第六章-种子制备与菌种保藏.ppt

第六章发酵菌种的制备与保藏 第一节生产菌种的制备过程 一 生产菌种制备的概念 生产菌种的制备 即菌种的扩大培养 就是把保藏的菌种 即砂土管 冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化 再经过扁瓶或摇瓶和种子罐 逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程 这些纯种的培养物称为种子 二 种子扩大培养的目的 接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间 保证生产水平 三 优良种子应具备的条件 生长活力强 延滞期短 接种后在发酵罐中能迅速生长 生理形态稳定 浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求 无杂菌污染 保证纯种发酵 生产能力稳定 四 种子制备过程 生产菌种的制备一般包括两个过程 即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程 孢子制备 实验室阶段摇瓶种子制备 实验室阶段种子制备种子罐种子制备 生产车间阶段 步骤 斜面培养基中活化 扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养 完成实验室种子制备 一级种子罐 制备生产用种子 视情况确定扩大级数 完成生产车间种子制备 种子转种至发酵罐 I 孢子制备 孢子制备是将休眠状态的孢子经过固体表面进行扩大繁殖再形成成熟孢子的过程 孢子的质量 数量对以后菌丝的生长 繁殖和发酵产量都有明显的影响 不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点 无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上 成熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶 菌种产孢子能力强及孢子发芽 生长繁殖迅速 可用固体培养基培养孢子 菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢 可用摇瓶液体培养法 不产孢子的菌种 保藏基础上 在一定温度下活化即可 一 放线菌孢子的制备 培养基 琼脂斜面 麸皮 豌豆浸汁 蛋白胨 无机盐 干燥和限制营养有利于孢子形成 培养条件 28 37 5 14d 制备过程 菌种 母斜面 子斜面 种子罐 冷藏形式 孢子进罐 斜面孢子制成孢子悬浮液后直接接入种子罐 制备过程 菌种 母斜面 子斜面 摇瓶菌丝 种子罐 冷藏形式 摇瓶菌丝进罐 斜面孢子经过种瓶培养获得菌丝悬液后接入种子罐 B 注意事项 限制碳源 约1 和氮源 不超过0 5 培养温度多为28 少数为37 培养时间为5 14天采用孢子进罐 工艺简单 批间差异小 便于控制孢子质量 采用菌丝进罐 可缩短种子罐内的培养时间 尤适生长缓慢的菌种 二 霉菌孢子的制备 注意事项天然农产品因具有独特的营养成分和较大表面积而适合作霉菌的培养基培养温度多为25 28 培养时间为4 14天 大米孢子制备 1 加水浸泡 大米 饱满 完整 用水泡4 1h 大米 水 1 0 5 0 6 凉至半干 能散开 表面无水即可 2 蒸熟 湿纱布2层垫于塞子内 加入大米 置于搪瓷盘 4层牛皮纸做盖子 塞子100 20min蒸熟 若夹生 浸或焖时间长些 降温至温热时打散 凉半干 米粒散开即可 分装于装罗氏瓶 方形250 150mm 厚度1 2cm 3 灭菌 121 20min灭菌 降温至温热时摇散 放置不超过1天 过干可加无菌水 4 接种 1支冻管接3 4个罗氏瓶 每瓶3滴于不同地方 摇匀 培养过程 前两天每天摇一遍 接种前用缓冲液洗下进种子罐 霉菌孢子 青霉素小米孢子制备 