冰冻切片的免疫荧光

中山大学附属第一医院肾内科实验室 免疫荧光通用操作规程免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光冰冻切片的免疫荧光 1 动物组织直接 OCT 包埋 或灌流后的组织 30 蔗糖溶液 4 过 夜后 OCT 包埋 20 保存 3 月 80 长期保存 请勿保存于液 氮 2 冰冻切片机切片至少 10um 空气干燥 2 分钟后 20 储存 3 切片从 20 取出后 在通风橱放 10 30 分钟以去除水汽 4 PFA 固定 15 分钟 或 20 丙酮固定 15 分钟置通风橱 2 小时 4 1XPBS 清洗玻片 3X5min 从此请保持玻片湿润 5 有时 抗原修复 3 小时会得到更好的结果 为此请 选用稳定的 抗原修复方式 真空负压 微波修复 高压修复 隔水加热 电炉加热 关注修复的温度 时间 抗原修复时在有效的温度范围内所持 续的时间 抗原修复液必须遵循自然降温规律 使用足量的抗原修 复液 选择不同 PH 值的修复液 A 液 枸盐酸缓冲液 PH6 0 B 液 EDTA Na 缓冲液 PH8 0 C 液 枸盐酸缓冲液 PH4 5 6 室温封闭 1 小时 封闭液 5 BSA 10 二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS 条件封闭液 1 BSA 3 二抗种属来源的正常血清 in 中山大学附属第一医院肾内科实验室 1xPBS 细胞因子 无需封闭的蛋白 7 一抗 4 过夜 请用封闭液稀释一抗 8 第二天 Wash 1XPBS 2x1min 9 二抗 1 1000 alexa 系列 1 300 dyelight in 封闭液 避光室 温 1 小时 10 Wash 1XPBS 3x5min 11 DAPI 染核 5min 12 DDW Rinse 13 抗淬灭剂封片 避免气泡 避光置于通风橱过夜 14 干片后 4 保存 石蜡切片的免疫荧光石蜡切片的免疫荧光 1 动物组织取出后经固定 脱水 包埋 见随后操作步骤 制成石蜡 包块 2 组织学染色切片厚度 2um 免疫荧光染色切片厚度至少 6um 切片复水 58 20min xylene 2x10min 100 EtoH2x10min 95 EtoH2x10min 中山大学附属第一医院肾内科实验室 70 EtoH10min DDW5min 4 Rinse 玻片 1xPBS 从此请保持玻片湿润 5 抗原修复过夜 为此请 选用稳定的抗原修复方式选用稳定的抗原修复方式 真空负压 微波修复 高压修复 隔水加热 电炉加热 关注修复的温度关注修复的温度 时间时间 抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间 抗原修复液必须抗原修复液必须 遵循自然降温规律 使用足量的抗原修复液遵循自然降温规律 使用足量的抗原修复液 选择不同选择不同 PH 值的修值的修 复液复液 A 液 枸盐酸缓冲液 PH6 0 B 液 EDTA Na 缓冲液 PH8 0 C 液 枸盐酸缓冲液 PH4 5 6 室温封闭 1 小时 封闭液 5 BSA 10 二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS 条件封闭液 1 BSA 3 二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS 细胞因子 无需封闭的蛋白 7 一抗 4 过夜 请用封闭液稀释一抗 如果没有二抗种属来源的正常血清 细胞 因子用 1 BSA 封闭 同时一定要有一个阴性对照 8 第二天 Wash 1XPBS 2x1min 9 二抗 1 1000 alexa 系列 1 300 Dyelight in 封闭液 避光 室温 1 小时 10 Wash 1XPBS 3x5min 11 DDW Rinse DAPI 染核 5min 12 DDW Rinse 13 抗淬灭剂封片 避免气泡 避光置于通风橱过夜 中山大学附属第一医院肾内科实验室 14 干片后 4 保存 备注 备注 多重荧光染色原则多重荧光染色原则 A 尽量选择不同种属来源的一抗 可同时染 B 如果种属来源相同的一抗 可顺次染色 抗原修复 O N 第一个一抗 4 O N 第二天对应二抗 RT 1hr 红光 短暂地封闭 第二个一抗 RT 2hr 对应二抗 RT 1hr 绿光 DAPI 封片 备注 备注 对照实验对照实验 A 阴性对照 组织免疫荧光必做 相同标本 只加荧光二抗 排除非特异性染色 不同样本 采用确定不含一抗对应抗原的标本验证荧光信号的特异 性 B 阳性对照 采用确定含有一抗对应抗原的标本 TUNEL 与免疫荧光共染时 细胞的免疫荧光细胞的免疫荧光 1 细胞生长贴壁到 80 融合 倒掉细胞培养液 2 Rinse 用固定剂 rinse 一到两次 3 首选 4 多聚甲醛固定 15min 0 2 TritonX 100 打孔 5 中山大学附属第一医院肾内科实验室 10min 或者选用不同的固定方式 甲醇 分析纯 or HPLC 20 10min 丙酮 HPLC 20 10min 4 多聚甲醛 0 2 TritonX 100 10min 4 多聚甲醛 0 2 Saponins10min 细胞核核膜 4 多聚甲醛 15min 20 甲醇 5min 细胞膜 4 多聚甲醛 15min 20 丙酮 5min 细胞骨架 微管蛋白 4 多聚甲醛 10min RT 4 10min 20 甲醇 1min 细胞膜 胞浆蛋白 细胞核 4 Wash 1xPBS 2x1min 从此请保持细胞湿润 5 室温封闭 1 小时 封闭液 5 BSA 10 二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS 条件封闭液 1 BSA 3 二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS 6 一抗 4 过夜 请用封闭液稀释一抗 7 第二天 Wash 1XPBS 2x1min 8 二抗 1 1000 alexa 系列 1 300 Dyelight in 封闭液