微柱凝胶检测技术

微柱凝胶检测技术在输血前相容性试验中的应用,主要内容,一、血凝试验技术发展二、在血型检测中的应用三、在抗体筛查中的应用四、在交叉配血中的应用,一、血凝试验技术发展,血凝实验：是指抗体和红细胞在液体介质中发生的肉眼可见的凝集反应。根据介质的不同可以分为下列5种盐水法凝聚胺法酶介质凝集试验试管抗人球蛋白法MGIA- Coombs试验（微柱凝胶）,盐水介质法,是最早最简单的方法。悬浮于盐水介质中的红细胞与相应抗体分子结合，交叉联结形成肉眼可见的凝集。主要检测IgM类抗体（ABO系统、抗E）。,盐水介质法,盐水介质法,结果分析：先观察有无溶血、再观察有无凝。要求：细胞浓度25%、血清与细胞比例、反应温度、弱凝集分析优点：简便、快捷、直观、成本低。缺点：不能发现不完全抗体人为因素影响大,聚凝胺试验,原理：MPT法是利用阴离子溶液和聚凝胺减少 红细胞表面的阳离子层及Zeta电位，促 进IgG与红细胞的结合，缩短红细胞之间 的距离而使红细胞凝集。,聚凝胺试验,+ + +聚凝胺,+,无凝集,+,有凝集反应,- - - - - 枸橼酸纳- - - - -,聚凝胺试验,优点简便快捷，可用于某些不完全抗体检测。缺点它受冷凝集、肝素等因素的影响较大灵敏度低，对抗-K漏检人为影响因素大振摇的力度和解聚的时间需要严格掌握，要求轻轻转动试管并同时观察结果，观察时间不应超过1 min，弱凝集用力振摇或放置时间稍长便可能消失。试验结果需在显微镜下观察，故对操作者的技术要求较高，也增加了结果判断的不确定性。,聚凝胺试验,凝聚胺技术在交叉配血中具有快速检出 IgG 抗体能力，但近年来随着对临床无效输血的深入研究发现，凝聚胺试剂对弱的、效价低的 Rh 血型系统的抗体有漏检的情况，且不同厂家、不同批号的凝聚胺试剂在抗体的检出率均存在一定的差异。,酶介质凝集试验,原理：红细胞表面有丰富的唾液酸，带有负电荷，使红细胞相互排斥。蛋白水解酶能消化破坏这种唾液酸，减少红细胞表面的负电荷以及红细胞之间的排斥力，缩短了红细胞之间的距离，使IgG分子能与有相应抗原的红细胞产生凝集。常用的酶：菠萝酶、木瓜酶、胰酶、无花果酶。,酶介质凝集试验,优点可以增强一些抗原抗体系统的反应活性 Rh和Kidd系统最明显。缺点会破坏一些抗原的结构(M、N、Fya、Fyb)酶液批次不同，孵育时间均不同操作复杂少数人对酶液过敏,Coombs试验,人红细胞表面抗原与不完全抗体结合（常是IgG类抗体），不完全抗体致敏红细胞，由于该不完全抗体分子质量小，而且两个Fab段扩张角度小，不能使相邻红细胞桥联，红细胞仍处于分散状态，不出现肉眼可见的红细胞凝集现象。在反应体系中，加入针对该抗体的抗体，即抗-抗体，该抗-抗体Fab段结合相邻红细胞上不完全抗体Fc段，出现肉眼可见的红细胞凝集现象，该抗-抗体即称之为抗人球蛋白抗体。,Coombs试验,直接Coombs试验 用于检测已粘附在红细胞表面的不完全抗体。即将受检红细胞充分洗涤后，将抗球蛋白试剂加入已结合有抗体的受检红细胞悬液中，即可见细胞凝集。,Coombs试验,间接Coombs试验 用于检测游离在血清中的不完全抗体。即将待测血清标本加入具有特异抗原的红细胞悬液中，如果抗原抗体相应则发生结合，再加入抗球蛋白抗体，则出现红细胞凝集,Coombs试验,Coombs试验是理论上最明确、最准确的方法，是国际公认的金标准。