第八篇血清型.ppt

第八章血清型 目的要求 1 掌握HP GC TF的遗传特征2 熟悉HP GC TF的分型原理3 了解血清型的亚型 第一节概述 一 血清型的概念人类某些血清蛋白具有遗传多态性 表型有个体差异 称为血清型 serumtypes 二 血清型的分类与命名根据分型原理不同 血清型可以分为两大类 1 同种异型遗传标记是指同一种属不同个体免疫球蛋白抗原性的差别 可采用特异性抗血清分型 如免疫球蛋白Gm Km等 这类血清型的命名多以抗原所在的肽链名称加抗原编号组成 如Glm抗原表示该抗原位于免疫球蛋白IgG1 重链上 2 血清蛋白的电泳多态性遗传标记是指不同个体血清蛋白的电泳特性的差异 是血清蛋白多肽链中部分肽链或个别氨基酸不同 引起电泳迁移率发生变化构成的多态性 这类血清型的命名通常是蛋白的缩写名称加表示等位基因的数字或字母 如Hp1 1 三 分型原理1 免疫学的方法可以用来进行同种异型遗传标记的分型 以特异性的抗体检测同种异型抗原 确定遗传标记的型别 如红细胞被动凝集抑制试验 酶联免疫分析等 2 在法医学鉴定中应用的血清型多数属于电泳性质上的多态性 需要采用凝胶电泳技术分型其分型原理为 不同表型的蛋白质一级结构存在差异 分子量和等电点不同 在电场中的迁移率不同 可依据蛋白谱带位置进行分型 等电聚焦技术则依靠不同蛋白分子之间等电点差异进行分型 分辨率比常规凝胶电泳高 能够揭示许多普通电泳难以检出的多态性 如维生素D结合蛋白普通电泳分为三种表现型 而等电聚焦技术分为六种 等电聚焦电泳原理 所有的氨基酸均为两性物质 在酸性溶液中带正电荷 在碱性溶液中带负电荷 若氨基酸在某一pH值下其净电荷为0 且在电场中不移动时 称此pH值为它的pI值 等电点 当溶液的pH值低于或高于pI 所有蛋白质分子所带净电荷为同号 彼此之间有相斥力 不会聚集 所以 將pH调到等电点的大小 则大部份的蛋白质將会沉淀 可以应用在电泳 达到分离蛋白质混合物的目的 这种方法称为等电聚焦电泳 3 有些血清型在分型之前 样品需经神经氨酸酶或其他试剂处理 如转铁蛋白分型 因为糖蛋白糖侧链的电荷会影响蛋白电泳迁移率 4 电泳后的血清型谱带的显示可以用普通蛋白染色 免疫固定或免疫印迹法蛋白染色操作简便 但谱带无特异性免疫固定后染色为特异性显色方法 主要是利用抗原抗体的特异性反应识别特异性蛋白 典型的印迹实验包括三个步骤 蛋白质的电泳分离 将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上 用非特异性 非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域 免疫学检测 免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端 极大地提高了其利用率 分辨率和灵敏度 使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一 第一阶段为SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷 在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向阳极泳动 分子量越小 泳动速度就越快 此阶段分离效果肉眼不可见 只有在染色后才显出电泳区带 第二阶段为电转移 将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上 选用低电压 100V 和大电流 1 2A 通电45min转移即可完成 此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见 第三阶段为酶免疫定位 