WB实验基本步骤

实验基本步骤实验基本步骤 提取细胞蛋白 BCA 定量 制备蛋白胶 SDS PAGE 胶 蛋白样品变性 电泳 转膜 封闭 一抗 TBST 洗涤 二抗 TBST 洗涤 显影 结果分析 试剂配制试剂配制 1 PBS 磷酸盐缓冲溶液 1L 磷酸二氢钾 0 24g 磷酸氢二钠 1 44g 氯化钠 8g 氯化钾 0 2g 加入 500ml 纯水 调 PH 7 2 定容至 1L 高压蒸汽灭菌 2 PBST PBS 0 05 吐温吐温 20 500mlPBS 0 25ml 吐温 20 3 电转液电转液 500ml Tris 1 5g 甘氨酸 7 2g 400ml 水溶解 加入 100ml 甲醇 置于 4 冰箱预冷 4 电泳液 电泳液 1X 10 x 稀释 50ml10 x 电泳液 450ml 纯水 5 TBS 6 TBST TBS 0 05 吐温吐温 20 50mlTBS 450ml 纯水 0 25ml 吐温 20 7 封闭液封闭液 TBST1X 5 奶粉 40ml 封闭液 40mlTBST 2g 奶粉 40 预热 WB 实验实验 一 蛋白样品制备一 蛋白样品制备 准备 一管细胞 PBS 4 预冷 PMSF 100mM 移液枪 1000ul 10ul 1 5mlEP 管 2 个 高速冷 冻离心机 4 预冷 1 于 20 冰箱中取出一管细胞样品 吸去培养液 2 加入 1ml 4 预冷的 PBS 0 01M pH7 2 7 3 用移液枪轻轻吹成悬浮液后 4 8000r 离心 5min 然后 弃去上清 重复以上操作一次 共洗细胞两次以洗去培养液 3 按 1ml 裂解液加 10 l PMSF 100 mM 摇匀置于冰上 PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合 4 在样品中加入 300ul 含 PMSF 的裂解液 吹匀 于冰上裂解 30 min 为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回 摇动 5 裂解完后 于 4 下 12000 rpm 离心 5 min 7 将离心后的上清分装转移倒 0 5 ml 的离心管中放于 20 保存 二 二 蛋白含量的测定 蛋白含量的测定 BCA 定量 定量 准备 96 孔板 移液枪 1000ul 10ul 200ul BCA 工作液 A B 50mlEP 管 1xPBS BSA 标准液 1 将 96 孔板分好区域 若不够分则只做两个重复 外围一圈的孔最好不用 2 算好孔数 总的 每孔加 200ulBCA 工作液 A B A 液 B 液 50 1 一般配多些 如 60 孔 A 液 12000ul B 液 240ul 3 将样品稀释到一定倍数才能定量 10 倍 20 倍 30 倍 每孔需要 20ul 样品 2ul 样品 18ulPBS 即稀 释 10 倍 做三个重复则需要 60ul 一般配 80ul 4 配蛋白标准样品 将 2mg ml 的蛋白标准溶液稀释至 0 5mg ml 若配 200ul 的 0 5mg ml 蛋白标准溶液则 需要 50ul 的 2mg ml 的蛋白标准溶液和 150ul PBS 溶液 5 将稀释好的样品加入孔板中 标记的区域 接着标准品按 0 1 2 4 8 12 16 20ul 加到标号的区域 之后 在加标准样品的孔内 将孔内溶液用 PBS 补足到 20ul 6 每孔加 200ul 配好的工作液 平行加 不能上下加 以减少误差 7 将加好的 96 孔板放在 37 下孵育 30 分钟 8 孵育完后 放在酶标仪轻微震荡 3 10s 中速 吸光值 595nm 进行比色测定 记录标准曲线及样品吸光值数据 后 以蛋白含量 ml 为横坐标 吸光值为纵坐标作标准曲线 R2 0 98 才有用 酶标仪操作 两个箭头图标 1 是结果 2 是保存 9 计算蛋白含量 注意定量样品已经稀释了 10 倍 蛋白质定量标准曲线加样量 序号序号 1 12 23 34 45 56 67 78 8 标准蛋白量标准蛋白量 ul ul 0 5mg ml0 5mg ml 01248121620 背景液 背景液 PBSPBS ul ul 2019181612840 三 三 SDS PAGE 电泳电泳 1 配胶 12 可以提前配好 准备 玻璃板 梳子 AP 解冻 现拿现用 聚丙烯酰胺 4 冰箱冷藏 1 玻璃板验漏 5min 2 按表配置分离胶 3 灌胶 加酒精封压 凝 30min 注意不要有气泡 4 按表配浓缩胶 倒掉酒精 用吸水纸吸去酒精 灌胶 插梳子 注意不要有气泡 凝 30min 5 取胶 用水冲洗一下浓缩胶 加少量水放入一次性手套中 4 冰箱保存备用 2 样品处理 准备 PBS 移液枪 1 