Fas-和FasL-在急性胰腺炎中的共表达及其与凋亡的关系[J]

FasFas 和和 FasLFasL 在急性胰腺炎中的共表达及其与凋亡在急性胰腺炎中的共表达及其与凋亡 的关系的关系 作者 李震东 1 马清涌1 徐军1 李明2 西安交 通大学 1第一医院肝胆外科 2医学院组胚教研室 陕西 西安 摘要 目的 探讨凋亡调控基因 Fas FasL 在大鼠急性胰腺炎中的表达及 其与腺泡细胞凋亡的关系 方法 通过胰胆管内逆行注射不同浓度的牛磺 胆酸钠 建立不同严重程度的急性胰腺炎模型 用 RT PCR 免疫组化法 检测胰腺组织 Fas FasL mRNA 及蛋白的表达 原位末端标记法检测各组 大鼠胰腺腺泡细胞凋亡 结果 在正常的胰腺腺泡细胞中即存在着 Fas FasL mRNA 及蛋白的表达 且呈现共区域化特点 凋亡细胞极少 在炎症程度较轻的胰腺组织 Fas 和 FasL mRNA 的表达水平显著提高 腺 泡细胞凋亡指数亦明显提高 随胰腺炎症程度的加重 Fas 和 FasL mRNA 的表达逐渐下降 腺泡细胞凋亡指数亦逐渐下降 结论 Fas FasL 系统 可能参与了正常胰腺组织的细胞更新和自稳 是介导急性胰腺炎时腺泡细 胞凋亡的一个重要途径 关键词 急性胰腺炎 细胞凋亡 Fas FasL 中图分类号 R657 5 文献标识码 A 文章编号 1673 4254 2006 01 0025 05 Colocalized expression of Fas and Fas Ligand in acute pancreatitis and its correlation with cell apoptosis LI Zhen dong1 MA Qing yong1 XU Jun1 LI Ming2 Department of Hepatobiliary Surgery First Hospital of Xi an Jiaotong University1 Department of Histoembryology Medical College2 Xi an Jiaotong University Xi an China Abstract Objective To study the expressions of Fas and Fas Ligand FasL genes in rats with acute pancreatitis AP and their relation to apoptosis of pancreatic acinar cells Methods Rat models of acute pancreatitis with varied severity were established by retrograde injection of sodium taurocholate at different concentrations via the apancreatobiliary duct The expressions of Fas and FasL mRNAs and proteins were detected by reverse transcription polymerase chain reaction RT PCR and immunohistochemistry The apoptosis of acinar cells was quantified by in situ nick ending labeling technique Results of expressions fas FasL mRNA and protein were colocalized in normal pancreatic acinar cells In pancreatic tissue with less severe inflammation the expressions of Fas and FasL mRNA increased significantly and the apoptosis index of the acinar cells was also elevated with the increase in the severity of the pancreatitis the expression of Fas and FasL mRNAs were gradually lowered and apoptosis index of the acinar cells was increased Conclusion Fas FasL system might be involved in the renewal and homeostasis