1 小米 水 1 0 45 0 5 泡40min 小米加于开水中 搅拌 开锅后焖 捂半小时 然后倒入盘子 垫湿纱布 用4层牛皮纸做盖子 100 20min蒸熟 不能夹生 若夹生 延长浸泡时间 2 电扇风吹 米粒散开即可 分装 加塞 灭菌 接种 3 胶皮卷的棒敲100下 先直立培养 4 48h左右 长菌后 小米由黄变白 平铺 手敲 培养 米孢子制备注意点 须泡透 泡的时间长一点 再风干 培养相对湿度 70 以上 罗氏瓶装量 3 4粒米厚 培养后 玻璃珠打碎 洗下孢子接种 或火焰接种直接倒入种子罐 三 细菌孢子的制备 多采用限制碳源而氮源丰富的培养基 培养温度多为37 少数为28 菌体培养时间多为1 2天 产芽孢的细菌多为5 10天 实验室阶段种子培养物选择的原则 A 目的 种子扩培到一定的量和质 根据菌种的特点最终的培养物可分为两类 对于不产孢子和芽孢的微生物 获得一定数量和质量的菌体如 谷氨酸的种子培养 对于产孢子的微生物获得一定数量和质量的孢子较菌丝体培养步骤少 因而更容易获得量和质稳定的种子 如 灰色链霉菌孢子的培养 培养基选择原则 培养基的选择应该是有利于菌体的生长 或者有利于孢子的产生 在原料方面 实验室种子培养阶段 规模一般比较小 因此为了保证培养基的质量 培养基的原料一般都比较精细 起始接种物的传代问题 细菌保藏斜面 活化斜面产孢子保藏斜面 母斜面 子斜面目的 使菌种的传代次数尽可能的少 孢子培养 母斜面 活化 纯化 使保藏菌种生长 并去处变异株 所以接种时要稀一点 便于纯化生长到单菌落 子斜面 大量繁殖 得到大量孢子 接种 从母斜面上点接种 选取生长好的单菌落 接种时密一点 得到大量的孢子 孢子培养时注意湿度 子斜面使用一般不超过1个月 II 种子制备 概念 指将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基种培养 使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程 种子制备所使用的培养基和其它工艺条件 都要有利于孢子发芽和菌体繁殖 摇瓶种子 种子罐种子 一 摇瓶种子制备 摇瓶菌丝进罐 母瓶 子瓶 进罐母瓶 进罐营养要求 比较丰富和完全 并易被菌体分解利用 氮源丰富有利于菌丝生长 各种营养成分不宜过浓 子瓶培养基浓度比母瓶略高 更接近种子罐的培养基配方 二 种子罐种子制备 二级发酵 利用一级种子所进行的发酵 三级发酵 利用二级种子所进行的发酵 四级发酵 利用三级种子所进行的发酵 二级种子 发酵罐 斜面孢子或摇瓶菌丝 一级种子 三级种子 种子制备过程 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数谷氨酸 二级发酵 谷氨酸棒杆菌 摇瓶 一级种子 小罐 发酵青霉素 三级发酵一级种子 小罐 二级种子 中罐 发酵链霉素 四级发酵一级种子 二级种子 三级种子 发酵 发酵级数确定的方法 种子罐的级数越少 越有利于简化工艺和控制 并可减少由于多次移种而带来的染菌的机会 但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间 缩短由于种子发芽 生长而占用的非生产时间 以提高发酵罐的生产率 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定 但也与所选用工艺条件有关 如改变种子罐的培养条件 加速了孢子发芽及菌体的繁殖 也可相应地减少种子罐的级数 发酵级数确定的依据 级数受发酵规模 菌体生长特性 接种量的影响 级数大 难控制 易染菌 易变异 管理困难 一般2 4级 在发酵产品的放大中 反应级数的确定是非常重要的一个方面 对于生长快的细菌 种子用量比例小 故种子罐相应也少 如 谷氨酸生产中 采用茄瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于32 