将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜 相当于包被了抗原的固相载体 依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后 加入能形成不溶性显色物的酶反应底物 使区带染色 几乎任何蛋白质都可用于免疫印迹 免疫印迹的优势是能分析不能用其他的免疫化学技术进行研究的蛋白质样品 例如 不能标记的蛋白质或不溶于温和抽提缓冲液的蛋白质等 6 DNA分型技术也可用于血清型分型 个体差异的实质是人类基因组编码DNA的差异 四 法医学意义自1939年发现血清中Hp的遗传多态性以来 血清型因分型可靠 个体识别率高等原因受到法医学的重视 多种血清型成为亲子鉴定选择的遗传标记 第二节结合珠蛋白型 结合珠蛋白 haptoglobin Hp 是人血清中能与游离血红蛋白 Hb 结合的一种a糖蛋白 由三种表现型Hp1 1 Hp2 1 Hp2 2 受控于Hp座位上的一对等位基因Hp1和Hp2 呈共显性遗传 一 Hp的生化性质与生物学功能由肝脏合成 等电点为4 1 4 2 电泳属于 2 球蛋白组分 含糖量为18 6 其主要功能是与游离血红蛋白结合成稳定的复合物 并很快被单核 巨噬细胞系统处理掉 阻止了血红蛋白从肾小球滤过 避免游离血红蛋白对肾小管的损害 结合珠蛋白是一种血浆糖蛋白 分子量约为90 000 能与红细胞外血红蛋白 Hb 结合形成紧密的非共价复合物Hb Hp 每天降解的Hb约有10 释入血循环中 成为红细胞外游离的Hb Hb与Hp结合成Hb Hp复合物后分子量可达155 000 不能透过肾小球 从而防止游离血红蛋白从肾脏丢失 避免Hb所含铁的丢失 保证铁再用于合成代谢 溶血性贫血患者血浆结合珠蛋白浓度下降 由于溶血时大量的Hb释出 Hp与游离Hb结合成复合物而被肝细胞摄取 清除 此外 Hp也是一种急性期蛋白 患各种炎症时其血浆中含量升高 二 Hp的分子结构是由两条 多肽链和两条 多肽链组成的四聚体 各型之间只有 链不同 而 链都相同 链有 1及 2两种 而 1又发现有 1F及 1S两种遗传变异体 两种变异体的多肽链只有一个氨基酸的残基组成不同 HP1 1由两条hp1 和两条hp 链组成 HP2 2由两条hp2 链和两条hp 链组成 人的HP为一种 2 球蛋白 其结构受遗传控制 其表型有三种 即HP1 1 HP1 2 和HP2 2 每个人的表型可用简单的电泳法加以检验 HP的遗传为常染色体不完全显性 分别由HP1和HP2两个基因控制 1 1是HP1 HP1纯合子 1 2是HP1 HP2杂合子 2 2是HP2 HP2纯合子 带HP1基因者结合血红蛋白较多 HP2基因者结合血红蛋白较少 如1 1型平均结合血红蛋白为118g血红蛋白 L 1 2型为93g血红蛋白 L 2 2仅为75g血红蛋白 L 血清结合珠蛋白含量下降 甚至缺如 主要见于各种血管内溶血性疾病 如阵发性睡眠性血红蛋白尿症和吞豆病中毒性肝炎 肝硬化等肝脏疾患 急慢性炎症 结核 肿瘤时结合珠蛋白含量会升高 另外 应用某些激素 如皮质激素和雄性激素后 也可使结合珠蛋白增高 三 Hp基因定位于人类第六号染色体的长臂上 包含编码hp 链和hp 的Hp基因以及Hp相关基因HprHp 1基因含5各外显子 Hp 2基因是由两条Hp 1DNA链组合而成 其结合位置分别位于第四和第二内含子 因此Hp 2基因含7个外显子 Hp 1基因第四个外显子中第52 53位密码子的不同可将Hp 1基因分为Hp 1F和Hp 1S F即fastS即slow 第52位为赖氨酸即快 第53位为谷氨酸即慢 Hp 2基因第四 第六外显子中的第52位 第53位与第111位 第112位密码子也具有Hp 1F和Hp 1S的差别因此 Hp 2基因可分为Hp 2FF Hp 2FS Hp 2SS三个等位基因 