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第四章基因工程制药Chapter4GeneEngineeringforPharmacon 基因工程 是通过对Nucleicacid分子的Insert AssembleandRecombinant而实现遗传物质 germplasm 的重新组合 再借助Virus Bacterium PlasmidorotherVectors 将Targetgene转移到新的HostCellSystem 并使TargetGene在新的Hostcellsystem进行ReplicationandExpression的技术 基因工程主要研究任务 Geneisolation synthesis Incision 切割 recombinant transformationandexpression GeneManipulation Genecloning DNArecombination 基因工程技术最成功的成就 用于新型生物技术药物的研制 基因工程技术的主要工具 Toolenzyme工具酶 restrictionenzyme ligase repair Nucleicacidandproteinsequence Basisforgeneanalyzeandsynthesis Transfervector genetransfer Expressionvector Manufactureplantforgenereplicationandexpressiontargetproducts GoodVectors Ecol HighefficiencyexpressionbutglycoproteinBeeryeast mammaliancell glycoprotein 传统制药存在的问题 A 材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用 B 从动物脏器中提取出来 也因造价太高 或因来源困难而供不应求 C 由于免疫抗原等缘故 使它们在使用上受到限制 基因工程技术的特点 就是能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质 甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质 基因工程技术的应用特点 A 为癌种 病毒性疾病 心血管疾病和内分泌疾病的预防 治疗和诊断提供新型疫苗 新型药物和新型诊断试剂 B 基因工程技术的最大好处在于它能从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基因 将其在体外进行剪切拼接 重新组合 然后转入适当的细胞进行表达 从而生产出比原来多数百 数千倍的相应的蛋白质 基因工程技术生产药品的优点 a 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质 为临床使用提供有效的保障 b 可以提供足够数量的生理活性物质 以便对其生理生化和结构进行深入的研究 从而扩大这些物质的应用范围 c 利用基因工程技术可以发现 挖掘更多的内源性生理活性物质 d 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处 可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造 e 利用基因工程技术可获得新型化合物 扩大药物筛选来源 基因工程的诞生与及其相关学科的关系 863 高技术计划在生物技术领域研究的三个主题之一是 新型药物 疫苗和基因治疗 重点是利用现代生物技术手段 开发化学合成法难以生产的药品 十五 期间 863计划选择了信息技术 生物和现代农业技术 新材料 先进制造与自动化技术 能源技术 资源环境技术等6个高技术领域 基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段 上游阶段 主要是分离目的基因 构建工程菌 细胞 目的基因获得后 最主要的就是目的基因的表达 选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能 其次是表达的量和分离纯化的难易 此阶段的工作主要在实验室内完成 下游阶段 从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制 此阶段是将实验室的成果产业化 商品化 主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立 新型生物反应器的研制 高效分离介质及装置的开发 分离纯化的优化控制 高纯度产品的制备技术 生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造 电子计算机的优化控制等 基因工程药物生产的基本过程 基因工程药物的上游技术 1 基因克隆载体 质粒载体 2 重组DNA技术的有关工具酶及其应用3 核酸制备技术 