Urocortin通过L型钙通道抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖活力

UrocortinUrocortin 通过通过 L L 型钙通道抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖活力型钙通道抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖活力 罗惠媛罗惠媛 1 1 2 2 陶金 陶金 1 1 1 1 南京医科大学药理系 南京医科大学药理系 2 2 江苏省扬州环境资源职业技术学院医学系 江苏省扬州环境资源职业技术学院医学系 摘要摘要 目的目的 探索 Urocortin 对大鼠血管平滑肌细胞增殖活力抑制作用的机制 方法方法 分 离 培养大鼠血管平滑肌细胞 加入不同浓度的 UCN 以及药物培养 运用 MTT 法实验 观察 UCN 对血管平滑肌细胞增殖活力的抑制作用及相关机制 结果结果 UCN 能够浓度依赖性 地降低大鼠血管平滑肌细胞的活力 且 UCN 能抑制 Bay K8644 对细胞活力的增强作用 结 结 论论 UCN 通过阻断 L 型钙通道而浓度依赖性地抑制血管平滑肌细胞的增殖活力 关键词关键词 Urocortin 血管平滑肌细胞 VSMC L 型钙通道 MTT 法 INHIBITION OF UROCORTIN ON THE VIABILITY OF ADULT RAT VASCULAR SMOOTH MUSCLE CELLS VIA L TAPE CALCIUM CHANNELS LUO Hui yuan1 2 TAO Jin1 1 Department of Pharmacology Nanjing Medical University 2 Medical Department Yangzhou environment and resources vocational college Abstract Objective To investigate the mechanisms of urocortin UCN on the viability of adult rat vascular smooth muscle cells VSMC Methods Rat aortic VSMC were isolated from rats thoracic aorta VSMC treated with different concentrations of UCN and other drugs By using the MTT assay we investigated the effects of UCN on the viability of VSMC and the relative mechanisms Results UCN significantly inhibited the viability of VSMC and pre treatment of the cells with UCN could markedly reduce the effect of Bay K8644 which could increase the viability of VSMC Conclusion UCN reduces the viability of adult rat vascular smooth muscle cells via inhibiting L type calcium channels Key Words Urocortin vascular smooth muscle cells VSMC L type calcium channels MTT assay Urocortin UCN 是机体内分泌的一种 40 个氨基酸多肽 它属于促肾上腺皮质激素 CRF 类家族 与 CRF 在氨基酸序列上有 45 的同源性 起初发现于大鼠脑组织中 1 然 后在人体内也发现其存在 2 UCN 广泛分布于中枢神经系统 消化系统 心血管系统 生殖 系统 免疫和内分泌系统等 是具有生物活性的神经肽 可激活腺苷酸环化酶使细胞内的 cAMP 聚集 3 它与表达在心脏和血管上的 2 型 CRF 受体有高度亲和力 1 4 具有心血管保 护作用 在血管方面 UCN 能引导内皮依赖性和非内皮依赖性血管松驰作用 5 6 提示 UCN 可能直接影响血管平滑肌细胞 VSMC 的功能 近几年关于 UCN 与离子通道的关系也成为 研究的热点 有研究表明 在大鼠离体基底动脉中 UCN 介导的血管松驰作用与 K 通道开放 有关系 7 UCN 还能通过激活大鼠肺动脉的钡敏感性的钾通道起到舒张肺动脉的作用 8 最 近研究报道 UCN 能够通过 L 型 Ca2 通道降低钙内流 起心脏保护作用 9 一方面 VSMC 在血管重构 VR 中起重要作用 10 11 另一方面 血管松驰或重构与 Ca2 内流高度相关 12 13 众所周知 L 型钙通道是 VSMC 中主要钙通道类型 Ca2 内流主要通过 L 型钙通道 虽然 VSMC 在血管生理病理中非常重要 然而 关于 