南京农业大学考研生化试验

实验一 缓冲液配制和 pH 值测定 实验二 荧光光度法测定核黄素的含量 实验三 茚三酮比色法测定赖氨酸含量 实验四 考马斯亮蓝 G 250 比色法测定蛋白质含量 实验五 2 6 二氯酚靛酚滴定法测定 L 抗坏血酸的含量 实验六 间隔法测定过氧化物酶的活力 实验七 连续记录法测定过氧化氢酶的活力 实验八 纸电泳分离鉴定三种腺苷酸 综合性开放实验 一一 目的目的 了解配制缓冲液和 pH 计的基本原理 掌握配制缓冲液和使用 pH 计的基本方法 二二 原理原理 在一定的酸或碱作用下 能够自动调整和保持溶液 pH 值基本不变的溶液称为缓冲液 以 HAc 和 NaAc 组成的缓冲液为例 它的 pH 符合下面关系 pH p Ka lg HAc Ac 因此改变 HAc Ac 的比值 可以在一定范围内配制不同 pH 值的缓冲液 缓冲液的缓冲容量大小不仅与其总浓度有关 而且与 其组分比也有关 总浓度越大 缓冲容量越大 总浓度一定 其组分浓度比越接近 1 缓冲容量越大 缓冲液适当稀释或浓缩 其 pH 值基本保持不变 测定 pH 值的 pH 计 或称酸度计 一般是由一支对 H 敏感的玻璃电极和一支不随溶液中被测离子活度变化而改变其本身电位的甘汞电极以及一个测量 电位的电位计所组成 两支电极和测试溶液构成一个伏特电池 电极在不同的 pH 值溶液中产生不同的电位 它符合电化学理论中的 Nernst 方程 即 E E0 2 303RT F pH 测定中 首先测得已知 pH 的标准缓冲液中产生的电位 Es 然后 由测得未知 pH 缓冲液中产生的电位 Ex 通过公式 可直接算出该缓冲液的 pH pHx 为了方便 pH 计上装有一个定位调节器 当测量标准缓冲液 pH 时 利用它可把读数直 接 指示在标准的 pH 值上 这样在以后测未知 pH 的缓冲液时 该电位读数也就直接表示相应的 pH 值 在本实验使用的 Beckman 61 pH 计计中 以上过程 均由仪器自动完成 三三 实验试剂及设备实验试剂及设备 1 试剂 磷酸氢二钠 Na2HPO4 12H2O 磷酸二氢钠 NaH2PO4 2H2O 冰醋酸 醋酸钠 NaAc 3H2O 三羟甲基氨基甲烷 Tris 甘氨酸 盐酸 标准 pH 缓冲液 pH4 01 7 00 10 01 2 仪器 电子天平 感量 0 001g pH 计 3 器材 容 量 瓶 100mL 2 量 筒 50mL 1 移 液 管 10mL 1 烧 杯 100mL 1 200mL 2 漏斗 洗瓶 洗耳球 移液管架 玻棒 各 1 四四 操作步骤操作步骤 1 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠缓冲液配制 0 1mol L pH7 0 1 由附录 常用缓冲溶液的配制 表中通过计算 分别称取 Na2HPO4 12H2O g NaH2PO4 2H2O g 用蒸馏水溶解后 定容至 100mL 2 将配好的缓冲液倒入试剂瓶 贴上标签 保存备用 2 醋酸 醋酸钠缓冲液配制 0 1mol L pH5 4 1 0 1mol L 醋酸钠母液的配制 称取 NaAc 3H2O g 用蒸馏水溶解后 定容至 50 mL 2 0 1mol L 醋酸母液的配制 吸取冰醋酸 mL 用蒸馏水定容至 1000mL 3 取 0 1mol L 醋酸钠母液 43mL 0 1mol L 醋酸 7mL 于烧杯中混匀 用 pH 计测定 pH 值 使混合液的 pH 值最终达到 5 4 4 将配制好的缓冲液倒入试剂瓶 贴上标签 保存备用 3 Tris Gly HCl 缓冲液配制 0 025mol L pH8 3 1 称取三羟甲基氨基甲烷 Tris 0 300g 