制备纯净 高质量的载体DNA和待克隆的核酸 才能有效地进行后续的酶切 反转录 连接等分子克隆操作 1 用碱抽提法分离质粒DNA原理 细胞pH12 0 12 6线状DNA变性 cccDNA不变性 加酸恢复pH到中性 变性的染色体DNA交织成网而沉淀 上清用酚处理使蛋白变性 用醇沉淀质粒DNA A 质粒DNA的小量制备B 质粒DNA的大量制备 2 染色体DNA的制备3 真核细胞RNA的制备DNA的凝胶 Agarose 电泳和凝胶中DNA的回收5 SDS PAGE电泳和凝胶中DNA的回收 第一节目的基因的获得 问题 来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因 为什么不能进行直接分离 目的基因的获取途径 一 逆转录法逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA 再反转录成cDNA 然后进行cDNA克隆表达 1 mRNApurificationa 细胞内RNA的组成和含量 DNA 95 核内 5 细胞器RNA 75 细胞质 10 核内 15 细胞器rRNA80 85 tRNA10 15 mRNA1 5 b 真核细胞mRNA的特点及分离纯化方法 3 polyA 20 250AAA oligo dT 纤维素柱纯化Poly A mRNA流程图 2 cDNA第一链的合成 一次好的逆转录反应可使oligo dT 选出的mRNA有5 30 被拷贝 3 cDNA第二链的合成 4 cDNAcloning expressionvectorpUC5 将重组体导入hostcell6 cDNAlibraryidentification7 目的cDNA克隆的分离和鉴定 限制酶图谱的绘制 杂交分析 基因定位 基因测序 确定基因的转录方向 转录起始点等 二 化学合成法较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得 化学合成法有个先决条件是 必须知道目的基因的核苷酸排列顺序 或知道目的蛋白质的氨基酸顺序 再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列 方法 合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段 再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段 然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段 再用连接酶连接成完整的基因 人工化学合成基因的限制 a 不能合成太长的基因 最长50 60bp 只适用于克隆小分子肽的基因 b 人工合成基因时 遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难 如用氨基酸顺序推测核苷酸序列 得到的结果可能与天然基因不完全一致 易造成中性突变 c 费用太高 第二节基因表达克隆蛋白质药物基因的一个主要目的使为了高效的表达该基因 从而大量地市场原本难以获得的药物 基因表达是指结构基因在生物体中的转录 翻译以及所有加工过程 基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动 即剪切下一个外源基因片段 拼接到另一个基因表达体系中 使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产物 进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量 表达产物的稳定性 产物的生物学活性和表达产物的分离纯化 因此 建立最佳的基因表达体系 是基因表达设计的关键 GST T10FusionProteinExpression Fig 2GST T10fusionproteinexpressedinBL21inducedwith1mMIPTG Lane1 Mr Lane2 Negativecontrol Lane3 expressedGST T10fusionprotein 以FusionProtein的形式表达药物基因许多蛋白质药物与原核生物的蛋白质融合后 能保留原有的免疫原性 一些免疫原性弱的多肽制成融合蛋白 其免疫原性能得到加强 用这种融合蛋白免疫动物所制备的抗体 能够用于检测原来的多肽药物 也可用于药代动力学研究 药物受体研究以及药物产品的检测 有些情况下 采用融合蛋白的形式表达外源基因是不得以而为之 一些多肽药物在原核细胞中不稳定 难以获得高表达 这些蛋白与菌体蛋白融合后得到稳定 但融合蛋白需经过后处理才能释放出有活性的外源多肽 多肽药物的纯化通常较为困难 但与特定的原核蛋白融合后 不仅能稳定所表达的产物 还能用识别蛋白的配体进行亲和层析纯化 如GST 融合基因 所产生的融合蛋白可用谷胱甘肽亲和柱一次性纯化 一 宿主细胞的选择宿主细胞的基本要求 容易获得较高浓度的细胞 能利用易得廉价原料 不致病 不产生内毒素 发热量低 需氧低 适当的发酵温度和细胞形态 容易进行代谢调控 