 16 17 三 CO2 浓度的控制 CO2 在发酵液中的浓度受到许多因素的影响 如菌体的呼吸强度 发酵液 流变学特性 通气搅拌程度和外界压力大小等因素 设备规模大小也有影响 为了控制 CO2 的影响 必须考虑在培养液中的溶解度 温度和通气情况 1 根据 CO2 对发酵影响情况而控制其浓度 如果 CO2 对产物合成有抑制作用 则应设法降低其浓度 若有促进作用 则应提高其浓度 17 18 通气和搅拌速率的大小 不但能调节发酵液中的溶解氧 还能调 CO2 的 溶解度 在发酵罐中不断通入空气 既可保持溶解氧在临界值以上 又可随废气排除 所产生的 CO2 使之低于能产生抑制作用的浓度 降低和搅拌速率 有利于增加 CO2 在发酵液中的浓度 反之就减少 CO2 浓度 CO2 的产生还与补料工艺控制密切相关 如在青霉素发酵中 补糖会增加排气中的 CO2 浓度和降低培养液的 pH 所以 采用 CO2 释放率可作为控制补糖的参数 通气搅拌是控制 CO2 浓度的一种方法 18 19 第七节 泡沫的影响及其控制 一 泡沫的性质 1 泡沫产生 通气搅拌 微生物代谢产生 2 泡沫的性质 泡沫实际上是气溶胶构成的胶体系统 其分散相是空气和代谢气 连 续相是发酵液 泡沫间隔着一层液膜而被彼此分开不相连通 参见 P 196 198 19 20 3 泡沫带来的危害 减少发酵的有效容积 液体溢出 增加染菌机会 降低菌体利用率 影响通气搅拌 20 21 二 发酵过程泡沫的影响 1 对通气和搅拌的影响 2 对培养基装料系数的影响 3 影响菌体 可能造成染菌等 三 化学消泡 优点 来源广泛 消泡效果好 作用迅速可靠 用量少 容易实现自动控制 1 化学消泡机理 消泡剂表面张力低 使气泡膜局部的表面张力降低 使得平衡受到破 坏 21 22 2 消泡剂选择的依据及常用的消泡剂种类 1 选用依据 表面活性剂 对气 液界面的散布系数必须足够大 无毒害性 且不影响发酵菌体 不干扰各种测量仪表的使用 在水中的溶解度较小 来源方便 成本低 22 23 2 消泡剂种类 天然油脂 高碳醇 脂肪酸和酯类 聚醚类 硅酮类 3 消泡剂的应用和增效作用 消泡剂 载体 复合消泡剂 消泡剂 乳化剂 23 24 四 机械消泡 1 消泡机理 靠机械强烈振动 压力的变化 促使气泡破裂 或借机械力将排出 气体中的液体加以分离回收 2 优点 节省原料 减少由于消泡剂所引起的污染机会 3 缺点 需要一定的设备和消耗一定的动力 不能从根本上消除引起泡沫温定的因素 24 25 动力小 结构简单 易清洁 运行可靠 维护费用低 4 机械消泡装置的选择依据 25 26 5 机械消泡方式简介 1 罐内消泡 耙式消泡浆的机械消泡 气体吹入罐内吸引消泡 26 27 2 罐外消泡 旋转叶片罐外消泡 27 28 喷雾消泡 离心力消泡 28 29 第八节 发酵终点的判断 确定合适的微生物发酵终点 对提高产物的生产能力和经济效益是很重要的 发酵生产 原材料成本所占比例很大 因此 提高经济效益 就必须提高产 率 即生产能力 Kg m3 h 得率 即转化率 和发酵系数 产物 Kg 罐容积 m3 发酵周期 h 29 30 确定一个合理的放罐时间 需要考虑下列几个因素 1 考虑经济因素 考虑经济因素 就是要以能最大限度地降低成本和最大限度地取得高生产 能力的发酵时间为最适发酵时间 在生产速率较小的情况下 单位体积发酵液每小时产物的增长量很小 如 果继续延长发酵时间 则平均生产能力下降 而动力消耗 管理费用支出 设备消耗 等费用仍在增加 因而使发酵成本增加 所以 要从经济学观点确定一个合理的放罐 时间 P 199 30 31 如果发酵时间太短 会残留过多的尚未代谢的营养物质 如可溶性蛋白 脂 肪等 残留在发酵液中 会增加提取工段的负担 发酵时间太长 菌体自溶 会释放 出菌体蛋白 或酶 增加过滤工序的难度 这不仅使过滤时间延长 甚至使一些不 稳定些的产物遭到破坏 所有这些影响 