甘氨酸 1 44g 加入 80mL 蒸馏水 加热溶解 2 冷却后 用 pH 计测定 pH 值 并不断滴加 2 5mol L 盐酸 使 pH 值最终达到 8 3 3 用蒸馏水定容至 100mL 4 将配制好的缓冲液倒入试剂瓶 贴上标签 保存备用 五五 思考题思考题 1 配制缓冲液时 选取合适的缓冲试剂 主要根据什么原则 2 配制缓冲液 常用的方法有哪几种 一一 目的目的 了解荧光法测定核黄素的原理和方法 学习荧光光度计的操作和使用 二二 原理原理 核黄素 维生素 B2 是一种异咯嗪衍生物 它在中性或弱酸性的水溶液中为黄色并且有很强的荧光 这种荧光在强酸和强碱中易被破坏 核黄素可被亚硫酸盐等 还原成无色的二氢化物 同时会失去荧光 因而检测样品时要防止荧光的衰减 二氢化物在空气中易重新氧化 恢复其荧光 其反应如下 图 2 核黄素氧化还原机理图 核黄素的激发光波长范围约为 440 500nm 一般为 440nm 发射光波长范围约为 510 550nm 一般为 520nm 利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄 素的浓度成正比 可进行定量测定 根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别 注意 在所有的操作过程中 要避免核黄素受阳光直接照射 三三 实验材料及设备实验材料及设备 1 材料 核黄素药片 2 仪器 荧光光度计 天平 感量 0 0001g 3 器材 普通试管 25mL 10 容 量 瓶 100mL 2 棕色 移 液 管 10mL 1 5mL 1 1mL 1 烧 杯 50mL 2 250 mL 1 滤 纸 f11cm 滴 管 2 支 坐标纸 研钵 漏斗 洗瓶 洗耳球 试管架 移液管架 玻棒 各 1 四四 试剂的配制试剂的配制 核黄素标准液 5 g mL 准确称取核黄素 10mg 加 100mL 浓度为 1 71mol L 的醋酸和适量蒸馏水 置水浴中避光加热直至溶解 冷却至室温 用蒸馏水定容至 2000mL 转入棕色瓶中 五五 操作步骤操作步骤 1 样品液的制备 1 取样 取核黄素药片一粒 称重 g 转入研钵中磨成粉 2 定容 加 0 5mL 冰醋酸和适量蒸馏水溶解 用蒸馏水定容至 100mL 3 过滤 收集部分滤液于试管中 4 稀释 取滤液 2mL 于棕色容量瓶中 定容 100mL 待测 本实验由于样品溶解后所剩残渣很少 残渣所占体积对定容体积 100mL 造成的误差可以忽略不计 所以采用先定容 后过滤操作过程 这样可以节省时间 2 标准曲线制作及样品测定 取 9 支试管 按下表所示顺序操作 注意注意 在测定中如果待测样品溶液的荧光强度超出 100 则需要再行稀释 并记录稀释倍数或调节灵敏度 六六 结果处理结果处理 1 由 1 6 号管的数据 以核黄素含量 mg 为横坐标 F 值 F1 F2 为纵坐标 在坐标纸上绘制标准曲线 2 求样品管 F 的平均值 3 由从标准曲线中求样品管中核黄素的含量 g 4 计算你所取生物材料中核黄素的含量 单位用 g g 鲜重 七七 思考题思考题 为什么在核黄素的整个测定过程中 需要避光操作 附注附注 荧光光光度计使用说明 使用 930 型荧光光度计时 核黄素荧光测定的激发光波长为 440nm 发射光波为 520nm 因此可选用带通型 400nm 蓝字 滤色片为激发光滤色片 选用截止型 510nm 红字 滤色片为发射光滤色片 待仪器预热并调好零点后 用参比溶液调荧光光度计的荧光强度读数到满刻度 100 然后分别测定其它溶液的相对荧光强度 F 值 使用 F96 型荧光光度计时 需用 0 管的溶液调 F 0 00 