培养7 10h 菌体浓度达108 109个 ml 即可接入发酵罐作为种子 这称为一级种子罐扩大培养 也称二级发酵 生长较慢的菌种 如青霉素生产菌种 其孢子悬浮液接入一级种子罐扩大培养于27 培养40h 此时孢子发芽 长出短菌丝 再移至含有新鲜培养基的第二级种子罐 于27 培养10 24h 菌丝迅速繁殖 获粗壮菌体 即可移至发酵罐作为种子 这称为二级种子罐扩大培养 也称三级发酵 一般50m3发酵罐都采用三级发酵 生长更慢的菌种 链霉素生产菌种灰色链霉菌 一般采用三级种子罐扩大培养 四级发酵 在小型罐 5 500L 中进行实验时 通常采用直接将孢子或菌丝体接入罐中发酵 这可称为一级发酵 生产车间阶段种子培养物的选择原则 在生产车间阶段 最终一般都是获得一定数量的菌体或菌丝体 菌丝体比孢子要有利 缩短发酵时间有利于获得好的发酵结果 目的 获得一定数量和质量的菌体 因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长 所以营养要比发酵培养基丰富 在原料方面 不如实验室阶段那么精细 而是基本接近于发酵培养基 这有两个方面的原因 一是成本二是驯化 例 柠檬酸发酵 黑曲霉 以蔗糖为原料成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁蔗糖2 5 5 20 NH4NO30 225 0 11 K2HPO40 03 MgSO4 H2O0 025 0 025 KCl0 015 琼脂2 薯干粉 成分斜面种子罐发酵麦芽汁麦汁薯干粉10 22 28 NH4 2SO40 5 琼脂2 种子制备过程举例 一 谷氨酸生产的种子制备制备过程斜面种子 摇瓶种子培养 一级种子培养 发酵 1 斜面 培养基 蛋白胨1 牛肉膏1 氯化钠0 5琼脂2 pH7 0 7 2培养条件 32 生长18 24小时培养基特点 有利于菌体的生长 原料比较精细生长斜面要求 生长良好 所使用斜面连续传代不超过3次 2 摇瓶种子 培养基 葡萄糖2 尿素0 5 玉米浆2 5 K2HPO40 1 培养条件 于1000ml三角瓶中 装液200 250ml 32 培养12小时 培养基特点 有利于菌体的生长 所使用的原料已经基本接近于发酵培养基 3 一级种子 种子罐 培养基 和摇瓶种子相似 其中葡萄糖用水解糖代替 浓度为2 5 培养条件 在种子罐中培养 容积为发酵罐的1 32 培养7 10个小时培养基的特点 长菌体 更接近于发酵培养基 种子的质量要求 108 109个 ml大小均匀 呈单个或八字排列PH7 0 7 2时结束 6 8 8 7 0 7 2活力旺盛 二 青霉素生产的种子制备 制备过程安瓿瓶 斜面孢子 大米孢子 一级种子培养 二级种子培养 发酵 1 斜面孢子 培养基 甘油 葡萄糖 蛋白胨等培养条件 25 7天 注意湿度50 左右培养基特点 有利于长孢子 用量少而精细 2 大米孢子 培养基 大米及氮源 玉米浆 培养条件 25 7天 控制湿度培养基的特点 成本低 米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质 营养适当 有利于孢子的生长 大米孢子的要求 1粒米含1 4 106个孢子 3 一级种子 培养基 葡萄糖 乳糖 蔗糖 玉米浆培养条件 27 40小时接种量 200亿孢子 吨目的 长菌体 4 二级种子 培养基 同上培养条件 27 10 14小时接种量 10 种子的质量要求 菌丝长稠呈丝状 菌丝团很少 有中小空泡 处于 期 青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期 1 4为年青期 4 6期合成青霉素的能力最强 第二节生产菌种的质量控制 一 影响孢子质量的因素 1 培养基a 培养基的原材料的产地 品种 加工方法和用量对孢子质量都有一定影响 原材料质量波动的主要原因 无机离子含量不同 微量元素Mg2 Cu2 Ba2 