容易进行DNA技术操作 产物的产量 产率高 且易提取纯化 宿主细胞的分类 原核细胞 常用的有大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 链霉菌等 真核细胞 常用的有酵母 丝状真菌 哺乳动物细胞 1 原核细胞 1 大肠杆菌 表达产物的形式 细胞内不溶性表达 包含体 胞内可溶性表达 细胞周质表达 极少还可分泌到胞外表达 不同的表达形式具有不同的表达水平 且会带来完全不同的杂质 特点 A 大肠杆菌中的表达不存在信号肽 故产品多为胞内产物 提取时需破碎细胞 此时细胞质内其他蛋白也释放出来 因而造成提取困难 B 由于分泌能力不足 真核蛋白质常形成不溶性的包含体 inclusionbody 表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复姓处理才能恢复其生物活性 C 在大肠杆菌中表达不存在翻译后修饰作用 故对蛋白质产物不能糖基化 因此 只适于表达不经糖基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白质 在应用上受到一定的限制 由于翻译常从甲硫氨酸的AUG密码子开始 故目的蛋白质的N端常多余一个甲硫氨酸残基 容易引起免疫反应 大肠杆菌会产生很难除去的内毒素 还会产生蛋白酶而破坏目的蛋白质 2 枯草芽孢杆菌 分泌能力强 可将蛋白质产物直接分泌到培养液中 不形成包含体 该菌也不能使蛋白质糖基化 另外由于它有很强的胞外蛋白酶 会对产物进行不同程度的降解 因此 它的应用也受到限制 3 链霉菌 重要的工业微生物 特点是不致病 使用安全 分泌能力强 可将表达产物直接分泌到培养液中 具有糖基化能力 可做理想的受体菌 2 真核细胞 1 酵母 繁殖迅速 可廉价的大规模培养 而且没有毒性 基因工程操作与原核生物相似 表达产物直接分泌到细胞外 简化了分离纯化工艺 表达产物能糖基化 特别是某些在细菌系统中表达不良的真核基因 在酵母中表达良好 目前以酿酒酵母应用最多 干扰素和乙肝表面抗原已获成功 2 丝状真菌 很强的分泌能力 能正确进行翻译后加工 包括肽剪切和糖基化 而且糖基化方式与高等真核生物相似 丝状真菌 如曲霉 被确认是安全菌珠 有成熟的发酵和后处理工艺 3 哺乳动物细胞 由于外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中 培养液成分完全由人控制 从而是产物纯化变得容易 产物是糖基化的 接近或类似于天然产物 但动物细胞生产慢 生产率低 而且培养条件苛刻 费用高 培养液浓度较稀 虽然从理论上讲 各种微生物都可以用于基因表达 但由于克隆载体 DNA导入方法以及遗传背景等方面的限制 目前使用最广泛的宿主菌仍然是大肠杆菌和酿酒酵母 二 大肠杆菌中的基因表达1 载体 表达载体必须具备的条件 1 载体能够独立的复制 2 具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 且克隆位点应在启动子序列后 以使克隆的外源基因得以表达 3 具有很强的Promoter 能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别 4 具有Repressor 使启动子受到控制 只有当诱导时才能进行转录 5 具有很强的终止子 以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因 而不转录无关的基因 6 所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号 即起始密码AUG和SD序列 以便转录后能顺利翻译 实例 pBV220系统中国预防医学科学院病毒学研究所构建 已成功的用于表达IL 2 3 4 6 8 TFN TNF TNF G CSF GM CSF等细胞因子 问题 阻遏子repressor的阻遏作用对hostcell有何影响 对foreigngene的表达有无影响 2 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因的表达产量 单位体积产量 细胞浓度和每个细胞平均表达产量呈正相关 细胞浓度与生长速率 外源基因拷贝数和表达产物产量之间存在着一个动态平衡 只有保持最佳的动态平衡才能获得最高产量 单个细胞的产量又与外源基因的拷贝数 基因表达效率 表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关 因此必须从以下因素入手 寻找提高外源基因表达效率的有效途径 1 外源基因的拷贝数 与载体在宿主中的拷贝数直接相关 2 外源基因的表达效率 启动子的强弱 SD序列和ATG的间距等 A 启动子的强弱 目的基因插入表达载体启动子的下游 可增加基因的表达 lac trp tac bla B 核糖体结合位点的有效性C SD与ATG的间距 影响非融合蛋白的合成水平D 密码子组成 设计引物或合成基因时选择大肠杆菌 偏爱 的密码子 3 表达产物的稳定性 组建融合蛋白 利用信号肽 特异性突变 