UCN 对 VMSC 的作用很少知道 本实 验室在以往实验中已发现 UCN 具有抑制血管平滑肌细胞增殖的作用 14 但缺乏对其作用与钙 离子通道的关系的研究 本实验旨在运用 法测定 UCN 对 VSMC 活性的影响并对其作用 与钙通道的关系进行研究 以进一步阐明 UCN 对血管重构的作用 本课题为江苏省卫生厅教育研究室科研项目 J 一 材料和方法一 材料和方法 1 1 动物和药品动物和药品 成年 Sprague Dawley SD 公鼠 重约 200 300g Urocortin Astressin Verapamil Glybenclamide Bay K8644 分别购自 Sigma 公司 胰 蛋白酶购自 AMRESCO 公司 小牛血清购自 HYCLONE 公司 DMEM 培养液购自 GIBCO 公司 2 2 试剂配制试剂配制 D HanK s 溶液成份 8g L NaCl 0 4g L KCl 0 06g L Na2HPO4 0 06g L KH2PO4 0 35 g L NaHCO3 pH 用 NaHCO3溶液调至 7 4 PBS 溶液组成 8g L NaCl 0 2g L KCl 2 85g L Na2HPO4 0 28g L KH2PO4 细胞培养液 13 4g L DMEM 细胞培养基 3 7g L NaHCO3 10 小牛血清 FBS 100U ml 青霉素 100ug ml 链霉素 pH 用 HCl 或 NaOH 调至 7 3 3 VSMC3 VSMC 分离 培养分离 培养 采用组织贴块法 于无菌状态下急性取大鼠胸主动脉 浸于 PBS 液中 谨慎去内皮 将 中层平滑肌剪成 2mm2大小 内膜面向下等距离粘于培养瓶壁 8 小时后加入含 10 小牛血清 的 DMEM 置于潮湿的 37 孵育箱内 95 空气和 5 CO2 培养 应用光镜 免疫组化法鉴定 血管平滑肌细胞 用 0 1 胰蛋白酶消化成细胞悬液 传代 继续培养 第 4 5 代细胞种于 96 孔培养板 用于实验 4 MTT4 MTT 法实验法实验 VSMC 接种在 96 孔平板上 每孔 200 l 沉淀后加入不同浓度的 UCN 10 10 10 5M 或 者 UCN 与其它药物 六孔为一组 六个对照组中加入培养液 继续培养 48 小时 然后每孔 加 MTT 液 20 l 继续培养 4 小时 吸出培养液 每孔加入 DMSO 溶液 150 l 轻摇十分钟 再在酶标仪上以波长 570nm 进行比色测定 OD 值 样本的吸光度 5 5 数据分析数据分析 实验数据以均值 标准误 Mean S E M 表示 采用 One way ANOVA 统计学处理 二 结果二 结果 1 UCN1 UCN 对对 VSMCVSMC 增殖活力的抑制作用增殖活力的抑制作用 如 Fig 1 所示 UCN 显著抑制 VSMC 的增殖活性 该抑制作用呈浓度依赖性 在 10 10 10 9 10 8M 时 UCN 不能明显影响细胞增殖活力 而当浓度上升至 10 7M 时 UCN 显著抑 制 VSMC 的活力 其吸光度下降率达 26 4 1 4 N 6 P 0 01 2 Astressin Glybenclamide Bay2 Astressin Glybenclamide Bay K8644K8644 和和 VerapumilVerapumil 对对 UCNUCN 抑制抑制 VSMCVSMC 活力作用的影活力作用的影 响响 如 Fig 2 3 4 所示 当 VSMC 先与 CRF 受体阻滞剂 Astressin 10 6M 作用 加入 UCN 10 7M 培养后 吸收率从 1 10 0 01 降至 0 80 0 02 n 6 P 0 05 能抑制 VSMC 的增殖活力 但与不加 Astressin 无明显差异 这表示 Astressin 不能影响 UCN 对 VSMC 的抑制作用 KATP通道阻滞剂 Glybenclamide 10 5M 单独作用于细胞不能影响 VSMC 的活力 同样它也不能影响 UCN 的抑制作用 而特殊的 L 型钙通道激动剂 BayK8644 10 6M 一方面能增加 VSMC 的活力 而且 UCN 能显著降低 BayK8644 对细胞活力 的增强作用 n 6 p 0 01 L 型钙通道阻滞剂 Verapamil 2 5 10 6M 能降低 VSMC 的 活力 然而 在 UCN 10 7M 的作用下 Verapamil 不能进一步降低细胞的活性 Fig Fig 1 1 0 20 40 60 80 10 10 10 9 10 8 10 7 10 6 10 5 UCN M Inhibition on the viability of VSMC of control Fig 1 Effect of UCN on the viability of VSMC Values were represented as mean S E M Data were analyzed with t test P 0 05 compared to control P 0 01 compared to control n 6 Fig Fig 2 2 Astressin UCN UCN Astressin 0 5 10 