能刺激孢子的形成 磷含量太多或太少也会影响孢子的质量 如 四环素 土霉素生产中 配制产孢斜面培养基用的麸皮 因小麦产地 品种 加工方法及用量的不同对孢子质量均有一定影响 制备霉菌用的大米 其产地 颗粒大小 均匀程度不同 孢子质量也不同 蛋白胨加工原料不同 如鱼胨或骨胨 对孢子影响也不同 b 水质波动引起孢子质量不稳定 减少水质影响的方法 在蒸馏水或无盐水中加入适量无机盐 供配制培养基使用 解决措施 斜面培养基的主要材料经化学分析和摇瓶发酵试验合格后才能用于孢子培养基 应保证培养基灭菌后的质量 水份适中有利于孢子生长 因此斜面培养基使用前应于一定温度下放置一定时间 使斜面无冷凝水 供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源 作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源 2 培养条件 温度温度过低 菌种生长发育缓慢 温度过高会使菌丝过早自溶 适当提高培养温度 可加速菌体代谢 缩短培养时间 但不可超过菌体敏感温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著影响 如 在制备土霉素生产种子过程中 高于37 培养时 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢 氨基氮回升提前 菌丝过早自溶 效价降低等现象 湿度放线菌一般要求相对湿度较低 真菌一般要求相对湿度较高 相对湿度对孢子形成的速度 数量和质量均有影响 不同湿度对龟裂链霉菌 产土霉素 斜面生长的影响相对湿度斜面外观活孢子数 108 支 16 5 19上部稀薄 下部稠 略黄1 225 36上部薄 中部均匀 发白2 340 45一片白 孢子丰富 稍皱5 7 3 斜面培养时间和冷藏时间 培养时间孢子培养工艺一般选取在孢子成熟阶段时终止培养 一般 衰老的孢子核物质趋于分化 因此不如年轻的孢子 但过于年轻的孢子经不起冷藏 显微观察可见成串孢子或游离分散的孢子 如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4 C冰箱保存 发现冷藏7 8天菌体细胞开始自溶 而培养5天以后冷藏 20天未发现自溶 菌丝衰老自溶阶段 孢子变色 发暗或黄菌层下陷有时出现白色斑点或发黑生产能力下降 孢子成熟阶段 产孢子量多有正常的孢子颜色和色素孢子成熟产量正常 培养时间应控制在孢子成熟阶段 不宜提早或延迟 冷藏时间对孢子的生产能力有较大影响 冷藏时间越长 生产能力下降越多 原则 宜短不宜长 链霉素生产中 斜面孢子在6 冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18 冷藏3个月后会降低35 4 接种量 接种量要求适中 接种后菌落均匀分布整个斜面 传代斜面孢子要求菌落分布较稀疏 进摇瓶或进罐的孢子要求菌落分布适中或稍密 孢子数量达到要求 一只高度为20cm 直径为3cm的试管斜面 丝状菌孢子数要求达107 二 影响种子质量的因素 1 培养基 培养种子的目的 扩大培养 增加细胞数量 同时也必须培养出强壮 健康 活性高的细胞 为了使细胞迅速进行分裂或菌丝快速生长 种子培养基特点 有较完全和丰富的营养物质 糖分少 需充足氮源和生长因子 无机氮源比例大 各种营养物质的浓度不必太高 供孢子用的种子培养基 可添加易被吸收利用的碳源和氮源 应考虑与发酵培养基的主要成分相近 pH pH值稳定选择最适种子培养pH的原则是获得最大比生长速率和适当的菌量 培养最后一级种子的培养基的pH应接近于发酵培养基的pH 以便种子能尽快适应新的环境 2 培养条件 足够的通气量 以保证菌种代谢正常 提高种子的质量 前期少 后期多 搅拌可提高通气效果 促进生长繁殖 过度搅拌导致培养液大量涌泡 液膜表面的酶易氧化变性 泡沫过多增加染菌机会 增加能耗 