微生物限度检查标准程序

微生物限度检查标准程序微生物限度检查标准程序 1 目的 建立个微生物限度检查标准程序 2 范围 适用于各种原辅料 部分成品及验证的微生物限度检查的 操作 3 职责 检验人员对本规程的实施负责 4 程序 4 1 总则 4 1 1 本法是指非规定灭菌制剂及其原 辅料受到微生物污染程 度的一种检查方法 包括染菌量及控制菌的检查 4 1 2 供试品应随机抽样 一般抽样量为检验用量 2 个以上最 小包装单位 的 3 倍量 4 1 3 检查全过程应严格遵守无菌操作 严防再污染 4 1 4 除另有规定外 本检查法中细菌培养温度为 30 35 霉菌 培养温度为 25 28 控制菌培养温度为 36 1 4 1 5 检验结果的报告以 1g 1ml 或 10cm2为单位 4 2 供试品的检验量 每批供试品检验量一般为 10g 或 10ml 供试 品须取自 2 个以上的包装单位 4 3 供试液的制备 按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜 的方法制成供试液 4 3 1 液体供试品 取供试品 10ml 加入稀释剂 90ml 中 混匀 作为供试液 4 3 2 固体供试品 称取供试品 10g 置 0 9 无菌氯化钠 100ml 中 用匀浆仪或其 它适宜办法 混匀后 作为供试液 在制备过程中 必要时可加适 量聚山梨酯 80 并适当加温 但不应超过 45 4 3 3 含抑菌成份供试品 供试品如干扰控制菌检验 可用下列方法处理后 依法检查 4 3 3 1 稀释法 将供试液种入较大量的培养基中 使该供试液稀释至不具抑菌 作用的浓度 4 3 3 2 离心沉淀集菌法 取规定量的供试液 离心 每分钟 3000 转 30min 弃去上清 液 留底部集菌液约 2ml 再稀释成原规定量的供试液 如有不溶 性药渣 可将离心 每分钟 500 转 5min 取全部上层液 再行集 菌处理 4 3 3 3 薄膜过滤法 取规定量的供试液 置稀释剂 100ml 中 摇匀 以无菌操作加 入装有直径约 50mm 孔径不大于 0 45um 0 2um 微孔滤膜的薄膜 过滤器内 减压抽干后 用稀释剂冲洗滤膜 3 次 每次 50 100ml 取出滤膜备检 4 3 3 4 中和法 凡含磺胺 汞 砷类或防腐剂的供试品 可用相应的试剂钝化 活性因子 中和毒性后制成供试液 4 4 对照用菌液 控制菌检查均应做相应已知菌的对照试验 对照 菌株为 大肠杆菌 CMCC B 44 102 取相应菌株的营养琼脂培养基斜面 新鲜培养 物 1 白金耳 接种置营养肉汤培养基内 培养 18 20 小时 稀释至 1 106 对照菌的加入量为 50 100 个 4 5 检查法 4 5 1 细菌 霉菌计数 4 5 1 1 平皿菌落计数法 4 5 1 1 1 取均匀供试液 进一步稀释成 1 102 1 103等适宜的 稀释级 分别取连续三级 10 倍稀释的供试液各 1ml 置直径约 90mm 的平皿 中 再注入约 45 的培养基约 15ml 混匀 待凝固后 倒置培养 每稀释级应作 2 3 个平皿 营养琼脂培养基用于细菌计数 玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌 计数 在特殊情况下 前者同时点计霉菌菌落数 后者同时点计细 菌菌落数 4 5 1 1 2 菌数测定阴性对照试验 取供试验用的稀释剂各 1ml 置于 4 个无菌平皿中 分别按细菌 霉菌计数用的培养基制 备平板 培养 检查 不得长菌 细菌培养时间为 48h 分别在 24h 及 48h 点计菌落数 一般以 48h 菌落数为准 霉菌培养时间为 72h 分别在 48h 及 72h 点计菌落 数 一般以 72h 菌落数为准 菌落如蔓延生长成片 不宜计数 点计后 计算各稀释级平均菌落数 按菌落报告规则报告菌数 4 5 1 1 3 菌数报告规则 细菌宜选取平均菌落数在 30 300 之 间的稀释级 霉菌宜选取平均菌落数在 30 100 之间的稀释级作 为报告菌数计算的依据 如有 1 个稀释级在 30 300 30 100 之间时 将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告 如同时有 2 个稀释级在 30 300 30 100 之间时 按下式计算两级比值 高稀释级的平均菌落数 稀释倍数 比值 低稀释级的平均菌落 稀释倍数 当比值 2 时 以两稀释级的均值报告 当比值 2 时 以低稀 释级平均菌落数乘以稀释倍数报告 如同时有 3 个稀释级的平均菌 落数均在 30 300 之间时 以后 2 个稀释级计算级间比值报告 如各 稀释级的平均菌落数均不在 30 300 之间 以最接近 30 或 300 的稀 释级平均菌落数乘以稀释倍数报告 如各稀释级平均菌落数均在 300 100 以上 