都可能使产物的质量下降 产物中杂质含量 增加 所以 要考虑发酵周期长短对产物提取工序的影响 2 考虑对产品质量的影响 发酵时间长短对下游工序和产品质量有很大的影响 31 32 在特殊情况下 如染菌 代谢异常 如糖耗缓慢 等异常发酵时 就应根 据不同情况进行适当处理 为了能够得到尽可能多的产物 应该及时采取措施 如改 变温度或补充营养等 并适当提前或拖后放罐时间 合理的放罐时间由实验来确定 即根据不同发酵时间所得的产物产量计算 出发酵罐的生产力和产品成本 采用生产力高而成本又低的发酵时间 作为放罐时间 确定放罐的指标有 产物的产量 过滤速度 氨基氮的含量 菌丝形态 pH 值 发酵液的 外观和粘度等 3 特殊因素 32 33 什么是染菌 发酵过程中除生产菌以外的其它菌侵入了发酵系统并生长繁殖 发酵过 程污染杂菌 会严重影响生产 是发酵工业的致命伤 第九节 发酵生产染菌及其防治 一 染菌的影响 造成大量原材料的浪费 造成巨大的经济损失 影响产品外观及内在质量 扰乱生产秩序 破坏生产计划 参见 P 229 237 33 34 1 发酵染菌对不同品种的影响 不同菌 不同产品 放线菌 由于生长的最适 pH 为 7 左右 因此染细菌为多 而霉菌生长 pH 为 5 左右 因此染酵母菌为多 青霉素发酵染菌 绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶 而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶 不论在发酵前期 中期或后期 染有能产生青霉素酶的杂菌 都能使青霉素迅速破坏 34 35 不 同 产 品 链霉素 四环素 红霉素 卡那霉素等虽不象青霉素发酵染菌那样一无 所得 但也会造成不同程度的危害 如消耗营养干扰生产菌的正常代谢 改变 pH 降 低产量 灰黄霉素 制霉菌素 克念菌素等抗生素抑制霉菌 对细菌几乎没有抑 制和杀灭作用 疫苗生产危害很大 现在疫苗多采用深层培养 是一类不加提纯而直接使用 的产品 一旦污染杂菌 不论死菌 活菌或内外毒素 都应全部废弃 因此 发酵罐 容积越大 污染杂菌后的损失也越大 35 36 2 污染不同种类和性质的微生物的影响 噬菌体的感染力很强 传播蔓延迅速 也较防治 故危害极大 污染 噬菌体后 可使发酵产量大幅度下降 严重的造成断种 被迫停产 有些杂菌会使生产菌自溶 产生大量泡沫 即使添加消泡剂也无法控制逃 液 影响发酵过程的通气搅拌 有的杂菌会使发酵液发臭 发酸 致使 pH 下降 使不耐酸的产品破坏 特别是染芽孢杆菌 由于芽孢耐热 不易杀死 往往一次染菌后会反复染菌 1 污染噬菌体 2 污染其它杂菌 36 37 3 不同时间染菌对发酵的影响 污染时间是指用无菌检测方法确定的污染时间 不是杂菌窜入培养液的时 间 杂菌进入培养液后 需有足够的生长 繁殖的时间才能显现出来 显现 的时间又与污染菌量有关 污染的菌量多 显现染菌所需的时间就短 污染菌量少 显现染菌的时间就长 1 种子培养期染菌 由于接种量较小 生产菌生长一开始不占优势 因而生产菌种防御杂菌 能力低 容易污染杂菌 如在此阶段染菌 应将培养液全部废弃 37 38 2 发酵前期染菌 发酵前期最易染菌 且危害最大 原因 发酵前期菌量不很多 与杂菌没有竞争优势 且还未合成产物 抗生素 或产生很少 抵御杂菌能力弱 在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生 措施 可以用降低培养温度 调整补料量 用酸碱调 pH 值 缩短培养周 期等措施予以补救 如果前期染菌 且培养基养料消耗不多 可以重新灭菌 补加一 些营养 重新接种再用 38 39 3 发酵中期染菌 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢 杂菌大量产酸 培养液 pH 下降 糖 氮消耗快 发酵液发粘 菌丝自 溶 