再分别测定其它的中溶液的 F 值 一一 目的目的 了解赖氨酸总含量的测定方法 掌握用比色法测定谷物类样品中赖氨酸含量 二二 原理原理 蛋白质中的赖氨酸残基上具有一个游离的 e NH2 它与茚三酮起颜色反应呈蓝紫色 在波长 570nm 处其颜色的深浅在一定范围内与赖氨酸残基的含量成线性关系 亮氨酸与赖氨酸的碳原子数目相同 它仅有的一个氨基 a NH2 相当于蛋白质中赖氨酸残基上的 e NH2 因而可以用亮氨酸标准液制作标准曲线来测定蛋白质中 赖氨酸的含量 但计算浓度时必须乘上两种氨基酸的分子量之比 赖氨酸与亮氨酸分子量之比为 1 11 1 式中 W 样品质量 C 样品中游离氨基酸的量 各种作物种子中游离氨基酸的含量大约是 玉米 0 01 高粱 0 04 水稻 0 01 小麦 0 05 X 从标准曲线查得的赖氨酸的质量 三三 实验材料及设备实验材料及设备 1 材料 玉米粉 2 仪器 分光光度计 分析天平 恒温水浴 3 器材 刻度试管 25mL 11 移 液 管 1mL 1 2mL 2 20mL 1 烧 杯 250mL 2 50mL 1 滴 管 2 洗 耳 球 2 滤 纸 f11cm 研钵 漏斗 洗瓶 试管架 移液管架 玻棒 各 1 四四 试剂的配制试剂的配制 1 柠檬酸缓冲液 0 2mol L pH5 6 参见附录二 2 茚三酮试剂 称 3g 茚三酮溶于 100mL 95 乙醇中 溶解后加入 160mg 二氯化锡 搅拌溶解后加入 100mL 柠檬酸缓冲液中 搅匀备用 3 亮氨酸标准液 50mg mL 准确称取 5mg 亮氨酸 用蒸馏水稀释定容到 100mL 则得浓度为 50mg mL 的标准液 五五 操作步骤操作步骤 1 样品液的制备 1 取材 称取烘干 粉碎 过 80 目筛 的玉米粉 0 3g 油料种子须经脱脂处理 2 提取 将称取的样品放入试管 准确加入 20mL 蒸馏水 摇匀 读取样品悬液的总体积 mL 置于 80 恒温水浴中提取 20min 可间歇摇动 3 定容 冷却后 用蒸馏水将试管中悬液定容至 2 中悬液总体积刻度 mL 即最终样品液总定容体积仍为 20mL 摇匀 4 过滤 将提取液用滤纸过滤 收集滤液作为待测样 滤纸不能用蒸馏水湿润 2 标准曲线制作及样品测定 取 9 支刻度试管 按下表所示顺序操作 六六 结果处理结果处理 1 由 0 6 号管的数据 以亮氨酸含量 mg 为横坐标 A570 为纵坐标 在坐标纸上绘制标准曲线 2 求样品管 A570 的平均值 570 3 由 530 从标准曲线中求样品管中赖氨酸的含量 mg 4 计算你所取生物材料中赖氨酸的含量 单位用 mg mg 样重 七七 思考题思考题 1 能否运用线性回归方程的方法 计算样品中赖氨酸的百分含量 2 运用本实验方法测定含油份高的作物种子时 为什么对样品要进行脱脂处理 3 分析本实验中可能引入误差的几个关键环节 一一 目的目的 学习和掌握考马斯亮蓝 G 250 法测定蛋白质含量的原理和方法 二二 原理原理 考马斯亮蓝 G 250 法测定蛋白质含量属于一种染料结合法 考马斯亮蓝 G 250 是一种蛋白染料 其结构如下图 它在游离状态下最大吸收波长为 464nm 由于它所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力 通过疏水作用与蛋白质相结合 当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质 染料复合物 其最大吸收波长变 为 595nm 这种结合在 2 分钟左右达到平衡 生成的复合物在 1 小时内保持稳定 在一定的蛋白质浓度范围内 蛋白质 染料复合物在 595nm 处的光吸收与蛋白质含量成正比 