生物化学实验报告

1 / 16生物化学实验报告2016年生物化学实验 B姓 名：学 号：实验时间：实验分组：组内成员： 任课教师：实验报告XXXX 2016年 11月 17日摘要本实验通过从小牛肠中通过刮去，离心，析出等方式提取小牛肠碱性磷酸酶，再通过 SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量，利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量及测定酶的活性。1. 实验部分试剂与仪器1.试剂：正丁醇、丙酮。1 mol/L 醋酸，1 mol/L NaOH，硫酸铵。 平衡缓冲液： mol/L Tris-HCl，pH 。 底物缓冲液：1 mol/L 二乙醇胺-盐酸缓冲液。酶的底物溶液：用底物缓冲液配制 1510-3 mol/L 对硝基苯磷酸二钠溶液。 30% 丙烯酰胺置棕色瓶。分离胶缓冲液： mol/L Tris-HCl缓冲液，pH ，已加入 10% SDS。 浓缩胶缓冲液： mol/L Tris-HCl缓冲液，pH ，已加入 10% SDS。 10% 过硫酸铵。2 / 16TEMED。上样缓冲液：称 100 mg SDS、2 mg溴酚蓝、2 g甘油，加 mL巯基乙醇、2 mL /L pH Tris-HCl，加超纯水定容至 10 mL。染色液：配置含% 考马斯亮蓝 R250，40%甲醇和10%冰醋酸的染色液 500 mL，过滤后备用。脱色液：500 mL 10%甲醇和 10%冰醋酸的脱色液1000 mL。 电泳缓冲液。 2.仪器匀浆机、eppebdorf5 型冷冻离心机、GSY2 型恒温水浴、UV762 型紫外可见分光光度计。离心管，剪刀，载玻片，不锈钢盘，搪瓷盘，滤布，漏斗，分液漏斗，量筒，烧杯，移液抢，比色皿，DYY11 型电泳仪，24D 型电泳槽，制胶板，揺床，移液枪。小牛肠碱性磷酸酶提取方法1）取新鲜小牛肠，用剪刀剖开，用载玻片刮取小肠内粘膜，放到盘子一角。2）将小肠粘膜液集中倒入匀浆机中，加冰冷蒸馏水，高速匀浆，重复多次。 3）缓慢加入冰冷正丁醇高速匀浆重复多次。在 4，10000 rpm条件下离心。 4）用滤布过滤去除杂质，倒入分液漏斗中，静止分层，取下层水相，用 HAc溶液调 pH到。4，10000 rpm，离心。5）得到上清后放入离心管中，用 NaOH溶液调3 / 16pH至，称取硫酸铵加到离心管中溶解；再加冰冷丙酮，混匀，4静置 30 min以上。4，10000 rpm，离心。6）上清液中加入冰冷丙酮，4放置 30 min以上。4，10000 rpm，离心。 7）取沉淀溶于平衡缓冲液至全部溶解至冰箱保存待用。 8）底物处理：底物 37水浴 5 min。小牛肠碱性磷酸酶酶活检测方法1）将酶稀释 10倍。2）紫外分光光度计检测条件为 405 nm波长，测定时间 60 s，取值 2 s，记录范围。3）取 2个 2 mL比色皿，加入上述加热的底物缓冲液，校对归零。4）将稀释 10倍的酶液加到其中 1个比色皿中，用手堵住皿口。快速上下倒 2次，放回分光光度计中，测定酶动力学曲线聚丙烯凝胶制备1）装板：将垂直板型电泳的玻璃片洗净、晾干；放好胶条，用夹子夹好玻璃板，上面插上梳子，垂直放置在水平台面上备用。2）制备分离胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的分离胶。分离胶制备4 / 16试剂 用量 H2O30% 丙烯酰胺mol/L Tris-HCl缓冲液 pH 10% 过硫酸铵TEMED3）制备浓缩胶：在小烧杯中按下表配制所需浓度的浓缩胶。mL mL mL 100 L 10 L浓缩胶制备 试剂 H2O30% 丙烯酰胺mol/L Tris-HCl缓冲液 pH 10% 过硫酸铵TEMED4）蛋白样品处理：在 mL离心管中按 1：1 体积比例，加样品和上样缓冲液，100?C 加热使蛋白变性。5）浓缩胶完全聚合后，去掉夹子和胶条，拔去梳子，将凝胶玻璃板固定于电泳装置内槽上，加入电泳缓冲液，缓冲液高过玻璃板凹面。用量 mL mL mL 60 L 8 L考马斯亮蓝法测定蛋白质含量1）玻璃试管中加入考马斯亮蓝。2）在 mL离心管中，取酶液分别稀释5 / 1650、100、200 倍。3）各取 100 L 加入到 5 mL考马斯亮蓝试管中，混匀，反应 5 min以上。 4）紫外分光光度计检测条件：595 nm 波长。5）取 2个比色皿，加入考马斯亮蓝，分光光度计中校对归零。 6）将样品放入外侧比色皿中，读吸光值。7）根据蛋白浓度标准曲线，计算酶蛋白浓度。SDS-聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质相对分子量1）用移液枪依次在泳道加样。2）电泳：连接正、负极，待溴酚兰指示剂迁移至下沿处，停止电泳。3）剥胶染色：电泳结束后，取出凝胶玻璃板，用水冲洗，将剥离下来的凝胶用水漂洗，转入染色缸中，加染色液，置摇床染色。