产物分泌减少或停止 有时甚至会使已产生的产物分解 有时也会使发酵液发臭 产生大量泡沫 措施 降温培养 减少补料 密切注意代谢变化情况 如果发酵单位到达一定水 平可提前放罐 或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐 抑制 杂菌 39 40 4 发酵后期染菌 发酵后期发酵液内已积累大量的产物 特别是抗生素 对杂菌有一定的 抑制或杀灭能力 因此如果染菌不多 对生产影响不大 如果染菌严重 又破坏性较 大 可以提前放罐 40 41 二 发酵染菌对提炼和产品质量的影响 1 发酵染菌对过滤的影响 染菌的发酵液一般发粘 菌体大多数自溶 所以在发酵液过滤时不能或 很难形成滤饼 导致过滤困难 即使采取加热 冷却 添加助滤剂等措施 使部分蛋 白质凝聚 但效果并不理想 污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异 如污染霉菌时 影响较小 而 污染细菌时很难过滤 由于过滤困难 过滤时间延长 影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用 染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率 直接影响提炼总收率 41 42 2 发酵染菌对提炼的影响 采用有机溶剂萃取的提炼工艺 则极易发生乳化 很难使水相和溶剂相 分离 影响进一步提纯 采用直接用离子交换树脂的提取工艺 如链霉素 庆大霉素 染菌后大 量杂菌黏附在离子交换树脂表面 或被离子交换树脂吸附 大大降低离子交换树脂的 交换容量 而且有的杂菌很难用水冲洗干净 洗脱时与产物一起进入洗脱液 影响进 一步提纯 染菌发酵液比正常发酵液中含有更多的 水溶性蛋白和其它杂质 42 43 总染菌率 二 染菌的原因 一 发酵染菌率计算基准 总染菌率指一年发酵染菌的批 次 数与总投料批 次 数之比的百分率 染菌批次数应包括染菌后培养基经重新灭菌 又再次染菌的批次数在内 这是习惯的计算方法 也是我国的统一计算方法 43 44 二 染菌原因 造成染菌的因素很多 但总结几十年的经验 对绝大部分罐批染菌的原 因是比较清楚的 但在实际生产中发酵染菌率仍比较高 可以说产生这种现象大多数 是由于工作中 不负责任 侥幸心理 甚至 明知故犯 和所造成的 例如 灭菌的蒸汽压不足不能灭菌 设备有渗漏不能进罐等等都是众所周 知的 但因为有侥幸心理还是照样灭菌 进罐 结果以污染杂菌而告终 国内外几家抗生素工厂发酵染菌原因 44 45 项目 百分率 种子带菌或怀疑种子带菌 9 64 接种时罐压跌零 0 19 培养基灭菌不透 0 79 总空气系统有菌 19 96 泡沫冒顶 0 48 夹套穿孔 12 36 盘管穿孔 5 89 接种管穿孔 0 39 阀门渗漏 1 45 搅拌轴密封渗漏 2 09 罐盖漏 1 54 其它设备渗漏 10 13 操作原因 10 15 原因不明 24 94 日本工业技术院发酵研究所对抗生素发酵染菌原因的分析 45 46 上海第三制药厂染菌原因分析 项目 百分率 种子带菌 14 15 盘管穿孔 14 20 阀门渗漏 23 30 空气系统有菌 10 0 管理不善 25 80 其它 7 49 原因不明 5 78 46 47 造成染菌的主要原因总结 1 设备渗漏 设备渗漏包括 夹套穿孔 盘管穿孔 接种管穿孔 阀门渗漏 搅拌轴渗 漏 罐盖漏和其它设备漏等 从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析发现 这类染菌占 33 85 上海三厂的分析这类染菌为 37 5 所以说加强设备本身及附属零部件的严 密度检查 对制服染菌是极其主要的 也是重要的 47 48 2 空气带菌 从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气带菌而造成的染菌分别为 