实验基础与急性毒性

实习一 实验动物的一般操作,掌握实验动物的选择原则和方法；熟悉实验动物的常规处置、染毒方式、采样和处死方法；了解常用实验动物外貌、生活习性、生长发育和解剖生理特征。掌握食品毒理学实验设计基本原则；熟悉毒理学试验结果处理和分析方法。,学习目的与要求,常用实验动物选择和处理,常用实验动物特征实验动物(laboratory animals)：经人工饲育，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确或者来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检验以及其他科学实验的动物。或者简单说以科学研究为目的而进行科学饲养繁殖的动物称为实验动物。 实验动物种类：常用的实验动物物种为大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的实验动物有地鼠、猕猴、小型猪、鸡、青蛙等。,实验动物特点：具有较小的个体差异，较强敏感性，较好的重复性与较一致的反应性。一些遗传背景不清楚，携带病原微生物不明确，健康状况及个体差异较大，反应性不一致，一般不作为实验动物，其所取得的数据不被科学界所公认。,实验动物的选择和处理,实验动物的选择毒理学的动物实验是以实验动物作为研究对象，为获得可靠的研究结果，先决条件是正确地选用实验动物。 实验动物选择原因：外源化学物的固有毒性往往在人和不同物种实验动物之间表现不同，物种差别可以表现在量方面，引起毒性的剂量差别，即毒性大小的差别，如有报道，人对138种化学物的敏感性为大鼠的1.8-10.5倍。物种差别也可以表现在质方面(毒性效应的差别)，如除草剂百草枯对人引起肺损伤，而对狗则未见到。,实验动物的选择选择原则,相似性原则：选择结构、功能、代谢、群体分布、疾病状态方面与人类相似的物种。差异性原则：研究过程要求以差异为指标或特殊条件时，选用不同种系实验动物的某些特殊反应，更适合于不同研究目的的要求。例如人类利用不同种属动物对病原微生物的易感性差异来生产弱毒疫苗。易化性原则：进化程度高、结构功能复杂的动物有时会给实验条件控制或实验结果分析带来困难，则应从易化角度入手，选择既能满足实验要求，结构功能又简单，便于实验分析的动物。如反射弧的研究选择两栖动物；遗传学研究选择果蝇。,实验动物的选择选择原则,相容或相匹配原则：设计动物实验时，选用的动物质量等级要与实验设计、实验条件、实验者技术、方法、试剂性能相匹配。可获得性原则：在不影响实验质量的前提下，选择最易获得、最经济、易饲养管理的动物。重复性和均一性原则：选用标准化的实验动物。杜绝使用随意交配而来的杂种动物和未经任何微生物控制的非标准化动物。,实验动物的选择选择方法,系统毒性研究最常用的啮齿类是大鼠和小鼠，非啮齿类是狗；豚鼠常用于皮肤刺激试验和致敏试验；兔常用于皮肤刺激试验和眼刺激试验；遗传毒理学试验多用小鼠；致癌试验常用大鼠和小鼠；致畸试验常用大鼠、小鼠和兔；迟发性神经毒性试验常用母鸡。,品系选择品系是实验动物学的专用名词，指用计划交配的方法，获得起源于共同祖先的一群动物。 实验动物按遗传学控制分类可分为：近交系：指同胞兄妹或亲子之间连续交配20代以上而培育的纯品系动物。群体基因才能达到纯合和基本稳定。杂交群动物(杂交1代)，指两个不同的近交系之间有目的进行交配，所产生的第一代动物。封闭群：一个种群在五年以上不从外部引进新血缘，仅由同一品系的动物在固定场所随机交配繁殖的动物群。 根据实验动物遗传的均一性排序，近交系最高、杂交群次之、封闭群较低。,实验动物的选择选择方法,实验动物的选择选择方法,实验动物微生物控制的选择 对于毒性试验及毒理学研究应尽可能使用级(或级以上)的动物，以保证实验结果的可靠性。