但是由于其繁琐的操作，又不能同时对多份标本检测，只能将该试验用在少数标本的确定中，很难临床常规开展。,微柱凝胶检测技术,1990年，法国人Y. Lapierre发表文章介绍了一项免疫学检测新技术：将抗原抗体反应与凝胶分子筛技术相结合，即微柱凝胶免疫实验。该技术的本质是血凝试验，即红细胞抗原抗体在微柱腔内的凝胶介质中发生肉眼可见的免疫凝集反应。,原理,微柱凝胶免疫反应的本质是红细胞凝集试验，也可称之微柱凝胶血凝试验（Microcolumn Gel Heamagglutination Assay，MGHA）， 在微柱凝胶管中，红细胞和相应抗体结合后，形成红细胞凝集团块。在一定离心力下，该凝集团块位于胶表面或胶中；而红细胞未和相应抗体结合，仍为分散的红细胞，在同样的离心力下，红细胞沉降到微柱管尖底部。,广阔应用,MGIA,应用,ABO血型检测；Rh血型抗原检测；不规则抗体筛检；交叉配血；HDN检测；血小板抗体筛检；血小板交叉配血。,特点及优点,1.简单，不需洗涤，对阴性结果不需确证试验，解决了 Coombs试验因为程序复杂费时等原因未能在临床常规应用问题。2.使不完全抗体检测理论“金标准”成为临床的“金标准”。3.多份标本一次离心出结果，有利于临床大量标本检测。4.另外还具备准确、敏感、标本用量少、结果保存时间长、易于标准化、操作更安全等优点。,特点及优点,结果清晰、易于判读，准确度、敏感性高，标准化加样、规范化操作，排除了传统方法人为因素的干扰。,不足,较传统方法成本稍高；抗体筛查、配血须经孵育过程，耗时较传统方法稍长，不适用于紧急输血。,二、在血型检测中的应用,ABO、RhD血型定型检测 进行ABO正反定型试验、D抗原检测，包括了临床血型的常规检测项目，并设有质控孔。 操作简单，结果清晰、 准确，尤其对弱抗原和 亚型的检有传统的方法 无法比拟的敏感性，成 为临床血型检测的常规 方法。,二、在血型检测中的应用,Rh血型抗原检测 进行D、C、c、E、e五种主要抗原检测，达到最大相容性输血。,二、在血型检测中的应用,注意事项： 要求标准化加样、规范化操作，可排出了传统方法中人 为因素的影响； 按要求准备标本，防止溶血、纤维蛋白等影响结果； 按要求准备试剂卡，防止由于试剂卡问题影响结果。,二、在血型检测中的应用,常见问题分析及处理： 阴性对照孔假阳性： 首先观察标本，是否有溶血、细胞黏连等情况；了解临床信息，是否可能有自身凝集、冷凝集等情况；试剂卡是否平衡； 样本细胞进行洗涤、必要时可以进行温盐水洗涤，重新准备试剂卡，按标准操作流程重复试验。,二、在血型检测中的应用,阳性结果反应较弱： 由于老年、新生儿、肿瘤、白血病等导致抗原抗体反应减弱。 首先判断正反定型是否相符，如相符只是反应较弱、不影响出结果； 也可以采取一些增强反应：正定型反应较弱：可采取增加细胞浓度、室温孵育等方法；反定型反应较弱：可采取增加血浆量、4孵育等方法。,二、在血型检测中的应用,二、在血型检测中的应用,混合凝集： 首先要判断是否为真正意义上的混合凝集： 如凝胶表面出现类似一条红线、并非真正阳性；多数由于纤维蛋白、细胞破碎等引起；洗涤细胞、重新处理血浆可以解决。 如凝胶中有散在分布，判断为弱阳性反应。 如为标准的混合凝集，首先排除操作问题，如取血浆时 带有自身细胞，可能引起反定型出现混合凝集；另外就是样本问题，如：近期输血、妊娠，造血干细胞移植、白血病、亚型等。