珠蛋白基因的多态性会导致珠蛋白本身与血红蛋白的结合能力 抗氧化能力 人体内铁的代谢循环和免疫能力发生改变 既往的研究已经发现 珠蛋白基因的多态性对疟疾的发生和人体内红细胞溶解有着重要的意义 珠蛋白2 2基因型是疟疾流行地区儿童贫血的危险因素 从而提示携带Hp2 2基因型的人体在疟疾引起红细胞溶血后 其珠蛋白结合游离血红蛋白的能力是下降的 不同珠蛋白基因型对Hb变化的影响更大 四 Hp型的遗传多态性采用凝胶电泳技术可将不同个体的Hp分为三型 即HP1 1 HP2 1和HP2 2 每个人的表型可用简单的电泳法加以检验HP的遗传为常染色体不完全显性 分别由HP1和HP2两个基因控制 1 1是HP1 HP1纯合子 1 2是HP1 HP2杂合子 2 2是HP2 HP2纯合子 HP1 1型的电泳谱带呈现单一成分 泳动最快 靠近正极侧HP1 2和HP2 2型由多个成分组成 电泳迁移率较小 其谱带浓度向负极呈逐渐递减趋势 Hp 1基因的产物由Hp 1F和Hp 1S两个基因产物组成 这样可以检出6种表现型 分别是Hp1S 1S Hp1S 1F Hp1F 1F Hp2 1F Hp2 1S Hp2 2 五 Hp遗传变异大量群体资料表明Hp存在许多遗传变异1 Hp0型血液中Hp含量太低 用常规方法测不出 称之为无结合珠蛋白血症 这些个体并无溶血性疾病 此外 胎儿血液中不易测出Hp 部分新生儿可测出 4个月的婴儿Hp型别大部分可测出 个别情况直至15岁以后才能测出 胎儿及新生儿血中测不出Hp 不能称为Hp0型 这一点在涉及胎儿及婴幼儿的亲权鉴定时要注意 Hp0型的基因型为Hpdel HpdelHp del为沉默基因 其编码hp 链的基因片断缺失Hp del基因以杂合状态存在时该个体呈现低结合珠蛋白血症 2 Hp 1M型又称为修饰表现型2 1 是HP2 1与HP2 2之间的过渡型Hp 1M型的泳谱特点是快泳动带成分比例增多 而2 2区的线条非常贫弱 有时易与HP2 1相混淆 3 HpCa型此型快泳动带比例减少 而2 2区谱带明显增加 其产生可能是嵌合状态所致 即一类细胞产生Hp2 2 另一类细胞产生Hp2 1 4 HpJ 1型此型的特点是1 1区的电泳带分裂为两条 负极侧谱带增多5 HpK 1型此型的特点是1 1区的电泳带分裂为两条 其余区域无蛋白带 六 Hp型的群体遗传学调查结果亚洲人以HP2 2居多 其次为Hp2 1 而Hp1 1最少 高加索人以Hp2 1占优势 其次为HP2 2 黑种人群体中Hp1 1频率最高 其次为Hp2 1 七 Hp型的分型原理及方法电泳前先使待测样品与血红蛋白形成Hp Hb复合物 电泳完后可以利用血红蛋白的过氧化物酶活性在过氧化氢存在时使联苯胺氧化成联苯胺蓝 染色 普通型可采用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分型 Hp亚型则需先纯化样品中地Hp 再使Hp组分中的 肽链变性 还原后方能采用普通电泳或等电聚焦技术进行分型 原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamidegelelectrophoresis 简称PAGE 八 Hp型遗传多态性的法科学应用Hp在血痕中可以保存相当长的时间 但由于血痕中过多的血红蛋白可掩盖Hp泳谱 因而在一定程度上限制了血痕的个体识别能力 第三节维生素D结合蛋白 维生素D结合蛋白 DPB 又称为型特异性成分 Gc 一 生化性质和生物学功能由肝脏合成 分子量为52000 58000 等电点为4 8 5 1 稳定性最高60oC Gc的主要生物学功能是结合和转运维生素D除上述功能以外 Gc还与血浆中肌动蛋白的清除有关Gc与脂类和脂肪酸也有很高的亲和力 能增强中性粒细胞的化学趋化性B淋巴细胞和T淋巴细胞亚群中细胞型别差异也与Gc有关 