,实验动物的选择选择方法,实验动物对外来化学物的毒性反应还存在个体差异，应注意实验动物的个体选择。重点是动物的性别、年龄、体重、生理状态和健康状况。对于初次试验的受试物，应该采用两种性别。毒理学试验选用实验动物的年龄取决于试验的类型。急性试验一般选用成年动物；慢性试验因实验周期长，应选用较年幼的或初断乳的动物，以使实验周期能复盖成年期。实际工作中常以动物的体重粗略地判断动物的年龄。性激素对外源化学物代谢转化有影响，故应选用未产未孕的雌性动物。但在某些试验如显性致死试验、致畸试验及繁殖试验等，则需有计划地合笼交配。 为确保选择健康动物，一般在实验前观察5-7天。,实验动物的选择选择方法,大、小鼠根据形态鉴定日龄（大、小情况基本一样）,实验内容,健康动物的选择实验动物性别的鉴定实验动物的抓取实验动物的编号标记与随机分组小鼠眼眶内眦静脉取血实验动物的处死脏器的分离,一、健康动物的选择,1眼睛明亮，瞳孔双侧等圆，无分泌物。2耳耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮。3鼻无喷嚏，无浆性粘液分沁物。4皮肤无创伤、无逐疮、疥癣、湿疹。5颈部要求颈项端正，如有歪斜提示可能存在内耳疾患，不应选作实验动物。6消化道无呕吐、腹泻、粪便成形，肛门附近被毛洁净。7神经系统无震颤、麻痹。若动物（大鼠、小鼠）出现圆圈动作或提尾倒置呈圆圈摆动，应放弃该动物。8四肢及尾四肢、趾及尾无红肿及溃疡。,1.健康检疫实验动物在购进之后，应雌雄分开饲养。一般应进行5-7天的检疫，在此期间应多次观察动物，及时剔除不健康的动物。 2.实验动物的抓取和固定方法3.性别鉴定4.实验动物的编号和标记方法实验动物的标记方法对啮齿动物常用染色法，可用苦味酸(黄色)、品红(红色)的酒精饱和溶液在动物被毛上染色。对啮齿动物还可用剪耳法标记。对狗等大动物一般用挂牌法。 5.实验动物被毛去除方法剪毛、拔毛、剃毛、脱毛（如硫化钠或硫化钡）6.实验动物的麻醉,实验动物的处理,主要依肛门与生殖孔间的距离区分，间距大者为雄性，小者为雌性。成年雄鼠卧位可见到睾丸，雌性在腹部可见乳头。,二、实验动物性别的鉴定(大、小鼠),演示录像,先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台上向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。,三、实验动物的抓取(大、小鼠),演示录像,实验动物的抓取和固定方法,小鼠用右手提起小鼠尾部，放在实验台上，当其向前爬行时，左手抓住两耳及头颈部皮肤，再置小鼠于左手心，拉直四肢并用手指夹住肢体固定。右手可行注射或其它操作。,大鼠右手轻轻抓住大鼠尾部向后轻拉，左手抓紧鼠两耳及头颈部皮肤，并将其固定在左手中，右手可行注射或其它操作。,实验动物的处理 实验动物的抓取和固定方法,兔1、可伤两肾；2、可造成皮下出血；3、可伤两耳；4、颈部皮肤厚可抓；5、用手拖住身体。4和5为正确的方法。,豚鼠先用手掌以稳准的手法迅速扣住豚鼠背部，抓住其肩胛上方，将手张开，用手指握住颈部，或握住身体的四周，再拿起来。怀孕或体重较大的豚鼠，应以另手托其臀部。,编号标记 染色标记法随机分组 同性别同一组动物体重差异应小于平均体重的10% 不同组间的平均体重差异应小于5%,四、实验动物的编号标记与随机分组,动物随机分组(随机数字表法),甲 乙 丙 丁 戊 1 2 3 4 0,* 小鼠按体重由轻至重排序,生物标本采集在实验过程中常需要对生物样品如血液、尿液、胆汁、粪便等进行检测或检查，它们是反映受试物的生物学效应和物质在体内代谢情况的最重要途径。血液采集大小鼠如需血量小可用鼠尾采血，如需血量较多可用眼眶静脉丛采血或处死时股动脉放血采血。