表观遗传研究生一级

白 云第三军医大学基础部医学遗传学教研室E-mail: ,DNA甲基化,表观遗传学,遗传、变异和环境是生物进化的三大因素拉马克主义（Lamarckism）：用进废退达尔文主义（Darwinism）：优胜劣汰 孟德尔遗传学 分子遗传学,第一节 遗传与表观遗传,基因型(Genotype) - 表型(Phenotype),基因表达模式,一个多细胞生物机体的不同类型细胞,相同的基因型,不同的表型,从受精卵发育分化成200多种不同类型细胞的调控机制是什么？导致同一个细胞内DNA序列完全相同的等位基因发生功能差异的机制是什么？组织和细胞特异性基因表达模式的建立，及其传递和维持的机制是什么？环境因素影响表型的机制是什么？,需解释的问题：,基因组包含两类遗传信息；一类提供合成生命必须的RNA和蛋白质的模板，称遗传编码信息；另一类提供何时、何地、以何种方式去应用遗传编码信息，称为表观遗传信息表观遗传信息构成了基因和表型间的关键信息界面。它拓展了经典的遗传信息所涵盖的意义，使生物在保持遗传稳定的同时能够更好地适应环境,Agouti小鼠的A基因编码一种旁分泌的信号分子, 能使毛囊黑色素细胞从合成黑色素转为合成黄色素。在鼠毛生长的中间阶段，A基因的一过性短暂表达在每根鼠毛的毛尖下方形成黄色条带，使野生型Agouti小鼠呈现特征性的棕褐色,环境因素对基因表达的调控,在A基因5 端上游插入一个源自逆转座子的IAP ( intracisternal A particle) 序列后，A基因受IAP中的启动子调控而持续异位表达，造成携有该突变的小鼠毛色变黄，肥胖。插入了IAP的A基因称为AVY等位基因(Agouti viable yellow gene allele),J. Nutr. 127, 1902S1907S (1997). FASEB J. 12,949957 (1998).,IAP启动子区域CpG岛的甲基化会使有些细胞中的AVY基因表达受抑。所以，即使在近交系同窝仔鼠中，AVY小鼠也会出现以黄色为主到杂以大小不等的棕褐色斑块的不同表型,J. Nutr. 127, 1902S1907S (1997). FASEB J. 12,949957 (1998).,Effect of maternal dietary supplementation on the phenotype and epigenotype of Avy/a offspring.,Mol. Cell. Biol. 23, 52935300 (2003).,（1）表观遗传修饰对环境因子的敏感性可以用来解释遗传学上完全一样的个体在不同的环境中可产生明显的表型差异，也提示表观遗传修饰在基因和环境的相互作用中起着重要的作用,Agouti小鼠实验的深刻启示在于：,（2）基因组中可转座因子的异常甲基化， 会引起个体在细胞水平上的表观遗传镶嵌性，扩大了表型变化的范围,表观遗传学(epigenetics)：研究不涉及DNA序列改变的基因表达和调控的可遗传变化机制，或者说是研究从基因型演绎为表型的过程和机制的一门新兴的遗传学分支,表观遗传的异常会引起表型的改变、机体结构和功能的异常，甚至导致疾病,遗传学与表观遗传学,表观遗传学（epigenetics）揭示了基因表达调控机制的两个特征：一是它们长久地可以受到自然性的后天影响（可获得性），二是它们可以遗传（可遗传性）。这两种因素结合在一起，那么获得性遗传就是有可能的了如此，至少在某种程度上，表观遗传学让拉马克主义复活了，它也许能够成为达尔文进化思想的一个补充,表观遗传机制,DNA甲基化,组蛋白修饰和染色质重塑,非编码RNA调控,第二节 表观遗传密码概述,基因组 DNA上胞嘧啶的第5位碳原子和甲基共价结合，被修饰为5甲基胞嘧啶 (5-methylcytosine，5-mC)，是最重要的表观遗传修饰形式之一,1. DNA甲基化 (DNA methylation),结构基因5端附近富含CpG二联核苷的区域称为CpG岛(CpG islands),DNA甲基化,哺乳动物基因组DNA中5-mC约占胞嘧啶总量的2%-7%，绝大多数5-mC存在于CpG二联核苷(CpG doublets),通常，DNA甲基化与基因沉默 (gene silence) 相关；非甲基化与基因活化 (gene activation) 相关；去甲基化与沉默基因的重新激活 (reactivation) 相关,基因启动子所含CpG岛中的5-mC会阻碍转录因子复合体与DNA的结合，抑制转录 DNA甲基化序列与MeCP、MBD结合后，募集转录阻遏蛋白质到局部，使组蛋白去乙酰化、染色质重构、异染色质化，抑制基因表达,DNA甲基化调节基因转录,CpG 频率,5,Rb基因,3,识别、结合甲基化序列的蛋白质,从头甲基化胚胎期，对称，Dnmt3a、b完成 维持甲基化 成熟体细胞， Dnmt1完成,DNA甲基化状态的遗传,DNA甲基化状态的保持,DNA主动去甲基化,DNA全新甲基化,5-羟甲基胞嘧啶第六种碱基的奥秘,5mC 和 5hmC 的生成图示,Science, 2009, 324(5929): 929930,Science, 2009, 324(5929): 930935,TET 蛋白家族结构示意图,Schematic diagrams of the Tet proteins,5hmC 在基因组中的分布,5hmC 在 DNA 去甲化过程中的作用,Relationship of Tet1/5hmC and transcription in mouse ES cells.,2. 