二 遗传及等位基因命名1 Gc基因定位于人类第4号染色体长臂上 属于常染色体单一位点共显性遗传系统 Gc基因全长42 4kb 含13个外显子 12个内含子 Gc的编码产物为单一肽链组成的糖蛋白 肽链含458个氨基酸残基 对不同表现型的DNA序列分析表明 Gc1F Gc1S Gc2蛋白的遗传多态性源自第11号外显子第416位和第420位两个密码子的变异Gc1FGc1SGc2416位天冬氨酸谷氨酸天冬氨酸420位苏氨酸苏氨酸赖氨酸 现已知的等位基因为 Gc 2 Gc 1F Gc 1S均为共显性等位基因 2 Gc的表型用免疫电泳技术及聚丙烯酰胺凝胶电泳技术可将Gc分为三种表现型 Gc1 1 Gc2 2 Gc2 1 他们受控于Gc 1 Gc 2两个共显性等位基因 Gc2 2为靠近负极侧的单一谱带 Gc1 1为靠近正极侧的双带 泳动速度快于Gc2 2型Gc2 1为杂合子 其表现型为上述两种谱带的综合 3 Gc型的命名1978年召开的Gc系统国际专题会议上统一命名方法 用等电聚焦技术检测Gc变异型时 凡双带变异属Gc1变异 单带变异属Gc2变异 出现在Gc1S正极侧的为Gc1A带 出现在Gc1S负极侧的Gc1C带 同理 出现在Gc2正极侧的为Gc2A带 负极侧的为Gc2C带 三 群体遗传学调查结果Gc亚型的基因频率分布在不同人种间分布有区别 高加索人 Gc 1S Gc 2 Gc 1F 蒙古人种Gc 1F占优势 黑种人群体中Gc 1F出现的频率很高 四 Gc的分型原理及方法普通型可用免疫电泳或聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分型 亚型则需用等电聚焦技术分型或采用DNA分型技术1 免疫电泳2 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳3 等电聚焦技术4 PCR扩增技术 免疫电泳 immunoelectrophoresis IEP 是将区带电泳和双相琼脂扩散相结合的一种免疫化学分析技术 1953年Grabar首先应用该方法进行抗原抗体分析 原理先将待检标本在琼脂凝胶中进行电泳 不同的抗原成分由于所带电荷 分子量及分子构型的差异 在电场作用下的泳动速度不同而被分成不同区带 然后与电泳方向平行 挖一小槽 加入含相应抗体的免疫血清 与已分离的各抗原成分在琼脂内作双相免疫扩散 各区带在相应位置与抗体形成沉淀弧 根据沉淀弧的数量 位置和形态 可分析样品中所含抗原成分及其性质 图1免疫电泳原理图解 操作步骤1 取洁净载玻片 浇注融化的琼脂凝胶 凝固后打孔挖槽 2 用微量加样器加待检标本于孔内 3 电泳条件以电压4 6V cm或电流2 3mA cm为宜 电泳1 5 2h 4 电泳完毕后 用毛细滴管在槽内加入含相应抗体 孵育 使抗原抗体双相扩散 形成沉淀线 5 观察沉淀线的数目 形状和位置 经漂洗 干燥 染色 脱色等步骤制作染色标本 可长期保存 例如血浆蛋白免疫电泳 方法评价免疫电泳分辨率高 可分出人血清中20 30种抗原成分 可鉴定混合抗原中各组分 注意事项 1 浇载玻片时 玻片应保持水平 琼脂面要尽量铺平 2 加样应一次加满 并防止样品溢出孔外 3 电泳过程中注意防止发热 以免影响电泳结果 由于免疫电泳的影响因素较多 对异常结果的分析增加了复杂性 如沉淀弧数目不总是与混合物中应有的成分相符 原因有 抗原抗体比例不恰当 使一些成分未出现沉淀线 相邻两抗原迁移率非常接近而致沉淀线重叠 一条沉淀线分离成多条 因此用免疫电泳技术检测多种混合物时 至少要用3种不同的浓度 2种或2种以上的抗体 免疫不同动物而得 而且要及时观察并记录沉淀弧出现的情况 Gc的免疫电泳分型 以含乳酸钠的巴比妥作为缓冲液 离子强度为0 05 将血清加在琼脂糖凝胶板负极测 电场强度为7V cm 电泳2h后 