所以可用于蛋白质含量的测定 该方法非常灵敏 蛋白质最低检测量 为 5mg 而且此法操作简便 快速 干扰物质少 是实验室常用的蛋白质定量方法 但染料易吸附在比色杯上而造成误差 每次更换检测样液时 应及时用乙醇洗涤 比色皿 再用蒸馏水冲洗残留的乙醇 三三 实验材料及设备实验材料及设备 1 材料 包心菜 2 仪器 分光光度计 离心机 电子天平 3 器材 刻度试管 25mL 9 刻度试管 10mL 1 移 液 管 1mL 3 20mL 1 烧 杯 250mL 2 50mL 1 离 心 管 10mL 1 滴 管 2 洗 耳 球 2 坐 标 纸 研钵 洗瓶 试管架 移液管架 玻棒 各 1 四四 试剂的配制试剂的配制 1 牛血清白蛋白 BSA 标准液 100mg mL 精确称取 10mg 牛血清白蛋白 用蒸馏水溶解后定容至 100mL 2 考马斯亮蓝 G 250 染色液 取 0 10g 考马斯亮蓝 G 250 溶于 50mL 95 的乙醇中 加入 100mL 85 的正磷酸 再用蒸馏水定容到 1000mL 过滤待用 该试剂于常温下可保存 1 个月 五五 操作步骤操作步骤 1 样品液的制备 1 取材 称包心菜叶片 1 0g 左右 准确记录其质量 g 2 研磨 将样品置于研钵中 研磨成匀浆后 准确加 20mL 蒸馏水 3 提取 将上述匀浆液在研钵内浸提 10 分钟 不断搅拌 使蛋白质充分溶解在水中 注意 已定容 所以在没搅匀之前不能损失样液 4 离心 将部分浸提液转移到 10mL 离心管里 以 10000 转 分钟离心 10 分钟 5 分离 将上清液倒入至干净的小试管里 备用 对于含水量比较多的样品 在计算定容体积时 还应考虑到样品本身的水份 因此 另取 1g 左右的包心 菜叶片 准确称重 g 在微波炉里高温失水 冷却后准确称重 g 计算包心菜叶片的含水量 然后再计算出所称样品中含有 g mL 水 加上 20mL 水的 体积 就是本实验样品的准确定容体积 2 标准曲线制作及样品测定 取 9 支试管 按下表所示顺序操作 六六 结果处理结果处理 1 由 0 5 号管的数据 以蛋白质含量 mg 为横坐标 A595 为纵坐标 在坐标纸上绘制标准曲线 2 求样品管 A595 的平均值 A595 3 由平均值 A595 从标准曲线中求样品管中蛋白质的含量 mg 4 计算你所取生物材料中蛋白质的含量 单位用 mg g 鲜重 七七 思考题思考题 1 用本实验方法所得的测定值与样品的实际值之间若有误差 主要是由什么原因引起的 2 常见的测定蛋白质的方法还有哪些 比较几种测定蛋白质常用方法的优缺点 一一 目的目的 掌握滴定法测定 Vc 含量的基本原理和操作 二二 原理原理 L 抗坏血酸 Vc 中的 C C 基具有还原性 还原型 L 抗坏血酸能与氧化剂染料 2 6 二氯酚靛酚作用 染料本身被还原成无色的衍生物 同时还原态的 L 抗坏血 酸被氧化成无色的脱氢 L 抗坏血酸 一定量的样品提取液还原标准染料的量与样品中所含 Vc 的量成正比 染料 2 6 二氯酚靛酚在中性或碱性溶液中呈蓝色 在酸性溶液中呈粉红色 用 2 6 二氯酚靛酚滴定样品 在达到终点之前 滴下的 2 6 二氯酚靛酚立即被还原成无色 当溶液中的 L 抗坏血酸被消耗完时 滴下的过量的 2 6 二氯酚靛酚在 酸性体系里呈现粉红色 所以当溶液从无色转变成微红色时 即为滴定终点 三三 实验材料及设备实验材料及设备 1 材料 新鲜蔬菜 2 仪器 电子天平 3 器材 滴 定 管 25mL 1 移 液 管 10mL 2 20mL 1 容 量 瓶 100mL 1 量 筒 50mL 1 锥 形 瓶 100mL 4 研 钵 1 套 烧 杯 250mL 2 50mL 