丝状微生物不宜剧烈搅拌 3 种龄 种龄 指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或者发酵罐时的培养时间 通常种龄应取菌种处于对数生长期 菌体还未达到最大值时的培养时间为宜 大量地接入培养成熟的菌种的优点 缩短生长过程的延缓期 因而缩短了发酵周期 提高了设备利用率节约发酵培养的动力消耗有利于减少染菌机会 种龄对发酵的影响 种龄太短 接入发酵罐后 前期生长缓慢 泡沫多 发酵周期延长 因菌体量少易引起菌丝结团 种龄太长 接入发酵罐后 菌种趋于老化 生产能力下降 菌体自溶 最适种龄 接入发酵罐后 很快适应环境 生长繁殖快 大大缩短延滞期 缩短非产物合成的时间 提高发酵罐的利用率 节省动力消耗 嗜碱性芽孢杆菌种龄对产酶 碱性蛋白酶 的影响 镜检 24小时多个杆菌首尾相连成线形 处于繁殖旺盛期30小时开始出现芽孢 移入种子的体积接种量 接种后培养液的体积 4 接种量 接种量过多 菌体生长过快 过稠 造成营养缺乏 溶解氧不足 同时移入过多代谢废物 不利于发酵生产 接种量过少 前期菌体生长缓慢 发酵周期延长 菌丝量少 因菌体量少易引起菌丝结团 适合接种量 接入发酵罐后 适应环境快 且种子液中含有大量水解酶 有利于对发酵培养基的利用 缩短发酵罐中菌丝繁殖所需要的时间 使产物开始合成的时间提前 并可减少染菌机会 通常接种量 细菌1 5 酵母菌5 10 丝状真菌和放线菌7 15 有时可达20 25 在放射形土壤杆菌多糖 ARPS 发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响 接种量对菌体形态和产 亚麻酸的影响 亚麻酸发酵一般是采用丝状真菌来进行 丝状真菌的形态往往对发酵有较明显的影响 被孢霉 研究发现 采用被孢霉进行 亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体的形态 从而影响菌体干重和 亚麻酸产量 三 发酵罐的接种方式 单种 倒种 双种 混种 种子罐 种子罐 发酵罐 发酵罐 四 种子质量的控制措施 种子质量标准细胞或菌体生化指标 1 pH2 培养基灭菌后磷 糖 氨基氮的含量 菌体形态 菌体浓度和培养液外观 色素 颗粒等 单细胞 菌体健壮 菌形一致 均匀整齐 有的还要求有一定的排列或形态 霉菌 放线菌 菌丝粗壮 对某些染料着色力强 生长旺盛 菌丝分枝情况和内含物情况好 产物生成量酶活力 在抗生素发酵中 产物生成量是考察种子质量的重要指标 因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度 种子液中某种酶的活力 与目的产物的产量有一定的关联 无杂菌 菌种稳定性的检查测定其生产能力 从中挑选高产菌株 并及时对退化菌种进行复壮种子无杂菌检查 保证纯种发酵 镜检肉汤或琼脂斜面培养进行检查生化分析如测定营养消耗的速度 pH变化 溶氧利用 色泽气味等 五 种子异常的分析 1 菌种生长发育缓慢与孢子质量和培养条件有关 生长过缓 无菌空气温度低 或者培养基灭菌质量差 2 菌丝结团液体培养条件下 菌丝不分散舒展而呈聚团状 影响呼吸和营养传递 与搅拌效果差 接种量小有关 3 菌丝粘壁搅拌效果差 泡沫过多 装料系数过小 第三节生产菌种的保藏 1 菌种保藏的目的保证其生产性能稳定 不污染杂菌 不死亡 2 菌种保藏原理菌种保藏的方法很多 原理也大同小异 首先要挑选典型菌种的优良纯种 最好采用它们的休眠体 如分生孢子 芽孢等 其次 还要创造一个最有利休眠的环境条件 诸如干燥 低温 缺氧 避光 缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等 3 影响菌种存活及长期保藏的主要因素 1 培养条件和菌龄 2 菌种悬液的浓度 3 保护剂 4 冻结速度 5 干燥程度 6 保藏条件 7 恢复培养 不同菌种保藏方法比较 冷冻干燥保藏法和液氮保藏法 