在与电泳方向相平行的泳道旁开槽 加抗 Gc血清 于室温下放置24 48h后观察沉淀线 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 是利用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳法 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰胺和交联剂甲叉双丙稀酰胺交联而成的多孔网状凝胶 不连续PAGE有分离胶 浓缩胶和样品胶 PAGE分辨率很高 二 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 凝胶系统的均匀性 连续性凝胶电泳不连续凝胶电泳按凝胶形状 圆盘状电泳平板电泳被分离的物质是否变性 非变性 变性 图1聚丙烯酰胺凝胶不连续圆盘电泳示意图 A为正面 B为剖面 1样品胶pH6 72浓缩胶 是大孔胶 凝胶缓冲液为pH6 7的Tris HC13分离胶 是小孔胶 凝胶缓冲液为pH8 9Tris HC14电极缓冲液是pH8 3Tris 甘氨酸缓冲液 电泳过程示意图A 为电泳前3层凝胶排列顺序 3层胶中均有快离子 慢离子B 显示电泳开始后 蛋白质样品夹在快 慢离子之间被浓缩成极窄的区带 C 显示蛋白质样品分离成数个区带 操作方法 分离胶的制备 浓缩胶的制备 加样 待分离样品的制备 电泳 剥胶 固定染色 洗脱 Gc的聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳条件 凝胶浓度为5 8 交联度为2 14 Tris 甘氨酸缓冲液作为电极液 于3mA下电泳2h 普通蛋白染色 Gc位于白蛋白与转铁蛋白之间 将两性电解质 eg pH3 9 pH5 7 同蛋白质样品一起加入到已经灌好的凝胶中 在电场下 两性电解质首先达到它的等电点而平衡 蛋白质样品根据它自身的等电点分别向两极移动 最后也达到平衡 等电聚焦 这种按等电点的大小 生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为称等电聚焦 电泳法 三 等电聚焦 等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度 使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦 从而达到分离 测定和鉴定的目的 采用等电聚焦电泳可以检出Gc亚型 是目前国际公认的分型法 支持介质采用浓度为5 交联度为3 聚丙烯酰胺凝胶 两性电介质pH为4 5 5 4 电压为500V 样品加于距负极10mm处 电泳1h 电泳结束后用抗 Gc血清免疫固定 再行蛋白质染色后观察结果 五 Gc在法科学中的应用Gc在血痕中可以保留较长的时间 加之该基因座遗传多态性程度高 20世纪80年代 许多国家和地区将其用于亲权鉴定和个体识别检案中测定生物斑痕中的Gc时 最好用免疫学方法显示其谱带 第四节血清类粘蛋白型 血清类粘蛋白 ORM 是存在于人类血液 体液 分泌液中的一种具有遗传多态性的 1糖蛋白 由两个基因座编码 分别是ORM1与ORM2 一 ORM的生化性质与生物学功能由肝脏及淋巴细胞合成 血清中的含量为0 6 1 2g l 在人类血浆蛋白中 ORM是含糖量最高 酸性最强的糖蛋白 ORM的肽链结构中富含脯氨酸 具有较高的稳定性和耐热性 在感染及肿瘤发生时 患者血清中ORM含量显著赠高 因此 它被认为是一种急性时相正反应物 ORM具有免疫调节功能 可能是通过抑制免疫反应来调控免疫系统 二 遗传及等位基因命名基因定位于人类第9号染色体长臂上 ORM1与ORM2两个基因座紧密连锁 常见等位基因按孟德尔定律共显性方式遗传在ORM1上有共显性等位基因 