1 洗 瓶 1 个 纱 布 20cm 20cm 1 块 四四 试剂的配制试剂的配制 1 草酸溶液 2 每组配制 250mL 2 2 6 二氯酚靛酚溶液 分别称取 2 6 二氯酚靛酚 300mg 碳酸钠 300mg 用热蒸馏水 200mL 溶解并定容至 3000mL 过滤除去难溶颗粒 置于棕色瓶中 贮于冰箱中备用 有效期 一周 使用前需标定 见附注 五五 操作步骤操作步骤 1 样品液的制备 1 取材 称取新鲜黄瓜 10g 左右 准确记录称样量 g 再称量 2 5g 草酸 与样品一起用纱布包裹住 2 研磨 样品包置研钵中 加 15mL2 草酸 用研棒挤压样包 将样品充分磨细 将汁液转移到 100mL 容量瓶中 残渣再加 15mL2 草酸 继续研磨 汁液再 合并到上述容量瓶中 如此反复研磨 2 3 次 合并汁液 3 定容 最后用 2 草酸定容至 V 100mL 摇匀备用 2 样品的测定 吸取汁液 20mL 放入 100mL 锥形瓶中 立即用 2 6 二氯酚靛酚溶液滴定至出现粉红色在 15 秒内不消失为止 记录所用滴定液体积 平行操作三次得 V1 mL V2 mL V3 mL 取平均值 V mL 3 空白测定 取 2 的草酸液 20mL 放入另一 100mL 锥形瓶内 用 2 6 二氯酚靛酚滴定至终点 记录染料用量 V0 六六 结果处理结果处理 计算你所取生物材料中 Vc 的含量 单位用 mg 100g 鲜重 七七 附注附注 2 6 二氯酚靛酚钠溶液的标定 准确称取 Vc 20mg 用 2 草酸溶解定容至 1000mL 吸取稀释液 20mL 放入 100mL 锥形瓶中 立即用所要标定的 2 6 二氯酚靛酚滴定至粉红色出现 15 秒不消失为止 记录所用毫升数 按下式计算 K 值 即 1mL 染料所能氧化抗坏血酸的毫克数 式中 G 称取 Vc 的毫克数 V 滴定 20mL 标准 Vc 时所用染料液的毫升数与滴定空白所用毫升数之差值 1 操作要尽可能快 并防止与铁铜器具接触 以减少维生素 C 的氧化 2 草酸及样品的提取液避免日光直射 3 当样液本身带色时 测定前于提取液中加 2 3mL 二氯乙烷 在滴定过程中当二氯乙烷由无色变为粉红色时 即达终点 八八 思考题思考题 用滴定法测定生物材料中 Vc 的含量有什么优缺特点 一一 目的目的 掌握间隔法测定过氧化物酶活力的原理及操作方法 二二 原理原理 过氧化物酶 peroxidase POD EC 1 11 1 7 是以铁卟啉为辅基的氧化酶 催化H2O2氧化某些酚类 芳香胺和抗坏血酸等还原性物质 它广泛分布于生 物界 在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用 如清除细胞内的有害物质H2O2 保护酶蛋白以及促进植物细胞木质素的形成等 本实验以愈创木酚 邻甲氧基苯酚 和H2O2为底物 过氧化物酶催化 H2O2 放出新生态氧 使无色的愈创木酚氧化成红棕色的四邻甲氧基连酚 反应式 如下 过氧化物酶活力的大小在一定范围内与产物颜色的深浅呈线性关系 该产物在 460nm 有最大的光吸收 故可通过测定A460的变化来测定过氧化物酶的活力 这里规定 一个过氧化物酶活力单位为在室温 pH5 4 的条件下 酶反应体系中每分钟A460的增加值为 1 所需的酶量 活力测定时 酶反应在分光光度计的比色杯内进行 由于酶反应产物增加而使 A460 增加 通过定时间隔记录可获得一组A460值 以时间为横坐标 A460 值为纵坐标进行线性作图 或用统计方法求得回归方程 进而计算 A460 的变化速率 DA460 min 1 最后计算每克鲜重样品中过氧化物酶活力的大小 三三 实验材料及设备实验材料及设备 1 材料 