4）脱色：染色完毕，回收染色液，用水漂洗，加入脱色液，置摇床脱色，脱色至背景清晰。5）观察测定蛋白的迁移率及条带，对照标准样品，分析蛋白样品的分子量及纯度。 6）拍照电泳结果，用于完成实验报告。2. 结果与讨论小牛肠碱性磷酸酶酶活检测6 / 16根据酶动力计算公式：?A/min ? VR ? D比活力E405 ? VE ? C ? L根据上图，?A/min=/min； VR=； D=10；E405=/(mol*cm)； VE=； C=/ml. L=；所以比活力=*10U/mg；4SDS-聚丙烯凝胶电泳分析知，mark 中出现了三条蛋白质标记线，根据其间距及参考文献中给出的 mark泳道各条蛋白质标记线间距，可判定由上到下 mark泳道中的三条蛋白质标记线分别是兔磷酸化酶 B，牛血清白蛋白，兔肌动蛋白。样品蛋白质标记线与牛血清白蛋白迁移率相近，所以样品的分子量与牛血清白蛋白分子量相近，所以样品的分子量大致为66,200/mol.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量根据考马斯亮蓝常量法测蛋白质标准曲线，其方程为：y=； 蛋白质稀释 50倍的情况下测得吸光值为，7 / 16根据方程，稀释 50倍时蛋白质浓度 C=/ml，则原蛋白质浓度 C=/ml。小牛肠碱性磷酸酶的提纯及酶活测定一些问题的讨论1、测定底物浓度对酶反应速度的影响时，对酶反应的哪些条件要加以控制？本实验所取的条件是什么?答：要对反应温度，酶浓度进行控制，本实验中反应温度为 37，酶浓度为在原来酶浓度的基础上稀释 10倍。2、为什么实验中能以平均速度表示反应的瞬时速度?答：因为酶催化的反应速率与底物浓度有关，本实验中底物远远过量，所以可以以平均速度表示反应的瞬时速度。3、你认为实验中的关键步骤或值得注意的步骤是什么？答：最关键的地方在于提取酶的时候要在低温环境下，免得酶失活，另外，测定酶活力的时候底物预热后要立即进行反应，防止底物提前分解影响实验结果。4、本次实验的感受是什么？答：本实验要细心，每个步骤都要认真搞懂原理的情况下再操作，免得破坏酶的活性影响实验结果。SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量一些8 / 16问题的讨论1、用 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量时为什么要用巯基乙醇？答：保持蛋白质的二级结构。蛋白中如果有二硫键存在的话，会容易被氧化断开，有了巯基乙醇就可以免除这一隐患2、SDS 在该电泳方法中的作用是什么？答：在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，加入一定量的十二烷基硫酸钠，形成蛋白质-SDS 复合物，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间的天然的电荷差异，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。根据标准样品在该系统电泳中所作出的标准曲线，推算出被测蛋白样品分子量的近似值。3、分析自己实验的成败原因。答：本实验中我们组的 mark样品只有三条标记线，是分子量最多的三条，说明分子量小的蛋白质电泳进行得快，超出了凝胶的范围，所以没有在图像上有所体现。原因是电泳时间过长或电压过大造成的，因此应该适当减少电泳的时间或减少，免得分子量小的蛋白质“跑过头” 。9 / 16参考文献：1修志龙等.生物化学M.化学工业出版社.XX.2许文涛等.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速染脱色方法的比较研究.食品科学J. XX,增3孙士青等.考马斯亮蓝法快速测定乳品中蛋白质含量.山东科学J.(6)4栾雨时, 包永明.生物工程实验技术手册M.化学工业出版社.XX第二节 实验记录和实验报告的书写正确记录实验过程及书写实验报告，是训练学生进行正规实验训练的重要内容。实验是在理论指导下的科学实践，目的在于经过实践，掌握科学观察的基本方法和技能，培养学生的科学思维、分析判断和解决实际问题的能力。也是培养探求真知、尊重科学事实和真理的学风，以及培养科学态度的重要环节。为此，要求学生在实验前必须预习、理解从基本原理和实验基本操作步骤、注意事项，列出所需试剂和仪器，实验中组织安排好时间，严肃认真地执行操作，细致观察变化，如实作好记录、书写实验报告等。一、实验记录实验记录要整洁、字迹清楚。实验中观察到的现象、结果和数据，耍及时地10 / 16直接记在记录本。原始记录必须准确简练、详尽、清楚。记录时，应做到如实正确记录实验结果，不可夹杂主观因素。在实验条件下观察到的现象，也应如实仔细地记录下来。在定量实验中观测到的数据，如称量物的重量、滴定管的读数、光电比色计的光密度值等，都应设计一定的表格准确记录。