,,二、在血型检测中的应用,二、在血型检测中的应用,正反定型不符： 建议采用“三步法”进行分析、确证。第一步：复查ABO血型，排除人为因素、操作失 误。重新采集血样、核对试剂和器材。第二步：将需定型病人归纳进五大类33种原因分 类表，“对号入座”，逐一排除，剩下几条 不能排除者第三步：针对剩下的几种不能排除的因素，设计 针对性实验来验证。,1 红细胞抗原 7种 2 红细胞抗原额外反应 7种 (1)年龄小于6个月或老年(临床提示) (1)自身凝集素(临床提示AIAH) (2)白血病(临床提示) (2)红细胞粘附大量蛋白(红c未 洗涤) (3)异型血输注(临床提示输血史) (3)红细胞未洗涤，与血清试剂反 应 (4)造血干细胞移植(病史) (4)造血干细胞移植(病史) (5)血型物质升高 (5)获得性B抗原(类B)(临床提示感染) (6)急性大失血(临床病史) (6)B(A)、A(B)表型 (7)ABO亚型 (7)异型血输注(输血史),无临床提示者，仅三种,ABO疑难血型的鉴定,3 血清抗体 6种 4 血清抗体额外反应 8种 (1)年龄小于6个月或老年(临床提示) (1)自身抗体(临床提示AIAH) (2) 双胞胎嵌合体(家族史) (2)同种抗体 (3)低丙种球蛋白血症(临床提示) (3)对试剂反应的物质 (4)造血干细胞移植(病史) (4)血清蛋白异常(临床常为肝病) (5)先天性ABO抗体缺失 (5)输异型血浆(输血史) (6)大量输液(输液史) (6)造血干细胞移植(病史) (7)输含血型抗体的免疫球蛋白(输 血) (8)ABO亚型,无临床提示者，仅四种,ABO疑难血型的鉴定,5 混合凝集 5种 (1)近期怀孕或输血(病史、输血史) (2)双胞胎嵌合体(家族史) (3)骨髓移植受者 (临床提示) (4)造血干细胞移植(病史) (5)白血病(病史),ABO疑难血型的鉴定,都有临床提示,二、在血型检测中的应用,在血型检测时出现问题，较简单的常规处理主要有：洗涤细胞重复试验，O细胞、自身细胞做反定，增加细胞浓度、血浆量，4、室温孵育后再离心等。,三、在不规则抗体筛查中的应用,不规则抗体是指不符合ABO 血型系L andsteiner 法则的血型抗体, 也就是抗-A、抗-B 以外的血型抗体, 其中多为IgG 抗体。不规则抗体主要是经输血或妊娠等免疫刺激产生, 在盐水介质中不能凝集而只能致敏相应抗原的红细胞, 必须通过特殊介质(如酶、抗人球蛋白、凝聚胺等) 才能使致敏红细胞出现凝集反应。目前, 临床上报道的交叉配血不合大多数是由于患者血液中不规则抗体的存在而引起的。国内报道的溶血性输血反应共126例, 其中检测出不规则抗体121例, 占溶血性输血反应原因的96%。输血前不规则抗体筛查可以避免因输血引起的溶血反应, 确保临床输血安全。,三、在不规则抗体筛查中的应用,临床输血技术规范规定：交叉配血不合；有输血史、妊娠史或短期内需要接收多次输血者；需要进行抗体筛选试验。主要是在配血前，利用标准筛检细胞检测患者血浆中的抗体。检测细胞的要求 不能将多人份红细胞混合，一定要用2-3人份的试剂红细胞，以避免红细胞混合后，对弱抗原红细胞的稀释。 美国FDA对注册和批准作为商品供应的用作不规则抗体筛检的试剂红细胞的要求为必须表达：D、C、E、c、e、M、N、S、s，Pl、Lea、Leb、K、k、Fya、Fyb，JKa、JKb。