15 20 25 Inhibition on the viability of Control Fig 2 Effects of Astressin 10 5M on VSMC viability n 6 P0 05 vs UCN 10 7M Fig 3Fig 3 Gly UCN UCN Gly0 5 10 15 20 25 Inhibition on the viability of Control Fig 3 Effects of Gly 10 5M on VSMC viability in the absence and presence of UCN 10 7M n 6 P0 05 vs UCN 10 7M Fig 4Fig 4 Control UCN Bay BAY UCN Ver Ver UCN 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 1 2 1 4 1 6 1 8 Absorbance At 570 nm Fig 4 Effects of UCN 10 7M BayK8644 10 6M and verapemil 2 5 10 6M on VSMC viability n 6 P 0 01 vs control P 0 01 vs BayK8644 10 6M 三 讨论三 讨论 高血压病是目前世界上最常见 发病率最高的疾病 是冠心病和脑血管疾病的主要危险 因素 VR 的过程包括 VSMC 的内皮损伤 移行 增生 15 特别是增生被认为是 VR 的重要因 素 16 17 所以针对 VR 发生机制以逆转 VR 是防治高血压及其靶器官损害的关键 12 UCN 是一种由四十个氨基酸组成的多肽 属于 CRF 家族 它通过自分泌和旁分泌途径发 挥其广泛的生理 药理作用 18 19 UCN 对心血管系统和其它系统如子宫 淋巴细胞 大脑 的作用 已被普遍研究 它与表达在心脏和血管上的 2 型 CRF 受体有高度亲和力 1 4 有报 道 UCN 能剂量依赖性地提高心率 心输出量 冠脉血流 4 20 在体外试管实验中 UCN 在 缺氧前和再供氧时均能保护新生大鼠的心脏细胞 同时在离体试验中 UCN 能减少缺血 再 灌注损伤的成年大鼠的心肌梗死面积 21 22 在血管方面 UCN 能介导内皮依赖性和非内皮 依赖性血管松驰作用 表明 UCN 与 VSMC 之间有一定关系 在以往的实验中 我们使用了 3H thymidine 渗入法实验证实了 UCN 对大鼠 VSMC 增殖 具有抑制作用 但在该实验中没有对其作用机理作充分研究 14 本实验运用 MTT 法进一步 观察了 UCN 对 VMSC 增殖活力的影响 并对其作用机理进行了探讨 MTT 全名四甲基偶氮唑 盐 细胞特别是增殖期活细胞可通过线粒体能量代谢中的琥铂酸脱氢酶的作用使淡黄色的 MTT 分解 形成蓝色结晶物沉淀在细胞中 形成量与细胞增殖状况成正比 二甲亚砜 DMSO 能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物 溶液颜色深浅与所含结晶物的量成正比 再在 酶标仪上以波长 570nm 进行比色测定 OD 值 样本的吸光度 有标准曲线显示 细胞数与 MTT 吸收率呈正相关 R 0 983 因此 MTT 法是一种通过测定细胞能量代谢水平来间接反 映细胞增殖情况的检测方法 可以用它来测定 VSMC 的活力 15 本实验结果显示 UCN 能够浓度依赖性抑制 VSMC 的增殖活力 这表明 UCN 可能是 VR 中 有益的血管活性因子 为进一步阐明其作用机理 本实验发现 KATP阻滞剂 GLY 不能影响 UCN 对 VSMC 的抑 制作用 CRF 阻滞剂 Astressin 也不能影响 UCN 的抑制作用 Ca2 通道激动剂 Bay K8644 能够增加 VSMC 的增殖活力 并且 UCN 能显著降低 Bay K8644 的这一作用 Bay K8644 10 6M 是电压门性钙通道激动剂 能够增强 Ca2 内流 从而增加 VSMC 的 增殖活力 细胞被 UCN 10 7M 作用后 能减少 Bay K8644 介导的钙内流 使 Bay K8644 的作 用受抑制 这一现象证明 UCN 可能通过电压门性钙通道抑制钙离子内流从而抑制细胞的增殖 活力 本实验室还用激光共聚焦扫描显微镜 CLSM 观察到不同浓度 UCN 10 7 10 5M 能够减 弱 Bay K8644 介导的细胞内 Ca2 荧光密度 数据待发表 L 型 Ca2 通道属电压依赖型钙通 道 经 L 型 Ca2 通道产生的内向钙电流是内钙释放触发的主要机制 所以 L 型 Ca2 通道的 激活对细胞内的钙浓度升高有着极其重要的意义 我们的结果显示 UCN 通过 Ca2 通道对 VSMC 起抑制作用 本实验结果提供了有力的证据 UCN 对 VSMC 的增殖抑制作用和 L 型钙通道有关 基于 VSMC 增殖是 VR 的重要机制 15 我们的数据进一步表明 UCN 这一内源性多肽可能与 VR 及 其他病理过程如钙超载作用有着密切的关系 参考文献 1 Donaldson CJ Sutton SW Perrin MH et al