狗可用后肢隐静脉抽血。不影响动物生理功能的最大取血量为其总血量(50ml/kg体重)的10。,实验动物处置,实验动物处置,生物标本采集 尿液采集 对大小鼠可用代谢笼法，下部有粪尿分离器。对狗可用接尿法或导尿法。 胆汁采集直接插管至胆总管采集粪便采集对大小鼠可用代谢笼法，下部有粪尿分离器，分析前剔去表层。,操作者以左手拇指、食指紧紧握住大鼠或小鼠颈部压迫颈部两侧使眶后静脉丛充血（注意用力要恰当，以防止动物窒息死亡），右手持玻璃毛细管从一侧眼内眦部以45角刺入，捻转前进。如无阻力继续刺入，有阻力就抽出玻璃毛细管调整方向后再刺入，直至出血为止。右手持容器收集血液后，拔出毛细管，用干棉球压迫止血。,小鼠眼眶内眦静脉取血,演示录像,安死术及其操作方法安死术是指用公众认可的、以人道主义的方法处死动物的过程，即达到没有惊恐或焦虑而安静地、无痛苦地死亡。安死方法最重要的标准是应具有保证动物中枢神经系统立即达到失去痛觉的早期抑制作用。应尽量采用适当的处死方法，减少实验动物的痛苦。 大小鼠可用颈椎脱臼法（脊髓与脑髓拉断），然后股动脉放血，动物立即死亡。兔、豚鼠、狗等一般用股动脉放血处死，或向静脉内注射一定量的空气使之发生严重的血液循环障碍的空气栓塞法。化学药物致死法均适合。,六、实验动物的处死(小鼠),脊椎脱臼法左手按住鼠头，右手抓住鼠尾猛力向后拉，使动物颈椎拉断脱节而立即死亡。此法多用于处死小鼠。,演示录像,心、肝、脾、肺、肾睾丸()子宫、卵巢(),七、脏器的分离,演示录像,病理解剖和标本留取毒性病理学检查包括大体解剖和组织病理学检查两部分。急性毒性试验中在试验期中死亡或试验结束处死的动物都应进行尸体解剖，因为急性毒性试验的目的是得到有关可能的靶器官信息以及进行重复染毒试验剂量设计的信息。,实验动物的染毒和处置,实验动物染毒毒理学试验中染毒途径的选择，应尽可能模拟人在接触该受试物的方式。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。不同途径的吸收速率，一般是：静脉注射吸入肌肉注射腹腔注射皮下注射经口皮内注射其他途径(如经皮等)。,食品毒理学试验的设计原则,试验设计(experimental design)是指为试验研究制定出一个通盘的、周密的、安排合理的、科学性强的设计方案，将试验对象随机分配到两个或多个组中，对试验对象施加某种干预或处理因素，观察比较不同处理的效应。食品毒理学试验包括体内试验和体外试验两种。体内试验是以实验动物为模型，通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向人（原型）外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。体外试验则主要用于筛选和预测急性毒性和机制研究。毒理学实验能否获得预期结果，试验前的试验设计至关重要。科研设计遵循的三原则：随机、重复、对照。,体外试验设计,1 溶剂/赋形剂所用溶剂/赋形剂不应与受试物发生化学反应。推荐使用溶剂/赋形剂。2 受试物了解受试物各方面性质，测定受试物在试验介质中的溶解性。溶解性限度就是出现沉淀的最低浓度。3 受试对象4 剂量设置5 代谢活化代谢活化系统的选择和条件依赖于受试物的类别。6 对照未处理（空白）对照、阳性对照、阴性对照7 重复由质控良好的实验得到明确的阴性结果和阳性结果，不强调要求重复。可疑结果则应重复实验。,体内毒理学试验设计,1 实验动物动物选择，首选实验动物是其对受试物的代谢过程、生理反应和生化特性基本上与人接近的。动物数量，各组各组动物数的设计应考虑到统计学的要求。2 受试物资料、处置、给予方式,体内毒理学试验设计,3 对照对照条件对照类型未处理（空白）对照（必要时设）：对照组不施加任何处理因素，不给受试物也不给以相应的操作。 