按最高稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告 如 各稀释平均菌落数均小于 30 时 一般按最低稀释级平均菌落数乘以 稀释倍数报告 如当 1 10 或 1 100 稀释级平均菌落数等于或大于 原液 或 1 10 稀释级时 应以培养基稀释法测定 按测定结果报 告菌数 4 5 1 2 培养基稀释法 取供试液 原液或 1 10 1 100 供试液 3 份 每份各 1ml 分别注入 5 个平皿内 每皿各 0 2ml 每 1 个平皿倾注营养琼脂培养基约 15ml 混匀 凝固后 倒置培养 计数 每 1ml 注入的 5 个平板的菌落数之和 即为每 1ml 的菌 落数 共得 3 组数据 以 3 份供试液菌落数的平均值乘以稀释 倍数报告 如各稀释级平板均无菌落生长 或仅最低稀释级平均菌落数小 于 1 时 则报告菌落数为小于 10 个 4 5 2 控制菌 大肠杆菌 检查 4 5 2 1 取胆盐乳糖培养基 3 份 每份各 100ml 2 份分别加入 规定量的供试液 其中 1 份加入对照菌 50 100 个作阳性对照 第 3 份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照 培养 18 24h 必要 时可延至 48h 阴性对照应无菌生长 4 5 2 2 取上述 3 份的培养物各 0 2ml 分别接种至 5mlMUG 培 养基管内培养 分别于 5h 24h 时 取未接种的 MUG 培养基管 作本底对照 将各管置 365nm 紫外光下观察 阳性对照管呈现荧 光 MUG 阳性 供试液的 MUG 管呈现荧光 MUG 阳性 无荧 光 MUG 阴性 然后加数滴靛基质试液于 MUG 管内 液面呈玫 瑰红色为阳性 呈试剂本色为阴性 4 5 2 3 当阴性对照呈阴性 阳性对照正常生长 供试液胆盐乳 糖培养基培养液澄明 并证明无菌生长 判未检出大肠杆菌 供 试液 MUG 阳性 靛基质阳性 判检出大肠杆菌 MUG 阴性 靛 基质阴性 判未检出大肠杆菌 4 5 2 4 如 MUG 阳性 靛基质阴性 或 MUG 阴性 靛基质阳 性 均应取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂 平板或麦康凯琼脂平板 培养 18 24h 如上述供试液培养物的分 离平板无菌落生长 判未检出大肠杆菌 或有菌落生长 应挑选 2 3 可疑菌落作靛基质试验 I 甲基红试验 M 乙酰甲基甲 醇生成试验 V P 枸橼酸盐利用试验 C 及革兰染色 镜检 按表 1 规定判定结果 4 5 2 5 靛基质试验 I 取可疑菌落或斜面培养物 接种于蛋 白胨水培养基中 培养 24h 沿管壁加入靛基质试液数滴 液面 呈玫瑰红色为阳性 呈试剂本色为阴性 甲基红试验 M 取可疑菌落或斜面培养物 接种于磷酸盐葡 萄糖胨水培养基中 培养 48 2h 于管内加入甲基红指示液数滴 立即观察 呈鲜红色或橘红色为阳性 呈黄色为阴性 乙酰甲基甲醇生成试验 V P 取可疑菌落或斜面培养物 接种 于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中 培养 48 2h 于每 2ml 培养液中加 入 萘酚乙醇试液 1ml 混匀 再加 40 KOH 溶液 0 4ml 充分振 摇 在 4h 内出现红色为阳性 无红色反应为阴性 枸橼酸盐利用试验 C 取可疑菌落或斜面培养物 接种于枸 橼酸盐培养基的斜面上 一般培养 48 72h 培养基斜面有菌落生长 培养基由绿色变为蓝色时为阳性 培养基颜色无改变为阴性 结果判断见表 1 对与 MUG I 反应不符的可疑菌株 见注 应重新分离培养 再作生化试验证实 表 1 MUG 的结果判断 MUG I曙红亚甲蓝琼脂IMVic结 果 检出大肠杆菌 未检出大肠杆菌 无菌生长未检出大肠杆菌 有菌生长 检出大肠杆菌 有菌生长 检出大肠杆菌 注 如 出现 或 出现 均应重新分离菌株 再作 MUG I 和 IMVic 试验 革兰阴性杆菌 5 仪器和用具 5 1 操作台 检验操作在超净工作台内进行 工作台设在半无菌操 作室内 室内设有紫外线灯使室内灭菌 室内装有空调设备 控 制室温在 20 25 5 2 恒温培养箱 两台 各设定在 35 37 及 24 26 分别作细 菌和霉菌培养用 5 3 高压蒸汽灭菌锅 5 4 电热干燥箱 50 300 5 5 扭力天平 5 6 酒精灯 5 7 玻璃器皿 培养皿 刻度吸管 三角烧瓶 毛细滴管 刻度离 心管 试管等 6 试液 试剂 6 10 9 无菌氯化钠溶液 取氯化钠 9 0g 加水溶解使成 1000ml 121 灭 菌 20 分钟 6 2 95 乙醇 6 3 靛基质试液 取对二甲氨基苯甲醛 5 0g 加入戊醇 或丁醇 75ml 充分振摇 使完全溶解后 再取浓盐酸 25ml 徐徐滴入 边滴边振摇 以