of normal pancreatic tissue and constitute an important pathway mediating the apoptosis of pancreatic acinar cells in AP Key words acute pancreatitis apoptosis Fas FasL 收稿日期 2005 08 16 基金项目 国家自然科学基金 Supported by National Natural Science Foundation of China 作者简介 李震东 1969 男 外科主治医师 博士研究生 电话 029 E mail victor7922 通讯作者 马清涌 教授 博士生导师 电话 029 E mail qyma0 近年来在多种急性胰腺炎动物模型中的研究发现 胰腺腺泡细胞凋亡 程度与急性胰腺炎胰腺炎症的严重度呈负相关性 诱导凋亡可明显减轻急 性胰腺炎病情 1 Fas FasL 系统是许多疾病如肝炎和自身免疫性疾病等 的细胞凋亡介质 Fas CD95 是肿瘤坏死因子 TNF 受体家族 I 型跨膜蛋白 及 FasL 的受体 相对分子质量 45 000 FasL 是 TNF 家族 型跨膜蛋白 相对分子质量 40 000 Fas 与其配体 FasL 或 Fas 抗体结合可诱导 Fas 表 达细胞发生凋亡 但其在急性胰腺炎中的重要性尚未阐明 本文对此加以 探讨 1 材料和方法 1 1 药物与试剂 牛磺胆酸钠购自 Sigma 公司 使用前以生理盐水配制成不同质量浓度 的溶液 总 RNA 提取试剂盒 TRI 试剂 购自美国 MRC 公司 RNA 反转录试 剂盒及 PCR 试剂盒购自 Fermentas 公司 Fas FasL 多克隆抗体购自武汉 博士德生物制品有限公司 TUNEL 法细胞原位凋亡检测试剂盒购自德国 Roche 公司 1 2 实验动物分组与模型制备 将 40 只 SD 雄性大鼠 购自西安交通大学医学院实验动物中心 体质 量 250 300 g 随机分成 4 组 每组 10 只 经十二指肠壁潜行穿刺胆胰 管注射牛磺胆酸钠以诱导急性胰腺炎 AP 其中 A 组为假手术对照组 仅 行剖腹探查 牵引胰腺后关腹 B C D 组为 AP 模型组 分别给予 2 0 3 5 5 0 牛磺胆酸钠 0 1 ml 100 g 体质量 建立不同炎症程度 的 AP 模型 术后 6 h 处死大鼠 快速切取胰尾部组织液氮保存备 RNA 提 取 取病变较为一致的胰头部组织置 4 PBS 多聚甲醛中固定 4 m 连 续切片供 HE 染色及免疫组化研究 1 3 胰腺组织病理损害评分 常规制作胰腺病理 HE 切片 镜下比较胰腺病理组织学改变 采用 Schmidt 2 的胰腺组织学改变评分系统 由专人盲法在光镜下按照水肿 腺泡细胞坏死 出血和脂肪坏死 炎症和血管周围浸润程度不同分 0 4 分 评分 1 4 RT PCR 法检测胰腺组织 Fas FasL mRNA 的表达 用 TRI 试剂提取胰腺组织总 RNA 将 5 g 总 RNA 反转录后行 PCR PCR 扩增体系 25 l 其中含 2 PCR master mix 12 5 l 上 下游引物各 0 75 l cDNA 模板 逆转录产物 1 l 以 PTC 200 型 MJ 公司 美国 PCR 仪作热循环 预变性 94 3 min 循环 94 45 s 60 45 s 72 45 s 共 35 循环 循环结束后 72 10 min Fas FasL 及内参 GAPDH 引物由大连宝生物工程公司合成 引物序 列如下 Fas 上游 5 GATATGCTGTGGATCAT GGC 3 下游 5 AACTTTTCGTTCACCAG 3 201 bp 下同 FasL 上游 5 ATGGAACTG CTTTGATCTCTGG 3 下游 5 AGATTCCTCAAAA TTGATCAGAG 3 320 bp GAPDH 上游 5 CATAG ACAAGATGGTGAAGG3 下游 5 TCCACAGTCTT CTGAGTGGC 3 570 bp 取 PCR 产物各 5 l 在 1 0 琼脂糖凝胶中电泳 150 V 恒压电泳 0 5 h 应用 Gel Doc2000 型全自动凝胶成像分析仪 Boi Rad 公司 美国 照相并测定每条带的光密度值 以 GAPDH 的表达量 为内对照计算并比较各组样本 Fas FasL 的相对表达量 1 5 胰腺组织 Fas FasL 免疫组化检测 兔抗大鼠 Fas FasL 多克隆抗体 工作浓度均为 1 200 免疫组化 操作过程按试剂盒说明书进行 DAB 显色 苏木素复染 中性树胶封片 光镜观察 1 6 胰腺组织凋亡检测 