禾本科植物叶片 2 仪器 电子天平 高速冷冻离心机 分光光度计 冰浴 3 器材 刻度试管 10mL 1 移 液 管 5mL 1 微量进样器 200ml 1000ml 烧 杯 250mL 2 50mL 1 离 心 管 7mL 1 带盖 滴 管 2 洗 耳 球 2 硫 酸 纸 研钵 剪刀 洗瓶 试管架 移液管架 玻棒 各 1 四四 试剂的配制试剂的配制 1 酶提取缓冲液 50mmol L pH8 7 硼酸 硼砂缓冲液 内含 5mmol L 亚硫酸氢钠和 1 聚乙烯吡咯烷酮 PVP 临用前加 2 酶活力测定缓冲液 0 1mol L pH5 4 醋酸 醋酸钠缓冲液 3 愈创木酚溶液 0 25 W V 溶于 50 乙醇中 临用前配制 4 H2O2溶液 0 75 临用前配制 五五 操作步骤操作步骤 1 酶液的制备 1 取材 称取 0 5g 左右叶片 记下实际质量 g 2 研磨 将样品剪碎于研钵中 加入预冷的酶提取缓冲液 5mL 置冰浴上充分研磨 3 离心 匀浆液全部转入塑料离心管 于 4 下 以 10 000g 离心 15min 上清液全部倒入试管 此上清液即为粗酶液 待测 2 酶活力测定 1 将分光光度计预热 10min 波长定于 460nm 处 2 在玻璃比色杯内 先加入 2mL 醋酸 醋酸钠缓冲液和 1mL 0 25 愈创木酚溶液 再加入 0 05mL 或 0 1mL 酶液 视酶活力大小而定 最后加入 0 1mL 0 75 H2O2溶液 用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒混匀 3 立即把比色杯插入比色架 关盖 迅速把A460调至 0 并开始记时 每隔 30 秒读取并记录A460值 共读 3 分钟 注 酶液加入量一般控制在 5min 内使A460达到 0 5 0 8 为宜 六六 结果处理结果处理 1 以时间为横坐标 A460值为纵坐标 对所得数据进行线性作图 或用统计方法求 回归方程 2 求出上图中所作直线 或回归方程 的斜率 即 A460 min 1 此为反应的初速 度 3 求出每克鲜重植物样品中过氧化物酶的活力单位 以U g 1FW表示 七七 思考题思考题 1 酶活力测定为什么必须测定酶反应的初速度 2 在本实验的酶提取和酶活力测定时 为什么用不同的缓冲液 一一 目的目的 了解酶活力测定的基本原理与酶活力表示法 掌握简易凝胶层析与过氧化氢酶活力连续记录测定的操作与计算 二二 原理原理 过氧化氢酶 Cata1ase CAT EC 1 11 1 6 是以亚铁原卟啉为辅基的生物体内清除 H2O2 的重要酶之一 其催化的反应为 通过上述反应 CAT 可以降低生物体内有毒害作用的过氧化氢水平 减少自由基和过氧化脂质的形成 对生物体起重要的保护作用 传统测定 CAT 活力 活性 的方法有滴定法和测压法 但这两种方法不仅误差较大 且比较复杂 本实验采用紫外分光连续记录测定法 具有操作简单 灵敏度 高 结果直观的优点 测定时 酶反应在紫外分光光度计的石英比色皿中进行 分光光度计与记录仪相连接 由于 H2O2 在 240nm 处有吸收峰 加入酶液后会使 A240 下降 而 A240 下 降的情况又可以记录在纸上 从记录的初始直线段计算 A240 的变化速率 DA240 min 1 最后根据酶液体积和样品鲜重可以直接算出 DA240 min 1 g 1Fw 并以此来表 示样品中 CAT 活力的大小 三三 实验材料及设备实验材料及设备 1 材料 小麦叶片 或其它禾本科植物叶片 2 仪器 电子天平 高速冷冻离心机 记录仪 紫外分光光度计 3 器材 层 析 柱 1 套 刻度试管 5mL 10 移 液 管 5mL 1 微量进样器 1000ml 