19 96 和 26 国内外空气除菌技术虽已有较大改善 但仍然没有使染菌率降低到理 想的程度 因为空气除菌系统较为复杂 环节多 偶遇不慎便会导致空气除菌失败 3 种子带菌 种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌 加强种子管理 严格 无菌操作 种子本身带菌是可以克服的 种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造 成 48 49 4 灭菌不彻底 蒸汽通入培养基 升温快慢 保温时间 蒸汽总压是否达到要求标准 环境中的杂菌数量因季节而有很大差别 灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系 原材料储存和保管 如液胨 玉米浆 母液糖等有机原料 杂菌的数量 发酵罐 培养基配制罐等设备的清洗质量 有无灭菌的死角 对减少或避免染 菌仍然是十分必要的 49 50 5 技术管理不善 技术管理就是要对发酵每个环节严格控制 发酵中稍有不慎就可能染菌 所以不能有侥幸心理而放松管理 三 无菌状况的检测 1 环境无菌的检查 2 种子及发酵液无菌状况检测 尘埃粒子检测 无菌平板检测 肉汤培养基检测 平板划线 显微镜观察 50 51 四 染菌情况分析 染菌的原因有多种 在实际生产中应分析具体情况 1 单罐染菌 不是系统问题 而是该罐本身的问题 如种子带菌 培养基灭菌不彻底 罐有渗漏 分过滤器失效等 51 52 2 多罐染菌 系统问题 如空气过滤系统有问题 特别是总过滤器长期没有检查 可能 受潮失效 移种或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底 3 前期染菌 种子带菌 培养基灭菌不彻底 4 中后期染菌 补料的料液灭菌不彻底或补料管道 阀门渗漏 一般不会是种子问题 52 53 五 染菌的防治 1 防止种子带菌 制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制 沙土制备时要多次间歇灭菌 注意接种时的无菌操作 子瓶 母瓶的移种和培养 无菌室和摇床间都要保持清洁 无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气 还要装紫外灯用以灭菌 或用化学药 品灭菌 53 54 2 防止设备渗漏 设备渗漏原因 发酵设备及附件由于化学腐蚀 电化学腐蚀 物料与设备摩 擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导致设备及附件渗漏 设备上一旦渗漏 就会造成染菌 例如冷却盘管 夹套穿孔渗漏 有菌的冷 却水便会通过漏孔而进入发酵罐中招致染菌 阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发 酵罐而造成染菌 设备上的漏隙如果肉眼能看见 容易发现 也容易治理 但有的微小泄漏 肉眼看不见 必须通过一定的试漏方法才能发现 54 55 3 防止培养基灭菌不彻底 培养基灭菌方法 高压蒸汽灭菌 分批灭菌 1210C 30 分钟 连续灭菌 罐温 125 1300C 30 45 分钟 蒸汽下进上出 55 56 4 防止空气引起的染菌 空气过滤除菌设备流程 空压机 储罐 二级冷却 加热器 空气过滤 粗过滤 56 57 空气冷却器的列管穿孔泄露 冷却水会渗入到空气中 造成染菌 棉花 活性炭过滤器长期使用后 棉花和活性炭的体积被压缩而松动 如果 上下端棉花铺得厚薄不均 厚的一边阻力大空气不畅通 薄的一边空气容易通过 久 而久之 薄的一边长期受空气顶吹而使棉花活性炭改变位置 造成过滤器失效 空气染菌的可能原因 57 58 过滤器用蒸汽灭菌时 若被蒸汽冷凝水润湿就会降低或丧失过滤效能 灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气 将水分吹干 超细纤维纸作过滤介质 灭菌时必须将管道中冷凝水放干净 以免介质受 潮失效 在生产实践中 空气管道大多与其它物料管道相接 要装上止逆阀防 止其它物料窜入空气管道污染过滤器 导致过滤介质失效 58 59 5 发酵染菌后的措施 染菌后的培养基必须灭菌后才排放 否则由于各罐的管道相通 会造成其它罐的 染菌 而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌 凡染菌的罐都要找到染菌的原因 对症下药 该罐也要彻底清洗 进行空罐消毒 才可进罐 染菌严重时 车间环境要用石灰消毒 空气用甲醛熏蒸 特别 若染噬菌体 空 气必须用甲醛蒸汽消毒 59 60 六 染噬菌体的防治 一 染噬菌体对发酵的影响 发酵过程中如果受噬菌体的侵染 一般发生溶菌 随之出现发酵迟缓或停止 而且受噬菌体感染后 往往会反复连续感染 使生产无法进行 甚至使种子全部丧失 60 61 染噬菌体表现为 1 镜检可发现菌体数量明显减少 菌体不规则 严重时完全看不到菌体 且是在 短时间内菌体自溶 2 发酵 pH 值逐渐上升 4 8 小时之内可达 8 0 以上 不再下降 3 发酵液残糖高 有刺激臭味 粘度大 泡沫多 4 生产量甚少或增长缓慢或停止 有无染噬菌体 最根本的是要做噬菌斑检验 61 62 二 产生噬菌体的原因 通常在工厂投产初期并不感到噬菌体的危害 经过 1 2 年以后 主要是由于 生产和试验过程中不断不加注意地把许多活菌体排放到环境中 自然界中的噬菌体就 在活菌体中大量生长 造成了自然界中噬菌体增殖的好机会 这些噬菌体随着风沙尘 土和空气流动传播 以及人们的走动 车辆的往来也携带着噬菌体到处传播 使噬菌 体有可能潜入生产的各个环节 尤其是通过空气系统进入种子室 种子罐 发酵罐 62 63 三 染噬菌体的检测 双层琼脂平板法 在培养皿上倒入培养生产菌的培养基 加琼脂 作下层 同样的培养基 中加入 20 30 培养好的种子液 再加入怀疑染噬菌体的发酵液 摇均匀后 铺上 层 培养过夜观察培养皿上是否出现噬菌斑 也可以在上层培养基中不加怀疑染噬菌体的发酵液 而将发酵液直接点种 在上层培养基表面 培养过夜 观察有无透明圈出现 63 64 三 噬菌体的防治 1 必须建立工厂环境清洁卫生制度 定期检查 定期清扫 车间四周有严 重污染噬菌体的地方应及时撒石灰或漂白粉 2 车间地面和通往车间的道路尽量采取水泥地面 3 种子和发酵工段的操作人员要严格执行无菌操作规程 认真地进行种子保 管 不使用本身带有噬菌体的菌种 感染噬菌体的培养物不得带入菌种室 摇瓶间 64 65 4 认真进行发酵罐 补料系统的灭菌 严格控制逃液和取样分析和洗罐所 废弃的菌体 对倒罐所排放的废液应灭菌后才可排放 5 选育抗噬菌体的菌种 或轮换使用菌种 6 发现噬菌体停搅拌 小通风 将发酵液加热到 70 800C 杀死噬菌体 才 可排放 发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌 65 66 小 结 染菌对发酵的危害 干扰生产菌的正常代谢 降低产量 改变 pH 降解某些产物 污染不同的微生物 不同阶段染菌危害 染菌对提炼的危害 过滤困难而大幅度降低过滤收率 有机溶剂萃取时发生乳化 66 67 染菌原因 设备渗漏 空气带菌 种子带菌 灭菌不彻底 技术管理不善 染菌后的措施 染菌防治 发酵液必须灭菌后才可放下水道 寻找染菌的原因 染菌厉害时 车间环境要用石灰消毒 防止种子带菌 防止设备渗漏 防止培养基灭菌不彻底 防止空气引起的染菌 67 68 产生噬菌体的原因 活菌体随意排放 造成噬菌体的感染源 噬菌体的防治 危害 造成断种 无法生产 建立工厂环境清洁卫生制度 感染噬菌体的培养物不得带入菌种室 摇瓶间 发现噬菌体停搅拌 小通风 将发酵液加热到 70 