位点特异突变 改变二硫键位置 宿主蛋白酶缺陷 4 细胞的代谢负荷 拟制外源基因的表达 宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开 5 工程菌的培养条件 host Vector cloninggene 3 真核基因在大肠杆菌中的表达方式 1 以融合蛋白的形式表达药物基因 融合蛋白氨基端是原核序列 羧基端是真核序列 优点 操作简便 蛋白质在菌体内比较稳定 易高效表达 但只能做抗原 一般不做人体注射用药 2 以非融合蛋白的形式表达药物基因 易被蛋白酶破坏 N端有甲硫氨酸 易引起免疫反应 OP P SD ATG St gene StopC 3 分泌型表达蛋白药物基因 外源基因融合到原核蛋白信号肽序列的下游 三 酵母中的基因表达1 载体酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制 并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNA A Yep类 Yeastepisomalplasmid B YRp类 Yeastreplicationplasmid C YCp类 yeastcentromericplasmid 复制序列为ARS 并含有酵母染色体中心粒 端粒成分 稳定性好 但拷贝数只有一个 转化频率103 104 gDNA D YIp yeastintegrativeplasmid 含有可与酵母染色体重组的序列 可以完全整合到染色体中 因此它依靠酵母染色体进行复制 具有很好的稳定性 拷贝数只一个 转化频率1 100 gDNA 2 克隆载体向酵母载体中引入大肠杆菌质粒pBR322的ori部分和Ampr或Tetr部分 这样构成的载体同时带有细菌和酵母的复制原点和选择标记 3 表达载体将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入载体的适当位点后 就构成了酵母菌的表达载体 分普通表达载体和精确表达载体 2 影响目的基因在酵母菌中表达的因素 1 外源基因的拷贝数 高度稳定 高拷贝 高表达 2 外源基因的表达效率 启动子 3 外源蛋白的糖基化 酵母分泌的异源蛋白糖基化产物与天然产物完全相同 4 宿主菌珠的影响 菌体生长力强 菌体内源蛋白酶要弱 菌株性能稳定 分泌能力强 四 动物细胞中的基因表达外源基因的表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中 培养液成分完全由人工控制 从而使产物纯化变得容易 基因产物是糖基化的 接近或类似于天然产物 但动物细胞生长慢 单位体积的生产率低 培养条件苛刻 费用高 目前用于表达外源基因的细胞均为传代细胞 三类主要基因工程表达体系的比较表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性浅在危险大肠杆菌多肽 蛋白菌体内容易一般对原核好不大融合蛋白部分可高产酵母多肽 蛋白菌体内容易菌体内真核接近不大糖基化蛋白分泌出细胞可高产复杂天然动物细胞完整分泌出细胞较难简单几乎可为可能有糖基化蛋白成本高天然产物致癌因可高产素 第三节基因工程菌的稳定性 stability 一 质粒不稳定产生的原因分裂不稳定 指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象 常见 结构不稳定 指外源基因从质粒上丢失或碱基重排 缺失所致工程菌性能的改变 工程菌的质粒不稳定因素 一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率 二是这两种菌的比生长速率差异的大小 对同一工程菌 通过控制不同的比生长速率可以改变质粒的拷贝数 含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较大 增加质粒拷贝数能提高质粒的稳定性 含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低 但是大量外源质粒的存在使含质粒菌的工程菌的比生长速率明显低于不含质粒菌 而不含质粒菌一旦产生 能较快地取代含质粒菌而成为优势菌 对质粒的稳定性不利 质粒稳定性的分析方法 样品稀释 涂板 10 12h 挑选100个菌落 接种抗性标记的平版 10 12h 统计菌落数 计算 二 提高质粒稳定性的方法1 两阶段培养法 第一阶段使菌体生长至一定密度 第二阶段诱导外源基因的表达 在培养基中加入选择性压力如抗生素等 以抑制质粒丢失菌的生长 2 通过控制环境参数 温度 PH 培养基组分和溶解氧浓度 调节比生长速率 使工程菌生长具有优势 有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢 因而间歇改变培养条件以改变这两种菌的比生长速率 可以改善质粒的稳定性 第四节基因工程菌的发酵工程菌的培养过程 摇瓶操作 温度 pH 培养基组分 碳氮比 培养罐操作 确定培养参数 控制方案 顺序 一 基因工程菌的培养方式1 补料分批培养 