并应根据仪器的精确度准确记录有效数字。要求对实验的每个结果都应正确无遗漏地做好记录。实验中使用仪器的类型、试剂的规格、化学反应式、分子量、浓度等，都应记录清楚。实践过程中，应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。完整的实验记录应包括日期、实验题目、目的、操作、结果。二、实验报告实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，写出实验报告。实验报告应包括实验名称、实验日期、目的要求、原理、试剂配制、仪器设备、操作方法；实验结果、讨论等项内容。书写实验报告时，目的和要求、原理以及操作方法部分应作简单扼要的叙述，但对实验条件和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分，应根据实验的要11 / 16求，把所得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如标准曲线图以及实验组与对照组实验结果的比较表等。还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分不是对结果的重述，而是对实验方法，实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。一般实验，要有结论，结论要简要扼要，说明本次实验所获得的结果。1. 实验报告的书写包括哪些内容？2. 玻璃仪器的清洗有哪些基本要求？3. 请分别叙述分光光度技术、层析技术、电泳技术原理、及实验注意事项4. 血液样品、尿液样品及组织样品制备的常用方法有哪些？实验八 血清乳酸含量的测定实验目的掌握血清乳酸含量测定的原理，了解血清乳酸测定的常用方法。实验原理乳酸脱氢酶在辅酶 I(NAD)存在下将乳酸氧化成丙酮酸，同时伴有 NAD转化成还原型辅酶 I，其反应式如下：12 / 16L乳酸NADLD 丙酮酸NADHH在 pH值为时，平衡偏向乳酸氧化为丙酮酸一方。加入肼或氨基脲与丙酮酸生成产物而使丙酮酸不断被除去，使反应进一步向右移动，从而驱动反应完成。通过分光光度法或荧光法测定 NADH的生成量来测得样本中乳酸得量。NADH吸光度的升高速率与样品中乳酸浓度成正比，故用连续监测法测定乳酸浓度。实验器材1. 分光光度计2. 试管3. 移液管4. 恒温水浴箱5. 注射器6. 离心机实验试剂1. TrisEDTA肼缓冲液 将三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸 4g溶解于 800ml水中，加水合肼 11ml，调 pH值到，再定容到 1000ml。4保存。2. /L辅酶 I 称辅酶，加塞保存于20。用前加 3ml水溶解。3. 乳酸脱氢酶 纯化的乳酸脱氢酶硫酸铵悬13 / 16液，比活力约为 550u/mg。4. 应用基质液 取缓冲液 27ml，辅酶 I液3ml，乳酸脱氢酶液 40ul混匀。4可稳定 24h.5. 20mmol/L乳酸储存标准液 称取乳酸锂192mg溶于 100ml水中，4可稳定 6个月。6. 乳酸应用标准液 分别取 20mmol/L乳酸储存液和，各用水在 10ml容量瓶中定容至 10ml，其浓度分别为 2和 5mmol/下可稳定 2个月。实验步骤1. 标本采集：为了避免血液乳酸在采血时发生变化，受试者应处于空腹休息状态，最好不用止血带以防止前臂缺氧而致乳酸含量增加。进针后不立即采血，等几分钟后再采血，然后放入预置有碘乙酸钠的标本管中，碘乙酸钠的最终浓度为。待凝固后分离血清。2. 取 10X100cm小试管 3只，分别写清测定管，标准管和空白管，然后按下表进行操作。表中所用试剂适合于自动化仪器操作，如用手工法而又无小比色皿可适当放大标本及试剂量。血清乳酸脱氢酶法测定乳酸操作表结果分析血清中乳酸量?As/minX 标准管乳酸浓度14 / 16安静状态下，健康人静脉血内乳酸含量为/L，动脉血乳酸水平低于静脉血。餐后比基础水平高2050。脑脊液乳酸水平预血乳酸水平无关，16 岁以下儿童得脑脊液乳酸水平为/L乳酸是糖酵解的最终产物，在生理条件下，大多数组织以有氧氧化为主，但少数组织如皮肤，视网膜，肾髓质和血细胞等组织在有氧时也能进行糖酵解，其中以皮肤的糖酵解速度最快。成熟的红细胞仅靠糖酵解获得能量。在病理情况下，如严重贫血、大量出血、呼吸障碍及心血管疾患等所引起的机体缺氧时，致使糖酵解过度，造成乳酸生成过多，导致机体产生乳酸酸中毒。运动时乳酸主要在骨骼肌中生成，然后透过细胞膜进入血液。在正常情况下，乳酸在生成和消除处于动态平衡中，血乳酸浓度为 1-2mmol/L，运动员血乳酸安静值与常人无差异，但是在赛前情绪紧张时，血乳酸浓度安静值有可能升高到3mmol/L左右，这与肾上腺分泌增多有关。运动时血乳酸浓度上升，上升