1 200ml 1 可调 塑料离心管 7mL 1 小 试 管 1 支 滴 管 2 洗 耳 球 2 硫 酸 纸 研钵 洗瓶 试管架 移液管架 玻棒 各 1 四四 试剂的配制试剂的配制 1 提取缓冲液 0 05mol L pH7 0 PBS 内含 l PVP 2 CAT 反应液 0 05mol L pH7 0 PBS 内含 0 015mol L H2O2 3 层析介质 Sephadex G 25 五五 操作步骤操作步骤 1 粗酶液的制备 1 取材 称取 0 5g 左右的生物材料 记下实际质量 2 研磨 将样品剪碎于研钵中 加入预冷的提取缓冲液 5mL 置冰浴上充分研磨 如不易研磨 加少量石英砂 3 离心 匀浆液全部转入 7mL 塑料离心管 平衡后于 4 下 以 10 000g 离心 10 分钟 上清液全部倒入刻度小试管 准确记下其体积 此上清液即为粗酶液 置于冰浴中备用 2 粗酶液的初步纯化 1 上样 用可调微量进样器或移液管吸取 1mL 粗酶液过 Sphadex G 25 小柱 总床体积 7mL 参照 凝胶层析脱盐 实验的上样步骤 2 收集 每管收 2mL 共收集 4 支试管 然后关闭出口 3 检测 将收集到的洗脱液每管取 0 4mL 到相应的另一支空试管中 用考马斯亮蓝检测是否有蛋白质 4 合并 将检测到含有蛋白质的对应的几支管等体积混合 摇匀 即为初步纯化的粗酶液 置于冰浴中备用 3 酶活力测定 1 紫外分光光度计与记录仪相连接 波长定于 240nm 处 记录仪的量程定于 50mV 处 预热 10min 仪器调零 2 在光径为 1cm 的石英比色皿内 先加入 3mL CAT 反应液 再加 0 1mL 的粗酶液或初步纯化的粗酶液后 视酶活力大小而定 用硫酸纸盖住比色皿迅速颠倒 混匀数次 不要过分剧烈颠倒 立即把石英比色皿插入比色架上 关盖 同时将记录仪的纸速开关拨至 4mm min 处 A240 的变化情况被记录于纸上 3min 后关 闭纸速开关 3 重复步骤 2 再测定 1 2 次 六六 结果处理结果处理 1 在记录纸上取实验记录得到的直线一段 计算该直线段与记录纸横轴交角的余切值 得 A240 min 1 记录纸的纵轴为时间分钟 横轴为光吸收 A240 该 余切值代表酶反应的初速度 最后取重复测定的平均值 2 根据活力测定的酶液加入量 酶液总体积和样品鲜重 计算植物样品中 CAT 活力 以 A240 min 1 g 1Fw 表示 包括粗酶液与初步纯化的粗酶液 七七 思考题思考题 1 什么是酶反应进程曲线 它对酶活力测定有何意义 2 什么是酶浓度曲线 它对酶活力测定有何意义 3 粗酶液与初步纯化过的粗酶液过氧化氢酶活力哪个大 为什么 如果要计算纯化倍数 还应该做哪些工作 并如何计算 一一 目的目的 了解纸电泳法分离带电颗粒的原理 观察核苷酸类物质的紫外吸收现象 二二 原理原理 带电荷的物质在电场中向阳极或阴极移动的现象称为电泳 控制电泳条件 使混合样品中的不同组份带不同电荷 因而各组份在电场中移动方向或速度各不相同 从而达到分离目的 以滤纸作支持物的电泳称为纸电泳 本实验用纸电泳法分离腺一磷 AMP 腺二磷 ADP 腺三磷 ATP 在 pH4 8 的电泳缓冲液中 由于三种腺 苷酸带有不同量的磷酸基团 它们解离后 带有负电荷量的顺序为 ATP ADP AMP 故能通过电泳在滤纸上得以 分离 利用核苷酸的碱基具有紫外吸收性质 将分离后的电泳纸放于紫外灯下 参照标准品 对组份进行鉴定 三三 实验材料及设备实验材料及设备 1 材料材料 ATP 药片 2 仪器仪器 电泳仪 电泳槽 水平式 紫外检测仪 电吹风 3 器材器材 电泳滤纸 新华 1 号滤纸条 2cm 25cm 移 液 管 