1 斜面低温保藏法 保藏对象 各类微生物 保藏时间 1 3个月 保藏过程 4 冰箱保藏定期移接 注意事项 冰箱的温度 不可波动太大 不能在0 以下保存 用橡胶塞代替棉塞 可避免培养基水分蒸发 克服棉塞受潮受污染 4 常用的菌种保藏方法 2 液体石蜡封存保藏法 保藏对象 不以石蜡为碳源的菌种 保藏时间 1年 保藏过程 在斜面菌种上加入灭菌后的液体石蜡 用量高出斜面1cm 使菌种与空气隔绝 试管直立 置于4 冰箱中保存 3 固体曲保藏法 保藏对象 产孢子的真菌 保藏时间 1 3年 保藏过程 大 小 米培养基 培养 冰箱保藏 成熟孢子 孢子悬浮液 大 小 米吸水膨胀 蒸 搓散团块 分装 灭菌 测含水量 抽真空后低温或室温保藏 保藏对象 产孢子的放线菌 霉菌以及产芽孢的细菌 保藏时间 1年以上 保藏过程 将黄砂和泥土分别洗净 过筛 按3 2或1 1比例混合后 装入小试管内 装料高度约为1cm左右 经间歇灭菌2 3次 灭菌后烘干 并作无菌检查后备用 将要保存的菌种斜面孢子刮下 直接与砂土混合 或用无菌水洗下孢子 制成悬浮液 再与砂土混合 混合后的砂土管放在盛有五氧化二磷或无水氯化钙的干燥器中 用真空泵抽气干燥后 放在干燥低温环境下保存 4 砂土管保藏法 5 冷冻干燥法 保藏对象 各种微生物 保藏时间 5 10年 保藏过程 将菌种制成悬浮液 与保护剂 一般为脱脂牛奶或血清等 混合 放在安瓿管内 用低温酒精或干冰 15 以下 使之速冻 在低温下用真空泵抽干 最后将安瓿管真空熔封 低温保存备用 6 液氮超低温保藏法 保藏对象 各种微生物 保藏时间 10年以上 保藏过程 将要保存的菌种 菌液或长有菌体的琼脂块 置于10 甘油或二甲基亚砜保护剂中 密封于安瓿管内 安瓿管的玻璃要能承受很大温差而不致破裂 先将菌液降至0 再以每分钟降低1 的速度 一直降至 35 然后将安瓿管放入液氮罐的气相中保存 液氮上面的气相温度为 150 以下 4 菌种保藏的注意事项 1 菌种在保藏前所处的状态保藏用的孢子或芽孢等要采用新鲜斜面上生长丰满的培养物 菌种斜面的培养时间和培养温度影响其保藏质量 一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存 效果较好 2 菌种保藏所用的基质斜面培养基碳源比例少 营养成分贫乏 砂土管保藏需将砂和土充分洗净 以防其中含有过多的有机物 影响菌的代谢或经灭菌后产生一些有毒的物质 冷冻干燥所用的保护剂过度加热往往形成有毒物质 灭菌时应特别注意 3 操作过程对细胞结构的损害冷冻干燥时 冻结速度缓慢易导致细胞内形成较大的冰晶 对细胞结构造成机械损伤 真空干燥程度也将影响细胞结构 加入保护剂就是为了尽量减轻冷冻干燥所引起的对细胞结构的破坏 4 国内外重要菌种保藏机构 1 ATCC AmericanTypeCultureCollection 美国标准菌种收藏所 马里兰州 罗克维尔市2 CSH ColdSpringHarborLaboratory 冷泉港研究室 美国3 IAM InstituteofAppliedMicrobiology UniversityofTokyo 日本东京大学应用微生物研究所 日本东京4 IFO InstituteforFermentation Osaka 发酵研究所 日本大阪 5 普通微生物菌种保藏管理中心 CCGMC 中科院微生物所 北京6 工业微生物菌种保藏管理中心 CICC 轻工部食品发酵工业科学研究所 北京7 医学微生物菌种保藏管理中心 CMCC 中国医学科学院皮肤病研究所 南京中国药品生物制品检定所 北京 中国预防医学科学院病毒学研究所 北京 8 中国抗生素菌种保藏管理中心 CACC 中国医学科学院医药生物技术研究所 北京 四川抗生素工业研究所 成都 华北制药集团抗生素研究所 石家庄 9 兽医微生物菌种保藏管理中心 CVCC 中国兽医药品监察所 北京 10 林业微生物菌种保藏管理中心 CFCC 中国林业科学研究院 北京