组蛋白修饰与染色质重塑,组蛋白的 N端会受到不同的化学修饰，如磷酸化、乙酰化和甲基化等修饰组蛋白中被修饰氨基酸的种类、位置和修饰类型组成了组蛋白密码（histone code）组蛋白的结构修饰可使染色质的构型改变，与基因的表达调控密切相关。以核小体变化为基本特征的染色质结构变化过程称为染色质重塑,染色质结构状态,乙酰化：大多发生在H3、H4的 Lys 残基上，一般与活化的染色质构型相关甲基化：发生在H3、H4的 Lys 和 Asp 残基上，可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，取决于被修饰的位置和程度磷酸化：发生与 Ser 残基，一般与基因活化相关泛素化： 一般是C端Lys修饰，启动基因表达SUMO（一种类泛素蛋白）化： 可稳定异染色质,组蛋白修饰种类,组蛋白乙酰化修饰大多集中在H3的第9、14、18、27位赖氨酸及H4的第5、8、12和16位的赖氨酸组蛋白乙酰化是由组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰基酶(HDAC)协调催化完成，是一个可逆的动力学过程，可以调节基因的转录,组蛋白乙酰化修饰,HAT and HDAC,40,KAT: lysine (K) acetyltransferase,41,组蛋白甲基化多发生于组蛋白H3、H4的赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基上，可发生一甲基、二甲基和三甲基化。研究最多的位点是H3K4, H3K9, H3K27, H3K36, H3K79 和 H4K20。组蛋白甲基化由特异的组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferase, HMT)催化完成，去甲基化是由赖氨酸去甲基酶(lysine-specific demethylase 1, LSD1)催化完成。,组蛋白甲基化修饰,Nature Review Genetics, 2012,13(5): 343,组蛋白修饰种类与功能,DNA甲基化、组蛋白乙酰化、染色质重塑与转录调节,4. RNA 调控,lncRNome: http:/genome.igib.res.in/lncRNome/NONCODE: /index.php LNCipedia: /DIANA-LncBase : http:/diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=lncBase/indexstarBase : /index.php,lncRNA database,真核细胞中,存在着一个由DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质结构重塑和ncRNA系统组成的一个表观遗传修饰网络，能动地调控着具有组织和细胞特异性的基因表达模式。机体的表观遗传模式的变化在整个发育过程中是高度有序的，也是严格受控的,表观遗传调控作用,基因组印迹,基因表达编程,X染色体失活,第三节 DNA甲基化与表观遗传现象,1956年, A.Prader 和 H.Willi 父源染色体15q11-13区段缺失,Prader-Willi 综合征,Angelman综合征 1968年H.Angelman 母源染色体15q11-13区段缺失,PWS和AS这一对综合征表明父亲和母亲的基因组在个体发育中有着不同的影响，这种现象被称为基因组印迹(genomic imprinting)。也称为遗传印记（genetic impriting） 基因组印记 (genomic imprinting) 是在受精卵形成过程中，特异性地对源于父亲或母亲的等位基因做一印记，使其只表达父源或母源等位基因，在子代中产生不同表型。是一种不符合孟德尔遗传规律的表观遗传现象,1. 基因组印记 (genomic imprinting),近年研究表明，基因组印迹是两个亲本等位基因的差异性甲基化造成了一个亲本等位基因的沉默，另一个亲本等位基因保持单等位基因活性。,在父源和母源染色体上，这些调控元件的CpG岛呈现甲基化型的明显差异。,在PWS和AS患者中发现，微小染色体缺失集中的区域有成簇排列的富含CpG岛的基因表达调控元件，称为印迹中心(imprinting centers , ICs),SNRPN的23个CpG二联核苷,父源,非甲基化,完全甲基化,母源,例如,差异甲基化(differential methylation)：父源和母源染色体上的ICs的甲基化呈现出分化状态,Beckwith-Wiedemann综合征(BWS)是一种过度生长综合征,常伴有肥胖和先天性脐疝等症状，并有儿童期肿瘤易患倾向,在长约1Mb的该区段中至少有12个成簇排列的印迹基因，其中有些呈父源等位基因表达模式，另一些呈母源等位基因表达模式，这些基因分属两个印迹域(imprinted domain)，它们的印迹状态分别受控于印迹调控区(impriting