ORM1 F1 ORM1 F2 ORM1 S 决定六种表现型 在ORM2上有显性等位基因 ORM2 M通常产生纯合表现型ORM2M同一个体血清中ORM1蛋白的含量比ORM2蛋白约高3倍 在等电聚焦电泳谱上 染色深者为ORM1 染色浅的为ORM2 在ORM1基因座上 除了常见的三种等位基因外 已发现包括沉默基因ORM1 Q0在内的21种变异型在ORM2基因座上 也发现了包括沉默基因ORM2 Q0在内的28种变异型所以人群的ORM 2基因座中 以ORM2 M占绝对优势 三 群体遗传学调查结果在调查过的群体中 ORM1 F1 ORM1 S的基因频率均大于0 01 在所以人群中ORM1均具有遗传多态性 并且均以ORM1 F1最常见东南亚地区人群中常检出ORM2 H19变异型 其频率仅次于ORM2 M 由于ORM2基因座上的基因频率分布不好 沉默基因ORM2 Q0又较常见 加之ORM2基因座的表达产物含量仅为ORM1的1 3 所以ORM2分型的法医学价值不如ORM1分型好 四 分型原理及方法ORM不同表现型的区别取决于多肽链一级结构的不同 一级结构的变化可引起蛋白质理化参数的改变 血清电泳后用抗 ORM血清免疫固定可显示ORM表现型的电泳谱型 第五节免疫球蛋白同种异型遗传标记 同种异型遗传标记是位于免疫球蛋白上反应个体差异的遗传标记一 免疫球蛋白的结构与分类 氨基端 羧基端 IgG 链 IgA 链 IgM 链 IgD 链 IgE 链 人类Ig根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同 分为五类 根据IgG重链恒定区氨基酸排列不同及二硫键的数目和位置不同将IgG进一步分为四个亚类 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4根据轻链恒定区的不同可分为两型 型和 型 二 Gm型与Km型的命名位于IgG1 IgG2 IgG3 IgA IgE及 轻链上的同种异型遗传标记分别以符号G1m G2m G3m Am Em Km代表不同的免疫球蛋白亚类之间用分号隔开 同一亚类之间用逗号隔开 基因型或单倍型数字用右上角码标明 三 Gm型与Km型的遗传1 Gm型的遗传通过对Gm因子的广泛群体遗传学及家系调查 证实Gm因子的遗传方式为常染色体共显性单倍型遗传 其中Gm3 Gm17表现出对偶关系 各Gm因子在单倍型上的组合随人群 种族及地域的不同而异 由于各群体调查Gm因子的种类及个数不同 因而Gm因子单倍型中组合数目多寡也不同事实上 由于稀有单倍型的存在 在群体调查中所检出表现型数往往多于常见表现型 2 Km型的遗传Km系统有三个因子 Km 1 Km 2 Km 3 其中Km 1 和Km 3 为对偶关系Km系统的等位基因有Km1 Km1 2和Km3三个 按常染色体共显性规律遗传 除了G1m 3 G1m 17 位于IgG1Fd段外 其余Gm因子位于IgG重链Fc段 Km位于 轻链上 四 Gm型与Km型在人群中的分布Gm系统的单倍型频率随人群 种族及地域的不同而表现出较大的差异 即使在中国汉族群体中Gm因子分布也呈明显不均一现象 五 Gm型与Km型的测定 一 红细胞凝结抑制试验1 用抗D Gm Km血清致敏红细胞2 证实红细胞已被致敏3 红细胞凝结抑制试验4 结果评价 二 双抗体夹心酶联免疫法 三 PCR法 六 法医学意义Gm Km系统个人识别率及非父排除率均高于已知的红细胞血型 红细胞酶型及其他血清型 且Gm与Km抗原在常温下或碱性环境中很稳定 溶血对抗原性无大影响 所以Gm Km系统具有很高的法医学应用价值 第六节转铁蛋白型 转铁蛋白 Tf 是血液中一种主要的糖蛋白 负责将肝组织 是铁贮藏的主要场所 的铁向其它组织的细胞运输 一 生化性质与生物学功能由肝脏合成 血清中的含量为20