5mlEP 管 1 稀释样品 一般每孔上样 5ul 即 1mg ml 浓度的样品 测完蛋白含量后 将样品用 PBS 稀释至 1mg ml 注意 loadingbuffer 的加入也得算入 2 取出上样样品 15ul 至 1 5 ml 离心管中 加入 6 SDS 上样缓冲液 3ul 至终浓度为 1 上样总体积 一般不超过 15 l 加样孔的最大限度可加 20 l 样品 3 将样品在 100 煮 5 min 震荡使蛋白完全变性 注意仪器操作 3 电泳 准备 电泳液 500ml 现配 蛋白胶 10ul 移液枪 枪头 样品 Marker 冰盒 电泳装置 1 将 SDS PAGE 胶放入电泳槽中 加足够的电泳液 短玻璃板面向内 长玻璃板面向外 若只跑一块 胶 那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外 电泳液至少要漫过内测的短玻璃板 注意先检漏 标准液浓度标准液浓度 mg mlmg ml 00 0250 050 10 20 30 40 5 2 上样 用移液枪贴壁吸取样品 将样品吸出不要吸进气泡 将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样 品 加样太快可使样品冲出加样孔 若有气泡也可能使样品溢出 加入下一个样品时 进样器需在外槽 电泳缓冲液中洗涤 3 次 以免交叉污染 3 先设置 80V 开始电泳 样品溴酚蓝跑至分离胶后增至 120V 电压 电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电 泳 进行转膜 此时准备好电转液 四 转膜四 转膜 准备 电转液 现配 4 冰箱冷藏 镊子 滤纸 PVDF 膜 0 45um 电转装置 冰盒 注意 拿滤纸和膜时一定要戴手套或用镊子 因为手上的蛋白会污染膜 1 在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子 两块海绵垫 2 滤纸浸入电转液中 PVDF 膜在甲醇中润湿成半透明 小心将膜放入 4 电转液中平衡至少 5min 3 将夹子打开使黑的一面保持水平 在上面垫一张海绵垫 用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡 一 手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动 在垫子上垫三层滤纸 可三张纸先叠在一起在垫于垫子上 一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡 4 先将玻璃板撬掉才可剥胶 撬的时候动作要轻 要在两个边上轻轻的反复撬 撬一会儿玻璃板便开始松 动 直到撬去玻板 撬时一定要小心 玻板很易裂 除去小玻璃板后 将浓缩胶轻轻刮去 浓缩胶影 响操作 要避免把分离胶刮破 小心剥下分离胶盖于滤纸上 做好标记 用手调整使其与滤纸对齐 轻轻用玻棒擀去气泡 将膜盖于胶上 要盖满整个胶 膜盖下后不可再移动 并除气泡 在膜上盖 3 张滤 纸并除去气泡 最后盖上另一个海绵垫 擀几下就可合起夹子 整个操作在转移液中进行 要不断的擀去 气泡 膜两边的滤纸不能相互接触 接触后会发生短路 转移液含甲醇 操作时要戴手套 实验室要开 门以使空气流通 5 将夹子放入转移槽中 电转移时会产热 浆槽放入冰中 要使夹的黑面对槽的黑面 夹的白面对槽的 红面 一般用 100mA 转移 90min 6 转完后将膜用 1 丽春红染液染 5 min 于脱色摇床上摇 然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜 上的蛋白 将膜晾干备用 准备封闭液 六 免疫反应六 免疫反应 准备 封闭液 一抗 二抗 TBST 1 将膜移至含有封闭液的平皿中 室温下脱色摇床上摇动封闭 2h 2 TBST 洗 4 次 每次 5 分钟 3 将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记 加入相对应的一抗 室温孵育 2h 或者 4 过夜 4 室温下孵育 1 2 h 后 用 TBST 在室温下脱色摇床上洗四次 每次 5min 5 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触 室温下孵育 1 2 h 后 用 TBST 在室温下脱色摇床上洗 4 次 每 次 5 min 七 显影七 显影 准备 样品胶片 移液枪 200ul 中枪头 吸水纸 显影液 A B 薄镊子 一抗二抗 目的蛋白 78kdBip 1 1000兔二抗 75kd 目的蛋白 34kd GAPDH