800C 杀死噬菌体 才可排放 环境用漂白粉消毒 选育抗噬菌体的菌种 68 69 在线检测必须用专门的传感器 也叫电极或探头 放入发酵系统 将发酵的 一些信息传递出来 为发酵控制提供依据 黑箱 灰箱 检测仪器 气相色谱 高效液相 离子色谱 双向电泳 毛细管电泳 红外光谱 基因测序仪等 检测代谢中间物 分析代谢流向 RNA 检测 一 参数在线检测 第十节 发酵过程检测与自控 P 199 69 70 由于微生物培养过程是纯培养过程 无菌要求高 因此对传感器有特殊 要求 P 201 插入罐内的传感器必须能经受高压蒸汽灭菌 材料 数据 传感器结构不能存在灭菌不透的死角 以防染菌 密封性好 传感器对测量参数要敏感 且能转换成电信号 响应快 灵敏 传感器性能要稳定 受气泡影响小 70 71 化学或物理信号 电信号 放大 记录显示仪 控制器 与设定参数比较 发出调节信号 控制器动作 检测原理 71 72 一 pH 测量 pH 值的测量在生物反应中普遍进行 对于生物过程控制是一个非常重要 的参数 pH 测量方法 pH 试纸 pH 电极 pH 试纸曾经是一种广泛采用的方法 优点 方便 易操作 缺点 它主观性较强 质量差异 不同厂家不同批号的 pH 试纸测出的 pH 值会有较大的差别 有时甚至达 0 5 1 对于一些要求较高的场合就不适用 72 73 1 pH 电极测量原理 pH 电极实际上是由参比电极与指示电极组成的一个自发电池 该电池的表达式可 写为 参比电极 溶液 X 指示电极 该电池的参比电极的输出电位恒定 指示电极的输出电位随被测体系中氢 离子活度而变化 因此整个自发电池的电动势就是被测体系中氢离子活度的函数 E E0 ln1 E0 2 303 pH 式中 E0 对某一给定电极为常数 是温度的函数 因此从电位差计的 E 值可测出 pH 值 73 74 甘汞电极 a 232 型 b 217 型 1 导线 2 加液口 3 KCl 溶液 4 素烧瓷芯 5 铂丝 6 Hg 7 Hg2Cl2 参比电极 2 参比电极 一般的参比电极是甘汞电极 74 75 3 指示电极 指示电极的电位值随被测溶液氢离子活度的变化而变化 原则上讲 任 何与氢离子可逆反应的电极都可用来测定溶液的 pH 离子选择性电极结构中的敏感性膜部分随组成材料的不同而各有特色 测定 pH 值的玻璃电极的敏感膜是厚度为 10 1 10 3mm 的玻璃薄膜 其 电阻为 50 500m 离子选择性电极的结构 75 76 指示电极的关键是敏感膜 H H H H H H KCl 溶液 待测溶液 浓度差引起电位差 浓差电极 玻璃敏感膜 76 77 玻璃电极的性能 a 存在不对称电势 不对称电势产生于电极敏感玻璃膜部分 由于膜内外表面状态不完全一 样引起的 它与温度 玻璃组成 敏感膜厚度及加工状况等因素有关 不对称电势可 以用已知 pH 值的标准缓冲液来校正 b 零电势或等电势点 电极电位为零时的溶液 pH 值称为零电势 pH 值 该值取决于内参比溶液的 pH 值 含有 0 025mol l 的 KCl 和等摩尔浓度的磷酸混合缓冲液的等电势点为 pH 7 在 pH7 时 玻璃电极的极性发生改变 77 78 C 玻璃电极的测量范围 玻璃电极的实际转换系数并不是在整个 pH 范围都是常数 因而响应曲 线会偏离直线 实际的 pH 响应曲线如图 测量值 pH 在碱性范围内 pH 10 k 降低 测量值偏高 在酸性范围内 pH 1 k 升高 测量值偏低 78 79 d 玻璃电极的使用限制 对于蛋白质等粘度较大的测量体系 容易在玻璃电极敏感膜上产生沉积 应设法 缩短电极的沉浸时间或设法对电极表面进行清洗 工业测试中常用特制毛刷或超声波 清洗电极表面 强碱或其它对膜材料有腐蚀性的溶液 如氢氟酸溶液会破坏电极 脱水性介质 如无水乙醇 浓硫酸会破坏水合硅胶层 79 80 4 复合电极 将两支电极都装在一根玻璃管中 这种电极叫复合电极 工业上在线检 