将种子接入发酵反应器中进行培养 经过一段时间后 间歇或连续地补加新鲜培养基 使菌体进一步生长的方法 通常把溶氧控制与流加补料结合起来进行 2 连续培养 将种子接入发酵反应器中 搅拌培养至一定菌体浓度后 开动进料和出料的蠕动泵 以控制一定稀释率进行不间断的培养 3 透析培养 利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离 通过去处培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响 4 固定化培养 将固定化技术用于工程菌的培养 质粒稳定性大大提高 特别是对分泌型菌种 二 基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵工艺传统微生物发酵工艺材料带外源基因重组载体的微生物不含外源基因的微生物目的使外源基因高效表达 尽量减少自身基因表达所产生的宿主本身蛋白的污染初级或次极代谢产物1 培养基的影响使用不同的碳源对菌体的生长和外源基因的表达有较大的影响 如以甘油为碳源 菌体得率较大 而以葡萄糖为碳源菌体产生的副产物较多 葡萄糖对lac启动子有阻遏作用 采用流加措施 控制培养液中葡萄糖的较低浓度 可减弱或消除葡萄糖的阻遏作用 还有无机磷对产物的影响也较大 碳源 葡萄糖 甘油 乳糖 甘露糖 果糖等 氮源 酵母提取物 蛋白胨 酪蛋白水解物 玉米浆和氨水 硫酸铵 硝酸铵 氯化铵等 其他 无机盐 微量元素维生素 生物素等 2 接种量的影响接种量是指移入的种子液体积和培养液体积的比例 它的大小影响发酵的产量和发酵周期 接种量小 延长菌体延迟期 不利于外源基因的表达 采用大接种量 由于种子液中含有大量水解酶 有利于对基质的利用 但接种量过大往往会使菌体生长过快 代谢产物积累过多 反而会抑制后期菌体的生长 3 温度的影响温度对基因表达的调控作用可发生在复制 转录 翻译或小分子的合成水平上 4 溶解氧的影响溶解氧是发酵培养中影响菌体代谢的一个重要参数 对菌体的生长和产物的生成影响很大 维持较高水平的DO2值 40 有利于重组质粒细胞的生长及外源蛋白产物的形成 5 诱导时机的影响一般在对数生长期或对数生长后期进行升温诱导表达 6 pH的影响如采用两段培养工艺 培养前期着重于优化工程菌的最佳生长条件 培养后期着重于优化外源蛋白的表达条件 细胞生长期的最佳pH范围在6 8 7 4 外源蛋白表达的最佳pH为6 0 6 5 总之 工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大 必须建立最佳化工艺 最佳化工艺是获得最快周期 最高产量 最好质量 最低消耗 最大安全性 最周全的废物处理效果 最佳速度与最低失败率等指标的保障 工艺最佳化需对不同的菌种做大量的实验 取得重复性好的准确数据后 模拟发酵代谢曲线 预测放大值 才能更合理的设计最佳工艺条件 三 基因工程菌的培养设备发酵罐组成 发酵罐体 搅拌器 温度控制系统 灭菌系统 空气过滤装置 残留气体处理装置 参数测量与控制系统 培养液配制及连续操作装置 第五节基因工程药物的分离纯化基因工程药物或生物技术产品特点 1 目的产物在初始原料中的含量较低 2 含目的产物的初始物料组成复杂 除了目的产物外 还有大量的细胞 代谢 残留培养基 无机盐等 特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大 3 目的产物的稳定性差 具有生物活性的物质对pH 温度 金属离子 有机溶剂 剪切力 表面张力等十分敏感 容易是其失活 变性 种类繁多 包括大 中 小分子 结构简单或复杂的有机化合物 以及结构复杂又性质各异的生物活性物质 应用面广 对其质量 纯度要求高 甚至要求无菌 无热源 一 建立分离纯化工艺的根据1 含目的产物的起始物料的特点利用基因工程菌进行发酵生产的产物 其上游过程中的各种因素均对分离纯化技术和工艺有直接影响 1 菌种类型及其代谢特性 包括菌种的生物学性质 产物和副产物种类 产物在细胞内所处的位置 表达方式 胞内 胞外 包含体 代谢物种类 产物类似物 毒素和能降解产物的酶类等 2 原材料和培养基的来源及其质量 3 生产工艺和条件 包括灭菌方式和条件 生产方式 连续 批式 半连续 生产周期 生产能力 工艺控制条件因素几方式等 4 初始物料的物理 化学和生物学特性 包括产物浓度 主要杂质种类和浓度 盐的种类和浓度 溶解度 pH 黏度 流体力学性质和热力学性质 2 物料中杂质的种类和性质物料中杂质的含量 性质 结构 相对分子质量 电荷性质及数量 生物学特性 稳定性 溶解度 分配系数 挥发性 吸附性能等 3 目的产物特性产物的化学 物理和生物学特性 包括化学组成 相对分子质量 等电点 电荷分布及密度 溶解度 稳定性 疏水性 扩散性 扩散系数 分配系数 吸附性能 生物学活性 亲和性 配基种类 表面活性等 4 产品质量的要求产品质量标准和用途对产品纯度 生物活性 比活的要求 包括允许的杂质种类和最大允许含量 特殊杂质的种类和最大允许量 以及杂质对使用的影响 产品剂型 贮存稳定性等 二 分离纯化的基本过程由于基因工程药物是从转化细胞 