,三、在不规则抗体筛查中的应用,通过实践发现,对申请输血患者进行常规抗体筛选后,筛选结果阴性者交叉配血能在很短间内完成,很少出现不合现象,大大提高了配血成功率;对阳性者则进行进一步抗体鉴定,提前准备相合血液,以保证体内有不规则抗体的患者及时用血,避免由血型不合引起的输血反应,收到了满意效果。另外，部分血型系统的抗原、抗体具有剂量效应（如Rh）,在交叉配血中可能出现漏检的情况（如杂合子可能不出现阳性反应）,在抗体筛查试验中由于使用标准筛检细胞，排除了剂量效应的影响。,三、在不规则抗体筛查中的应用,不规则抗体筛检微柱凝胶检测技术沿用抗人球蛋白的原理，将传统抗人球蛋白试验转移到凝胶卡中，对患者血浆抗体进行筛查，解决了传统方法因操作复杂费时的问题，应用于临床常规检测。,三、在不规则抗体筛查中的应用,注意事项：按要求准备标本，上清澄清；标准化加样，先加筛检细胞，后加血浆；注意加样后需要37孵育15min，再离心。,三、在不规则抗体筛查中的应用,常见问题分析、处理：假阳性： 如凝胶表面出现红线、尖底部细胞呈阴性、呈疑似混合凝集，多为纤维蛋白影响或标准筛检细胞有溶血破碎情况；洗涤细胞、重新处理血浆可以解决。 如凝胶中有很少细胞散在分布，需重复试验加以确认；在冬天气温较低时可能引起细胞活性降低、造成假阳性（拖尾）；可以考虑适当延长孵育时间（一般延长5min）。,四、在交叉配血中的应用,检测受血者血清中抗体和献血者红细胞抗原为主侧交叉配血试验，以及检测受血者红细胞和献血者血清中抗体为次侧交叉配血试验相容性，对其中是不完全抗体的，只能应用间接抗人球蛋白试验确定其相容性。 ABO血型抗体是完全抗体，但更多的临床有意义抗体是不完全抗 体，如Rh、Kidd、Duffy等血型抗体。如有输血史、妊娠史（包括流产史）、应用过血液制品史等情况的患者输血前都应该进行检测不完全抗体的交叉配血试验。,四、在交叉配血中的应用,交叉配血 含有抗人球蛋白试剂，可同时检出IgM 和IgG类抗体，另有加入抗C3d 的品种，使临床输血更安全，杜绝输血反应的发生。 经过孵育，排除 传统方法冷凝集 的干扰。,四、在交叉配血中的应用,通过凝聚胺配血法和微柱凝胶卡配血法的结果比较，100例交叉配血实验中，凝聚胺法有3例发生凝集反应，其中1例为受血者血液标本纤维蛋白去除不完全，1例为受血者血液标本高冷凝集素，1例为主侧不凝集、次测凝集，经抗人球蛋白试验呈阳性；微柱凝胶法有5例发生凝集反应，其中1例为受血者血液标本纤维蛋白去除不完全，1例为受血者血液标本高冷凝集素，3例为主侧不凝集、次测凝集，经抗人球蛋白试验均呈阳性。,四、在交叉配血中的应用,注意事项：按要求准备标本，血辫血样要离心；主、次侧加样成分；加样顺序，先加红细胞悬液、后加血浆；可以使用低离子液配制红细胞悬液，增强反应。,四、在交叉配血中的应用,配血不合,标本准备,血型影响,方法选择,免疫性原因,非免疫性原因,其他,多种因素相互交织,标本准备,正确的交叉配血结果来源于正确的血液标本严禁从静脉输液部位采集标本。因为不仅所用药物会对配血结果产生影响，而且稀释的血液标本配血时极易发生前带或后滞现象。血标本应代表患者当前的免疫学状态，必须采用输血前 3 天内的标本。,血型影响,在引起配血不合或溶血性输血反应的原因中 Rh 系统的免疫抗体位居第 1 位（占 50. 75%）其次是自身抗体（占 41. 