control regions，ICR),源于染色体11p15.5区段的多种能造成该区段印迹基因表达失衡的遗传学和表观遗传学调节机制异常,差异甲基化区（ICE）、锌指蛋白（CTCF）和增强子（E）对Igf2和H19的交互易换式印迹调节模式,已发现100多个印迹基因，大多成簇排列，其中许多与疾病相关多数印迹基因的作用机制尚不清楚，但都与DNA甲基化型的异常相关不同亲本来源的印迹基因的DNA甲基化型是在生殖细胞成熟过程中建立的,印迹基因的DNA甲基化型在生殖细胞成熟过程中的建立,原始性细胞（2n）,配子（n）,合子（2n）,基因组印迹是性细胞系的一种表观遗传修饰，由一整套分布于染色体不同部位的印迹中心来协调 印迹中心介导印迹标记的建立及其在发育全过程中的维持和传递，并以亲本来源特异性方式优先表达两个亲本等位基因中的一个，而使另一个沉默。 哺乳动物中相当数量的印迹基因与胎儿的生长发育和胎盘的功能密切相关,发育是一个高度有序的生物学过程，是从一个全能的受精卵开始，到建成一个由200多种结构和功能各异的细胞组成的整体的过程,2. 基因重新编程 (reprogramming),一个生物机体的所有细胞虽具有完全一样的基因组，却有不一样的基因表达模式。与组织和细胞特异性的基因表达模式的建立和维持相关的细胞信息，必需是可以通过细胞分裂而遗传的，同时也应该具备被删除和重建的潜在可能性,“多莉”克隆绵羊的诞生雄辩地证明：一个来自成年的哺乳动物的高度分化的体细胞仍然保持发育成为完整个体的能力，也就是说细胞的分化并没有造成不可逆的遗传物质修饰,已完全分化的细胞，其基因组在特定条件下可经表观遗传修饰重建而为胚胎发育中的基因表达重新编程，赋予发育全能性，为胚胎发育和分化发出正确的指令。胚胎发育中表观基因组重新编程的差误将会导致多种表观遗传缺陷性疾病,多莉：死掉了,Ian Wilmut,Dolly,多莉：生于1996年7月5日，死于2003年2月14日,早期原始生殖细胞在沿着生殖系统管腔移行时，原属体细胞型的表观遗传修饰(包括基因组印迹)会被删除。在生殖细胞发生与成熟过程中表观遗传标记重新建立,受精后，会进行除印迹基因以外的表观遗传修饰的删除与重建，重建后的表观基因组在组织特异性定型后被稳定地维持,Dynamic changes of 5mC and 5hmC levels in the paternal and maternal genomes during preimplantation development.,Levels of mC, hmC, and the TET enzymes during cellular development,Cell Stem Cell. 2013 Mar 13.,Tet1 acts at the Oct4 loci to promote 5mC-to-5hmC conversion and facilitates the DNA demethylation and transcriptional reactivation during OSKM iPSC induction.Tet1 (T) can replace Oct4 and initiate somatic cell reprogramming in conjunction with Sox2 (S), Klf4 (K), and c-Myc (M). Established an efficient TSKM secondary reprogramming system5hmC enrichment is involved in the demethylation and reactivation of genes and regulatory regions that are important for pluripotency.,A Schematic Model of TSKM-Mediated Reprogramming and Quantification of 5mC and 5hmC in iPSCs,Mol Cell. 2013 Feb 28.,Genomic imprinting directs the allele-specific marking and expression of loci according to their parental origin. Differential DNA methylation at imprinted control regions (ICRs) is established in gametes and, although largely preserved through development, can be experimentally reset by fusing somatic cells with embryonic germ cell (EGC) lines.The fusion of B cells with EGCs initiates pluripotent reprogramming, in which rapid re-expression of Oct4 is accompanied by an accumulation