而不是从正常细胞生产的 所以对产品的纯度要求也要高于传统产品 基因工程药物的分离纯化一般不应超过4 5个步骤 包括细胞破碎 固液分离 浓缩与初步纯化 高度纯化直至得到纯品以及成品加工 基因工程药物分离纯化的一般流程 发酵液 细胞分离 胞内产物 胞外产物 细胞破碎 固液分离 包含体 细胞碎片分离 变性 复性 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品 三 分离纯化的技术分离纯化技术要求 1 技术条件要温和 能保持目的产物的生物活性 2 选择性要好 能从复杂的混合物中有效的地将目的产物分离出来 达到较高纯化倍数 3 收率要高 4 两个技术之间要能直接衔接 不需要对物料加以处理或调整 这样可减少工艺步骤 5 整个分离纯化过程要快 能够满足高生产率的要求 1 细胞破碎与固液分离 1 细胞收集 离心和膜过滤 2 细胞破碎 机械法 高压匀浆 超声波 高速珠磨 高压挤压等 非机械法 酶溶 化学渗透 热处理 渗透压冲击法 3 固液分离 分离细胞碎片是比较困难 一般用离心和膜过滤 2 目的产物的分离纯化分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术 色谱技术分为 Ionexchangechromatography IEC Reversedphasechromatography RPC Hydrophobicinteractionchromatography HIC Affinitychromatography AC 表4 1产物的主要特性及在分离纯化中的作用产物特性作用等电点决定离子交换的种类及条件相对分子质量选择不同孔径及分级分离范围的介质疏水性与疏水 反相介质结合的程度特殊反应性产物的氧化 还原及部分催化性能的抑制聚合性是否采用预防聚合 解聚及分离去除聚合体生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用的温度及流程时间微不均一性影响产物的回收 表4 2基因工程药物生产中常用的分离纯化方法 方法目的离心 过滤去除细胞 细胞碎片 颗粒性杂质阴离子交换层析去除杂志蛋白 脂质 DNA 病毒40nm微孔滤膜过滤进一步去除病毒阳离子交换层析去除牛血清蛋白或转铁蛋白等超滤去除沉淀物及病毒疏水层析去除残余的杂蛋白凝胶过滤与多聚体分离0 22 m微孔滤膜过滤除菌 四 分离纯化工艺应遵循的原则1 具有良好的稳定性和重复性 2 尽可能减少组成工艺的步骤 3 组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调 工艺和设备相适应 4 在工艺过程中尽可能少用试剂 以免增加分离纯化步骤 或干扰产品质量 5 分离纯化工艺所用的时间尽可能短 尤其是对稳定性差的产物 6 工艺和技术必须高效 收率高 易操作 对设备条件要求低 能耗低 7 具有较高的安全性 第六节基因工程药物的质量控制 一 原材料的质量控制确保编码药品的DNA序列的正确性 重组微生物来自单一克隆 所用质粒纯而稳定 以保证产品质量的安全性和一致性 1 明确目的基因的来源 克隆经过 并以限制性内切酶图谱和核苷酸序列等予以确证 2 提供表达载体的名称 结构 遗传特性及其各组成部分 如启动子 复制子 的来源与功能 构建中所用位点的酶切图谱 抗生素抗性标志物 3 提供宿主细胞的名称 来源 传代历史 检定结果及其生物学特性 4 阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态 如是否整合到染色体内及在其中的拷贝数 并证明宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性 5 提供插入基因与表达载体两侧端控制区的核苷酸序列 详细叙述在生产过程中 启动与控制克隆基因在宿主细胞中表达的方法及水平等 二 培养过程的质量控制在工程菌菌种贮存中 要求种子克隆纯而稳定 在培养过程中 要求工程菌所含的质粒稳定 始终无突变 在重复生产发酵中 工程菌表达稳定 始终能排除外源微生物污染 1 生产基因工程产品应有种子批系统 并证明种子批不含致癌因子 无细菌 病毒 真菌和支原体等污染 并由原始种子批建立生产用工作细胞库 2 原始种子批须确证克隆基因DNA序列 详细叙述种子批来源 方式 保存及预计使用期 保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性 3 对生产种子 应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料 并控制微生物污染 4 提供培养生产浓度与产量恒定性数据 依据宿主细胞 载体系统稳定性 确定最高允许传种代数 5 培养过程中 应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征 以宿主细胞 载体稳定性与产品恒定性 规定持续培养时间 并定期评价细胞系统和产品 6 培养周期结束时 应检测宿主宿主细胞载体系统的特性 如质粒拷贝数 宿主细胞中表达载体存留程