采用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记法 TUNEL 操作严格按照说明书进行 以双蒸水代替 TDT 作阴性对照 DNAase 处理 的切片作阳性对照 根据染色结果于每张切片中选取 10 个高倍视野 400 计数 1000 个胰腺腺泡细胞中的阳性细胞数 计算凋亡指数 即 每 100 个细胞中 TUNEL 阳性细胞所占的百分比 1 7 统计方法 数据以 s 表示 以 SPSS10 0 软件包进行统计 采用单因素方差 分析计算各组间差异 检验水准 0 05 为差异有显著性 2 结果 2 1 光镜下胰腺组织学改变及病理评分 对照组胰腺在光镜下无异常或仅有轻度水肿 在造模后的 B 组 可见 大鼠胰腺间质水肿 小叶和腺泡间隙增宽 伴多量中性粒细胞及少量淋巴 细胞浸润 胰腺实质内可见点片状出血和坏死 在牛磺胆酸钠浓度逐渐增 大的 C D 两组 上述表现更加明显 伴小叶结构破坏 细胞轮廊不清 胰腺坏死周围小血管扩张 红细胞淤积并微血栓形成 表 1 2 2 Fas 和 FasLmRNA 在正常胰腺及 AP 胰腺组织中的表达 RT PCR 结果显示 正常胰腺组织即有 Fas 和 FasL mRNA 的转录表达 在 AP 炎症程度较轻的 B 组 Fas 和 FasL mRNA 的转录水平显著增高 在 AP 模型 C D 两组 随胰腺组织炎症程度的加重 Fas 和 FasL mRNA 的表 达水平逐渐下降 且 Fas 表达水平在各个组间的变化趋势与 FasL 的变化 趋势相一致 图 1 2 图 1 Fas mRNA A 和 FasL mRNA B 在正常和 AP 胰腺组织中 的 RT PCR 凝胶电泳图 Fig 1 Fas mRNA A and Fas Ligand mRNA B expression detected by RT PCR in normal and acute inflammatory pancreas Lanes 1 4 Fas 201bp and FasL 320 bp Lanes 5 8 GAPDH 570 bp Lanes 1 5 Group A Lanes 2 6 Group B Lanes 3 7 Group C Lanes 4 8 Group D 图 2 Fas mRNA A 和 FasL mRNA B 在正常和 AP 各胰腺组织 中的 RT PCR 半定量分析 Fig 2 Changes of Fas mRNA A and Fas Ligand mRNA B expression analyzed by semiquantitative RT PCR in the pancreas of normal and acute inflammatory rats aP 0 05 vs control group bP 0 05 compared within AP groups A B C D Groups A B C and D respectively 2 3 胰腺组织 Fas FasL 蛋白表达定位 在正常胰腺组织中 Fas 和 FasL 呈弱阳性表达 胞质染成棕黄色 FasL 也有少量胞膜着色 见于几乎所有的腺泡细胞 连续切片分析显示 Fas 和 FasL 共同表达于腺泡细胞质内 在 AP 模型 B 组 Fas 和 FasL 表达 明显增强 以炎症浸润区和腺泡细胞坏死区最为显著 随胰腺炎症程度的 加重 Fas FasL 的表达逐渐减弱 另外 Fas 和 FasL 也表达于正常的胰 岛细胞 血管内皮细胞 而胰腺导管上皮细胞 胰腺炎时浸润的中性粒细 胞内均不表达 图 3 图 3 连续切片免疫组化检测正常及不同炎症程度胰腺组织 Fas FasL 蛋白表达定位 Fig 3 Immunohistochemistry of serial sections of normal and inflammatory rat pancreas showing the expressions of Fas and FasL proteins Original magnification 200 A B C D Groups A B C and D respectively 2 4 TUNEL 法检测各组胰腺细胞凋亡情况比较 细胞凋亡阳性结果表现为胞核染成棕褐色 胞核固缩 空泡化 染色 质浓缩 边聚 凋亡小体形成 结果可见正常组胰腺腺泡细胞凋亡极少 图 4A 建立 AP 模型后 B 组胰腺炎程度较轻 凋亡细胞多见 图 4B C 组病理改变较 B 组加重 凋亡细胞较多见 图 4C D 组为重度出血坏死 性胰腺炎 凋亡细胞少见 图 4D 经统计学处理各组胰腺细胞凋亡指数 各 AP 模型组与对照组凋亡指数相比 P 0 01 各 AP 模型组间比较 P 0 01 