of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) at several ICRs. Tet2 was required for the efficient reprogramming capacity of EGCs, whereas Tet1 was necessary to induce 5-methylcytosine oxidation specifically at ICRs. These data show that the Tet1 and Tet2 proteins have discrete roles in cell-fusion-mediated pluripotent reprogramming and imprint erasure in somatic cells.,动物实验中，改变胚胎培养液会引起异常甲基化和印迹基因Igf2和H19的表达失调，造成印迹性疾病辅助生育是在配子生成和胚胎发育早期干预生殖 ，这正是表观遗传编程获得和维持的关键时期，提示有必要对经辅助生育技术孕育的孩子作表观遗传学监测,表观遗传修饰的重新编程对环境变化非常敏感,1949年,Barr在雌猫神经元的核中发现紧贴核膜有深染，呈圆、椭圆、三角形的小体，而雄猫中没有。其它哺乳类（包括人类）都有这一现象，当时命名为Barr小体，现在称X染色质,雄 雌,3. X染色体失活,雌性哺乳动物细胞内仅有一条X染色体是有活性的，另一条在遗传上是失活的，在间期细胞核中固化为异染色质。因此，雌雄两性细胞中都只有一条X染色体保持转录活性，使X连锁基因产物的量保持相同水平失活发生在胚胎早期（第16天）X染色体的失活是随机的，失活后是恒定的失活的X染色体上仍有部分基因是有活性的,Lyon 化现象 X染色体的剂量补偿（dosage compensation）,X染色体失活过程模式图,1991年，发现X染色体Xq13.3区段有一个X失活中心 (X-inaction center，Xic)，X-失活从Xic区段开始启动，然后扩展到整条染色体,X染色体失活的机制,Nature 349, 38-44 (3 January 1991),Xist：X染色体失活的特异性转录子，产物是lncRNA。,Tsix：位于Xist下游的反向转录子，产物也是lncRNA，调控Xist的功能,DXPas34：富含CpG，包括15Kb的微卫星序列，参与X-失活。,Xic长约1Mb，包括基因：Xist、Tsix 和DXPas34,LncRNAs in X-chromosome inactivation,X染色体失活相关的疾病多是由X染色体的不对称失活使携带有突变等位基因的X染色体在多数细胞中具有活性所致 Wiskott-Aldrich综合征：由于WASP基因突变所致 自身免疫性疾病：女性易感也和X染色体失活相关，因为女性为嵌合体，如果自身免疫性T细胞不能耐受两个X染色体所编码的抗原，则会导致自身免疫缺陷性疾病，如红斑狼疮等,与X染色体失活相关的疾病,Rett综合征是一种X连锁遗传性进行性神经系统疾病，其疾病基因是X染色体上编码McCP2 蛋白质的基因,Rett综合征,ICF综合征是一种罕见的常染色体隐性遗传病，主要病症是不同程度的免疫缺陷，并伴以面部畸形和智力低下。患者至少有两种同型免疫球蛋白的减少或缺失，并造成细胞免疫缺陷,ICF综合征,患者有典型随体序列和的低甲基化，是能催化DNA从头甲基化的DNMT3B编码基因的突变所致 患者的淋巴细胞分裂中，1号、9号和16号等多条染色体的环着丝粒区域的不稳定性明显增高。这些区域含一种卫星DNA序列，与着丝粒的功能和动基体装配有关。这些序列通常是被甲基化的，但在ICF患者中几乎完全非甲基化,Cell. 2012 Dec 21;151(7):1417-30.,最新进展,早在1979年R.Holliday就曾经提出DNA甲基化可能在癌变过程中起着重要的作用。 1983年，发现癌细胞中DNA甲基化的总体水平低于正常细胞，肿瘤细胞的低 甲 基化频繁发生于重复序列和在生物进化过程中引入的寄生性DNA，造成基因组不稳定,第四节 表观遗传与肿瘤,除DNA甲基化的总体水平降低之外，癌细胞往往出现局部序列的高甲基化，高甲基化通常集中在抑癌基因启动子附近的GpG岛,DNA甲基化的异常可能是癌细胞中某些抑制恶性生长的基因沉默的原因,组织特异性甲基化,遗传印记,X-染色体失活,转座重复顺序的静息化,抑癌基因的启动子CpG岛的高甲基化,全景性的去甲基化,5mC 的高变异性T,正常细胞,肿瘤细胞,DNA CpG 甲基化,肿瘤细胞的表观遗传变化,表观遗传异常与肿瘤发生,甲基化和去乙酰化药物治疗肿瘤,表观遗传学是建立在经典遗传学理论基础上，研究基因功能实现机制的遗传学分支学科 遗传学研究基因序列改变所致基因表达变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而表观遗传学则研究基于非基因序列改变所致基因表达变化，如DNA甲基化和染色质构象变化等,结束语,Reviews：Cell，2007：128 issue 4 Nature, 2007:vol447 issue 24 Web site :///labheads/allis/index.phphttp:/www.babraham.ac.uk/chromatin/fraser.html,FURTHER READING,谢谢,Yi Zhang: 张毅,Born: 1963, SichuanBS: 1984 Agricultural University of ChinaPhD: 1995 Florida State University at TallahasseePostdoc: 1999 Robert Wood Johnson School of MedicineAsst. Prof. 1999-2004 University of North Carolina, Chapel HillAssociate Prof 2004-2005 UNCProfessor 2005, HHMI2005,Graduate StudentPabon-Pena, L.M., Zhang, Y.,and Epstein, L. M. (1991). Newt satellite 2 transcripts self-cleave by using an extended hammerhead structure. Mol. Cell. Biol.11, 6109-6115.Coats, S. R., Zhang, Y.,and Epstein, L. M. (1994). Transcription of satellite 2 from the newt is driven by a snRNAtype of promoter. Nucleic Acids Res.22, 4697-4704.Zhang, Y.,and Epstein, L. M. (1996). Cloning and characterization of satellite 2 hammerheads from a diverse set of caudate amphibians. Gene172, 183-190.PostdocZhang, Y., Iratni, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., and Reinberg, D. (1997). Histonedeacetylasesand SAP18, a novel polypeptide, are components of a human Sin3 complex. Cell 89, 357-364.Zhang, Y., Sun, Z. W., Iratni, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Hampsey, M., and Reinberg, D. (1998). SAP30, a novel protein conserved between human and yeast, is a component of a histonedeacetylasecomplex. Mol Cell1, 1021-1031.Zhang, Y., LeRoy, G., Seelig, H.-P., Lane, W., and Reinberg, D. (1998). The dermatomyositis-specific autoantigenMi2 is a component of a protein complex containing histonedeacetylaseand nucleosomeremodeling activities. Cell 95, 279-289.Zhang, Y., Ng, H-H., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Bird, A., and Reinberg, D. (1999). Analysis of the NuRDsubunits reveals a histonedeacetylasecore complex and a connection with DNA methylation. Genes & Dev. 13, 1924-1935.,Assistant Prof.(2001). Genes & Dev, 15: 827-832. (2001). Gene 268, 77-85. (2001). Science 293, 853-857.(2001). Nucleic Acids Res. 29, 2517-2521. (2001). Mol.Cell8, 1207-1217. (2002). Mol. Cell. Biol.22, 536-546. (2002). Oncogene21, 148-152. (2002). Genes Dev16, 1518-1527.(2002). Curr Biol12, 1052-1058. (2002). Curr Biol12, 1086-1099. (2002). Science 298, 1039-1043.(2003). Science 300, 131-135. (2003). 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