阳性对照（必须设）：用已知的阳性物(如致突变物)检测试验体系的有效性。如在遗传毒理学试验、致畸试验和致癌试验中用已知的致突变物、致畸物或致癌物染毒，应该得到肯定的阳性结果(即致突变性、致畸性或致癌性)。 阴性对照（尽可能设）：不给处理因素但给以必须的实验因素(溶剂赋形剂)，以排除此实验因素(溶剂赋形剂)的影响。没有阴性对照组就不能说明受试物染毒与有害作用之间的关系。 历史性对照：由本实验室过去多次实验的对照组数据组成。,体内毒理学试验设计,4 剂量分组一般至少要设3个剂量组(即高剂量组、中剂量组、低剂量组)。一般要求，高剂量组应出现明确的有害作用，或者高剂量组剂量已达到染毒的极限剂量(如大鼠或小鼠灌胃或注射的最大容量)。低剂量组应不出现任何可观察到的有害作用(即相当于NOAEL)，但低剂量组剂量应当高于人可能的接触剂量，至少等于人可能的接触剂量。中剂量组的剂量介于高剂量组和低剂量组之间，应出现轻微的毒性效应(即相当于LOAEL)。 5 观察指标指标的有效性、客观性、准确度和精密度、灵敏度、特异性、选择指标的数目、指标的标准化,体内毒理学试验设计,6 试验期限某些试验(如致畸试验和多代生殖试验)的试验期限是由受试实验动物物种或品系而决定的。而其他毒性试验的期限在某种程度上由定义所决定。7 试验设计常用方法完全随机设计配对设计随机区组设计析因设计拉丁方设计,毒理学实验结果处理和分析,在评价毒理学试验的结果时，应综合考虑生物学意义和统计学意义。统计检验的假设是关于总体特征的假设，检验方法是以统计量的抽样分布为根据的，得到的结论是概率性的，不是绝对的肯定或否定，不等同于有或无生物学意义。对实验结果作出科学的判断和解释，应该根据统计学分析的结果、生物学知识和经验。,毒理学试验的数据处理和统计方法,毒理学研究的数据类型计量资料通过对观察单位用定量的办法测量某项指标数量大小所得到的资料。如动物身长、体重、血红蛋白量、进食量等。分类资料将观察单位按某物种性别或类别分组，然后清点各组的观察单位数目所得到的资料，如实验动物的性别分雌雄，实验结果分阳性、阴性等。,毒理学试验的数据处理和统计方法,毒理学研究的数据类型等级资料将观察单位按某种属性的不同程度分组，统计各组的观察单位数目所得到的资料。如效果判定为显效、有效、无效；程度分轻、中、重；实验室检测结果分、 、 等。数据类型转换如将血红蛋白按正常与异常分组，资料便转换为计数资料。数据转换稳定方差、直线化、使分布正态化或接近正态。,毒理学试验的数据处理和统计方法,假设检验的一般考虑实验和观察的单位处理组间进行比较的形式假设检验和概率值数据处理和统计方法(1) 处理组与阴性对照组比较(2) 剂量-效应关系和剂量-反应关系(3) IPCS推荐的统计学分析方法(4) 常规毒理学试验资料推荐的统计学方法,统计学意义和生物学意义,在评价毒理学试验结果时，要综合评价实验结果的统计学意义和生物学意义。一般来说，具有统计学意义是具有生物学意义的必要条件之一。正确地利用统计学假设检验的结果有助于确定实验结果的生物学关联。正确地利用统计学假设检验的结果有助于确定实验结果的生物学关联。,统计学意义和生物学意义,1.处理相关反应的确定剂量相关趋势反应重现性相关发现组间差异的大小与类型性别差异差异出现的时间性2.参考范围识别异常的阴性对照值可以更好地理解低发生率的发现可以更好地理解高发生率的发现,统计学意义和生物学意义,生物学意义（即生物学重要性）的判断在判断生物学意义(即生物学重要性)时，可考虑以下步骤。(1) 纵向比较：此参数的改变有无剂量-反应关系。化学物毒作用的剂量-反应关系是毒理学研究的基本假设。当某参数的改变存在阳性剂量-反应关系，就可认为此参数的改变与受试物染毒有关，具有生物学意义