Cloning and characterization of human Urocortin Endocrinology 1996 137 2167 2170 2 Vaughan J Donaldson C Bittencourt J et al Urocortin a mammalian neuropeptide related to fish Urotensin 1 and to corticotrophin releasing factor Nature 1995 378 287 293 3 Lewis K Li C Perrin MH et al Identification of urocortin III an additional member of the corticotrophin releasing factor CRF family with high affinity for the CRF2 receptor Proc Natl Acad Sci USA 2001 98 7570 7575 4 Kimura Y Takahashi K Totsune K et al Expression of Urocortin and corticotrophin releasing factor receptor subtypes in the human heart Clin Endocrinol Metab 2002 87 340 346 5 Huang Y Chan FL Lan CN et al Urocortin induced endothelium dependent relaxation of rat coronary artery role of nitric oxide and K channels Br J pharmacol 2002 135 1467 1476 6 秦旭平 廖瑞芳 李元建 血管平滑肌细胞增殖及调控 CHIN J Arterioscler Vol 9 N 5 450 453 7 Reis FM Luisi S Florio P et al Corticotrophin releasing factor Urocortin and endothelin 1 stimulate activin A release from cultured human placental cells Placenta 2002 23 6 522 525 8 Chan YX Yao XQ Lau CW et al The relaxant effect of Urocortin in rat pulmonary arteries Regul Pept 2004 121 11 18 9 Tao J Xu H Yang C et al Effect of urocortin on L type calcium currents in adult rat ventricular myocytes Pharacol Res 2004 50 471 476 10 Schulman D Latchman DS Yellon DM Urocortin protects the heart from reperfusion injurt via upregulation of p42 p44 MAPK sigaling pathway Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002 283 H 1481 1488 11 Lawrence KM Chanalaris A Scarabelli T et al K ATP channel gene expression is induced by urocortin and mediates its cardioprotective effect Circulation 2002 106 1556 1562 12 李悦梅综述 杨永宗审校 高血压血管重构的研究进展 J 中国动脉硬化杂志 2003 年第 2 期 171 174 13 Lei S Richter R Bienert M et al Relaxing actions of corticotrophin releasing factor on rat resistance arteries Br J Pharmacol 1993 108 941 947 14 罗惠媛 周国栋 陶金等 3H thymidine 渗入法测定 Urocortin 对大鼠血管平滑肌细胞增殖的 影响 J 实用临床医药杂志 2006 年第 10 卷第 1 期 37 38 15 Lino K Sasano H Oki Y et al Urocotin expression in the human central nervous system Clin Endocrinol Oxf 1999 50 107 114 16 Clowes AW Reidy MA Clowes MM Kinetics of cellular proliferation after arterial injury