差异显著 图 4 TUNEL 原位末端标记法检测各组大鼠胰腺细胞凋亡 Fig 4 In situ detection of apoptosis by terminal transferase mediated nick end labeling TUNEL showing brown and shrunk nuclei of the apoptotic cells with vacuolization chromatin condensation and formation of apoptotic bodies Original magnification 400 A B C D Groups A B C and D respectively 3 讨论 Fas FasL 系统是细胞凋亡最主要的途径之一 Fas 单抗诱导肿瘤细胞 凋亡已被大量实验证实 3 FasL 和 Fas 结合后 首先使 Fas 形成能传递 信号的活性三聚体 并将凋亡信号向胞内传递 激活一系列被称为 Caspase 的半胱氨酸蛋白酶 完成细胞凋亡过程 有研究发现 4 5 Fas FasL 凋亡通道介导了急性胰腺炎腺泡细胞 凋亡 Fas 基因缺失可明显加重蛙皮素诱导的鼠急性胰腺炎病情 提示 Fas 凋亡通路在急性胰腺炎中扮演着重要的角色 我们的研究发现 在正 常的胰腺腺泡细胞中即存在着 Fas 和 FasLmRNA 及蛋白的表达 且呈现共 区域化特点 这同 Kornmann 等 6 的研究结果是一致的 Fas FasL 的共 区域化表达同样存在于胸腺 食管上皮 7 8 等组织中 提示正常组织的 生理性细胞更新可能受 Fas FasL 系统自分泌或旁分泌凋亡通路的调节 越来越多的证据表明 Fas 与 FasL 的相互作用有助于组织自稳 如阴道上 皮 肝脏和睾丸 8 虽然 Fas 与 FasL 的共表达可能介导胰腺细胞凋亡 但 Natoli 等 9 研究发现 Fas FasL 系统的表达并不必然引起表达细胞的 凋亡 Fas FasL 凋亡通道的启动尚需要协同刺激信号的存在 另外 凋 亡是一个由多因素控制的精细过程 多种凋亡通路共同存在 保证了表达 组织的自稳和对外来刺激的适度反应 在本研究中 我们通过经胰胆管逆行注射不同浓度的牛磺胆酸钠建立 炎症程度不一的 AP 模型 用 TUNEL 法检测各组胰腺腺泡细胞凋亡率的变 化 利用 RT PCR 技术进一步检测了凋亡调控基因 Fas 和 FasL mRNA 的表 达 我们发现 正常胰腺组织腺泡细胞凋亡率很低 建立 AP 模型后 在 炎症程度较轻的 B 组 腺泡细胞凋亡率明显升高 Fas 和 FasL mRNA 的表 达水平亦随之显著升高 随胰腺炎症程度的加重 腺泡细胞凋亡率逐渐下 降 Fas 和 FasL mRNA 的表达亦逐渐下降 这一结果再次证实在急性胰腺 炎过程中 腺泡细胞凋亡与急性胰腺炎的严重程度呈负相关关系 腺泡细 胞凋亡是对胰腺炎本身的一种保护性反应 胰腺腺泡细胞凋亡至少部分是 由 Fas FasL 系统介导而实现的 Fas FasL 系统是介导胰腺炎细胞凋亡的 重要途径之一 总之 我们的研究证实了 Fas 及 FasL 在正常胰腺细胞中呈共区域化 表达及其与腺泡细胞凋亡的关系 这一结果表明 Fas FasL 系统可能参 与了正常胰腺组织的自稳和细胞更新 Fas FasL 系统可能是急性胰腺炎 病程中介导凋亡的一个重要通路 通过 Fas FasL 系统诱导凋亡可以减轻 急性胰腺炎病情 有关 Fas FasL 通路调节凋亡的确切机制尚须进一步研 究 参考文献 1 Bhatia M Apoptosis of pancreatic acinar cells in acute pancreatitis is it good or bad J J Cell Mol Med 2004 8 3 402 409 2 Schmidt J Rattner DW Lewandrowski K et al A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy J Ann Surg 1992 215 44 56 3 Roskams T Libbrecht L van Damme B et al Fas and Fas ligand strong co expression in human hepatocytes surrounding hepato cellular carcinoma can cancer induce suicide in peritumoural cells J J Pathol 2000 191 2 150 53 4 Yasuda H Kataoka K Ichimura H et al Cytoki