2mL 1 洗 耳 球 2 研钵 洗瓶 移液管架 滴管 各 1 铅笔 尺 毛细管 镊子 四四 试剂的配制试剂的配制 1 柠檬酸缓冲液 柠檬酸缓冲液 0 05mol L pH4 8 称取柠檬酸 12 08g 柠檬酸钠 19 85g 溶于蒸馏水 定容至 2500mL 2 标准腺苷酸溶液标准腺苷酸溶液 用蒸馏水将纯 AMP ADP ATP 分别配成 100mg 10mL 溶液 当日配置 置冰箱备用 五五 操作步骤操作步骤 1 样品液的制备样品液的制备 取一粒 ATP 药片于研钵中 加 2mL 水研磨备用 2 点样点样 取 25cm 2cm 的滤纸条放在一张清洁的点样衬纸上 在距滤纸条一边 7cm 处用铅笔轻划一点样线 作记号 用毛细管依次将标准液及混合液点于记号处 注意斑点直径勿超过 2mm 每样点 2 3 次 每点一次用冷风吹干 3 电泳电泳 将滤纸平整地放在电泳槽的滤纸架上 纸两端浸入电极缓冲液中 用滴管将电泳缓冲液 pH4 8 均匀地滴于纸上 点样处最后湿润 盖上电泳槽盖 接上电极 点样端接负极 接通电源 调电压至 300V 室温通电 2 小时 电泳完毕后 关闭电 源 取出滤纸 将其用冷风吹干 4 鉴定鉴定 在暗室条件下 将干滤纸置于紫外灯下观察 用铅笔将各斑点划出 并测定各斑点的迁移距离 六六 结果处理结果处理 1 画出标样和未知样品的电泳结果示意图 画出标样和未知样品的电泳结果示意图 2 以三种标准腺苷酸的迁移距离值作标准 鉴定样品中斑点所代表的核苷酸种类 以三种标准腺苷酸的迁移距离值作标准 鉴定样品中斑点所代表的核苷酸种类 七七 思考题思考题 在纸电泳中如何尽量减小样斑的扩散 激发学生的实验兴趣 在课余时间学习更多的知识 提高学生的实验技能和创新能力 其主要形式有 学生根 据个人兴趣和发展方向 查阅资料 自选实验 实验指导教师选定一些实验 学生自由组合选做 由实验教师指定 实验项目 学生自行设计 参考实验项目参考实验项目 1 钼酸铵比色法测定钼酸铵比色法测定 Vc 的含量的含量 2 2 6 二氯酚靛酚测定二氯酚靛酚测定 Vc 的含量的含量 3 DNA 与与 RNA 的提取分离及颜色反应的提取分离及颜色反应 4 糖的还原作用糖的还原作用 5 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 G 250 比色法测定蛋白质的含量比色法测定蛋白质的含量 6 鸡蛋中鸡蛋中 蛋清 蛋黄蛋清 蛋黄 蛋白质的测定蛋白质的测定 7 不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳 8 从牛奶中分离制备酪蛋白从牛奶中分离制备酪蛋白 9 蛋白两性反应和等电点测定蛋白两性反应和等电点测定 10 双缩脲法测定蛋白质含量双缩脲法测定蛋白质含量 11 蛋白质颜色反应蛋白质颜色反应 12 RNA 的提取与的提取与 pH 的关系的关系 13 盐析测蛋白质含量盐析测蛋白质含量 14 测定物质中游离的氨基酸浓度测定物质中游离的氨基酸浓度 15 苯酚法提取苯酚法提取 RNA 并紫外吸收法测含量并紫外吸收法测含量 16 血糖的定量测定血糖的定量测定 17 一定时间唾液淀粉酶体外水解淀粉产物的测定一定时间唾液淀粉酶体外水解淀粉产物的测定 18 酶促转氨反应酶促转氨反应 19 丙酮酸含量的测定丙酮酸含量的测定 20 酪蛋白等电点测定酪蛋白等电点测定 21 Tales 微量快速乳糖测定微量快速乳糖测定 22 猪肝脏猪肝脏 DNA 的提取纯化及鉴定的提取纯化及鉴定 23 利用酶观察不同条件下失活的蛋白质能否复活利用酶观察不同条件下失活的蛋白质能否复活 24 Lineweaver Burk 作图法测定唾液淀