79%，主要发生在自身免疫性溶血性贫血病例中）第 3 位才是 ABO 和 Rh 以外其他系统抗体（仅占7. 46%,血型影响,由不规则抗体引起配血不合共53例,占总数581份标本的8.43%;单一抗体48例,占90.4%;复合抗体5例,占9.6%。Rh系统35例,占66. 04%; MNSs系统15例,占28.3%;抗A1 2例,占3.74%;Diego 1例,占1.88%,免疫性原因,免疫性原因主要由机体产生不规则抗体或自身抗体所造成的，交叉配血时表现为主侧凝集或主次侧均可发生凝集。国内报道的交叉配血不合主要由不规则抗体所致，占61.5%，而其中又以抗-E和抗-C多见。,免疫性原因,自身抗体引起的交叉配血不合，包括冷凝集和温型自身抗体导致的非特异性凝集。主要见于自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮所致的自身免疫性溶血性贫血或肝硬化的病人，这种类型引起的交叉配血不合主次侧均可凝集。对于冷凝集现象可以采用自身对照和 37 水浴以及递增盐水温度洗涤患者红细胞等方法排除非特异性凝集的干扰。对于温型自身抗体可以采用吸散和放散试验后取患者的红细胞与血清和同型的洗涤红细胞进行交叉配血。自身免疫性溶血性贫血、急性溶血时，应尽量避免输血。,非免疫性原因,非免疫性原因是由于血清蛋白紊乱、白球蛋白倒置或者是某些药物破坏了红细胞表面的zeta 电位，从而使红细胞呈串钱状凝集，交叉配血时主要表现为主侧凝集。,非免疫性原因,镜下红细胞扁平而表面相互依附，呈串钱状堆集的有21 例，因不是真正的凝集， 红细胞膜完整。查看患者病例，2例为多发性骨髓瘤患者，5例为肝病患者 （蛋白倒置），14例分别因出血、创伤休克或术后，有补充血容量而输右旋糖肝史。血清蛋白紊乱及白球蛋白比例倒置引起的假凝集。多发性骨髓瘤患者、肺癌患者、肝癌患者、钩虫病。药物引起的交叉配血不合。因出血、创伤休克或术后，有补充血容量而输右旋糖肝史、应用VitC和 KCl 也可引起。,其他,TF抗原（T多凝集红细胞）正常情况下，人红细胞TF抗原为隐蔽抗原，不暴露，但是在细菌感染时，细菌分泌的神经氨酸酶可使红细胞膜TF抗原暴露。正常人血清中均含有抗-TF抗体（自然发生的抗体），与TF抗原暴露的红细胞均发生血凝反应，称之T多凝集现象。此外一些肿瘤、白血病患者的红细胞也发生TF抗原暴露。对于肠套叠、肠梗阻、败血症和菌血症患者的红细胞血型检测，应用单克隆抗体-A/-B血型试剂，其中不含有-T，才能正确判断血型。在细菌感染患者，特别是肠套叠、肠梗阻患者以及对肿瘤、白血病患者输血前交叉配血时，一定要高度重视次侧管，避免漏检TF暴露的红细胞。,具体原因分析及处理,主侧不合： 患者血浆原因： 有针对供者红细胞的抗体(抗体鉴定) 有自身抗体(自身抗体配血法，如吸收放散等处理后配血) 有冷凝集素(升温后配血) 有血浆蛋白紊乱(加盐水稀释) 供者红细胞原因： 直抗阳性(换供者) 全/多凝集(换供者) 其他： 药物抗体(罕见，用药史，停药后配血),具体原因分析及处理,次侧不合：供血者血浆原因：（换供者） 针对患者红细胞的抗体 自身抗体 冷凝集素 血浆蛋白紊乱患者红细胞的原因： 直抗阳性(45度放散后再配血)(常见原因) 全凝集或多凝集 粘附免疫球蛋白(洗涤红细胞),常规处理方法,建议采用“三步法”：第一步，排除人为因素/操作失误和供者