测大都使用这种电极 它结构紧凑 便于安装 80 81 二 敏化离子选择性电极 以离子选择性电极为基础电极 通过化学反应或生化反应使离子选择性电 极的响应得到敏化 叫作敏化离子选择性电极 包括有气敏电极和酶电极等 气敏电极是基于界面化学反应的敏化电极 在某种离子选择性电极的表面覆盖一层憎水的透气膜 在透气膜和这种 离子选择性电极之间充以中间溶液 透气膜不允许溶液中的离子通过 而只允许被测 定的气体通过 直到透气膜内外两边该气体的分压相等 进入透气膜的气体与中间溶液起反应 从而使中间溶液中的某一被离子选 择性电极响应的物质的量发生变化 并通过选择性电极电位反映出来 达到间接表征 被测气体含量的目的 81 82 能用气敏电极测定气体有 CO2 NH3 SO2 NO2 H2S HCN HF Cl2 Br2 I2 的蒸气等 其中以氨电极 比较成熟 应用较广 1 NH4 的测量 氨是酶反应中最常见的产物和反应物 氨离子可用氨气敏电极来测定 常用的氨 电极为 82 83 1 电极管 2 透气膜 3 0 1mol LNH4Cl 溶液 4 pH 玻璃电极 5 Ag AgCl 参比电极 6 7 玻璃膜 8 可卸电极头 9 内参比溶液 10 内参比电极 在电极管内装有玻璃电极 Ag AgCl 电极 底部装有一微孔透气膜 玻璃电极的 敏感膜紧贴于透气膜上 中间有一极薄的液层 当氨通过透气膜渗入内充液薄层 即 发生如下反应 NH3 H2O NH4 OH 83 84 内充液中 NH4 远大于生成的 NH4 故其变化可以忽略不计 而薄层的 pH 则由于 OH 的生成而升高 因此由玻璃电极检出 OH 的浓度 即可检出 NH3 的浓度 电极电位与氨的浓度是对数响应 透气膜一般是 0 1mm 厚的微孔聚四氟乙烯 内充液为 0 1mol L 的 NH4Cl 溶液 氨电极使用的上限为 1mol L 下限为 10 6mol L 84 85 2 CO2 的测量 1 CO2 电极 测溶液中的 CO2 结构与氨电极类似 测量 CO2 时 气体透过电极膜 CO2 和水反应 达到以下平 衡 CO2 H2O HCO3 H 产生的氢离子引起 pH 的变化 就可以测出溶解 CO2 的浓度 85 86 2 尾气 CO2 的测量 常用的尾气测定仪是不分光红外线二氧化碳测定仪 简称 IR 其精度 高 可达 0 5 量程的线性范围大 虽然仪器价格高 但在生物细胞培养时常被采 用 3 尾气氧的仪器分析 采用热磁氧分析仪测定 原理是氧具有高顺磁性 在磁场中 氧气的磁化率比其它气体高几百倍 故混合气体的磁化率几乎完全取决于含氧气的多少 将排气通入热磁氧分析仪 就可 测出排气氧的含量 86 87 三 溶氧的测定 对于好氧微生物来说氧的供应十分重要 了解发酵过程中溶氧情况是 发酵控制的关键方面 现在发酵中溶氧测定大多用溶氧电极来测定 溶氧电极可分为 极谱型和原电池型 极谱型 需极化电压及放大器 耗氧少 受气流影响小 原电池型 简单便宜 适于中小罐 耗氧较大 受气流和气泡影响大 87 88 现在国内外测定溶液中的溶解氧基本上用极谱型的复膜氧电极 复膜氧电极可分为 敞口式 封闭式 88 89 1 复膜氧电极的工作原理 阴极由铂 银 金等贵金属组成 阳极由铅 锡 铝等组成 当给电极 施加极谱电压 0 6 0 8V 负电压 时 溶液中的氧就在阴极被还原 当产生的电流与 溶液中氧含量成正比时 此时的电极电流为饱和电流 此时的电压为极谱电压 氧浓 度与饱和电流成正比关系 在阴极表面发生的电极反应 1 2O2 H2O e 2OH 阳极上的反应是 Pb 2ACO Pb ACO 2 2e 二电极之间形成电流 将氧的信号转变成电信号 氧浓度越高 电流越大 89 90 2 溶氧电极的影响因素 1 电极的灵敏度 电极的阴极表面覆盖了半透膜之后 在一定条件下当膜成为氧扩散的控制因 素时 氧分压的变化与电流输出的稳态有以下对应式 IS NFA pm dm pO2 式中 IS 电