实验二十-日本血吸虫病实验室诊断技术

实验二十实验二十 日本血吸虫病实验室诊断技术日本血吸虫病实验室诊断技术 日本血吸虫病是一种人畜共患的寄生虫病 被世界卫生组织列为全球重点防治疾病之一 它严重 威胁着疫区人和动物的健康和生命安全 给畜牧业带来巨大的经济损失 在我国 本病严重流行于长 江流域及其以南 13 个省 市 自治区 家畜如牛 羊 猪感染日本血吸虫后 不仅祸害自身 更重要 的是作为人体血吸虫病的主要保虫宿主 为传播本病起了重要作用 大量调查研究表明 家畜是血吸 虫病流行最主要的传染源和污染源 控制传染源是综合防治疫病 扑灭疫情的重要环节 而控制传染 源的前提是确诊传染源 因此 应用灵敏 快速 经济的诊断方法确诊传染源 己成为日本血吸虫病 流行病学调查 疫情监测 以及控制其流行和扑灭疫情必需解决的问题 这样才能做到有的放矢 减 少在人力 物力和财力等方面的浪费 当前对于日本血吸虫病的诊断方法已有大量的报道 根据本科教学的需要 下面介绍几种本科阶 段应该掌握或者需要了解的实验室常用的日本血吸虫病诊断方法 一 一 实验目的及要求实验目的及要求 1 熟悉日本血吸虫卵和毛蚴的形态特征 2 掌握血吸虫病虫卵检查方法 3 掌握血吸虫病毛蚴孵化方法 4 了解血吸虫病的几种常见的血清学 免疫学 诊断方法 二 实验器材二 实验器材 一一 病原学诊断病原学诊断 1 直接涂片法 1 检验材料 新鲜动物粪便 2 试剂 50 甘油水溶液或普通水 3 器材 载玻片 滴管 盖玻片 显微镜 2 沉淀法 1 检验材料 新鲜动物粪便 2 试剂 普通水 3 器材 专用乳白色塑料粪杯 竹筷 铜筛 滴管 金属环 载玻片 显微镜 普通离心机 3 浮集法 1 检验材料 新鲜动物粪便 2 试剂 普通水 饱和食盐水 33 的硫酸锌溶液 3 器材 专用乳白色塑料粪杯 竹筷 铜筛 60 目 英寸 滴管 金属环 载玻片 显微镜 4 毛蚴孵化法 1 检验材料 新鲜动物粪便 2 试剂 pH 约 6 8 7 2 温度约 20 30 的灭菌自来水 脱氯处理 3 器械 专用乳白色塑料粪杯 竹筷 铜筛 40 目 英寸 尼龙筛网兜 260 目 英寸 塑料 袋 长颈烧瓶 或三角瓶 500ml 脱脂棉 天平 温箱 二二 血清学血清学 免疫学免疫学 诊断诊断 1 环卵沉淀试验 COPT 1 检验材料 新鲜动物血清 2 试剂 血吸虫冻干虫卵 标准阳性血清 标准阴性血清 3 器材 滴管 载玻片 盖玻片 24 24mm 蜡杯 熔蜡用 玻璃蜡笔 脱脂棉 有盖盘 酒精灯 温箱 计数器 显微镜 2 间接血凝试验法 IHA 1 检验材料 动物血清 2 试剂 生理盐水 蒸馏水 血吸虫病血凝抗原 标准阳性血清 标准阴性血清 3 器材 96 孔微量血凝板 25 l 和 100 l 微量移液器 3 胶乳凝集试验 LA 1 检验材料 动物血清 2 试剂 PAPS 血吸虫病快诊液 标准阳性血清 标准阴性血清 生理盐水 蒸馏水 磷酸盐 缓冲液 PBS pH7 2 3 器材 12 16cm 玻璃凝集反应板 25 l 和 100 l 微量移液器 手术剪刀 洁净纸 冰箱 中性滤纸 2 5 2 5cm 2ml 一次性注射器 4 斑点酶联免疫吸附试验 Dot ELISA 1 检验材料 动物血清 2 试剂 三联斑点酶联免疫吸附诊断试剂盒 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所 生理盐水 吐温 20 30 过氧化氢 3 器材 5ml 或 10ml 试管 多支 试管夹 镊子 50ml 或 100ml 烧杯 多个 100ml 量筒 温箱 50ml 棕色试剂瓶 25 l 和 100 l微量移液器 小纸片多条 5 免疫印迹试验 1 检验材料 动物血清 2 主要试剂 样本缓冲液 含甘油 10ml 2 巯基乙醇 5ml 10 SDS 30ml 转印缓冲液 TB Tris 3g 甘氨酸 14g 甲醇 250ml 加水至 1000ml Tris 缓冲盐水 TBS 10mmol L Tris 含 0 9 NaCl 用 1N HC1 调 pH 至 7 4 TBS T 液 TBS 液内含 0 05 Tween 20 的 TBS 液 猝火剂 1 5 BSA 或 0 1 0 3 Tween 20 的 TBS 液 氨基黑染液 0 1 W V 氨基黑 C I 20470 45 V V 甲醇 10 V V 冰醋酸 脱色液 90 V V 甲醇 2 冰醋酸 3 器材 转移电泳仪 硝酸纤维素膜 滤纸 剪刀 手套 小尺等 三 实验方法 步骤和操作要领三 实验方法 步骤和操作要领 一一 病原学诊断病原学诊断 1 直接涂片法 粪便中虫卵数量多时可采用直接涂片法检查 用滴管在载玻片表面加 50 甘油水 溶液或普通水 1 2 滴 取黄豆大小的被检粪块放入液滴内 混匀 剔除粗粪渣 加盖盖玻片 显微镜 下镜检虫卵 见图 20 1 2 沉淀法 日本血吸虫卵的比重大可沉集于水底 可采用自然沉淀法或离心沉淀法检出 取粪便 20 30g 加水成混悬液 经金属筛 40 60 孔 或 2 3 层湿纱布过滤 再加清水冲洗残 渣 过滤粪液在容器中静置 25min 倒去上液 重新加满清水 以后每隔 15 20min 换水一次 3 4 次 直至上液清晰为止 最后倒去上液 取沉渣作涂片镜检 附 离心沉淀法 将上述滤去粗渣的粪液离心 1500 2000rpm 1 2min 倒去上液 注入清水 再离心沉淀 如 此反复沉淀 3 4 次 直至上液澄清为止 最后倒去上液 取沉渣镜检 3 浮集法 利用比重较大的液体 日本血吸虫卵比重约 1 16 使日本血吸虫虫卵上浮 集中于 液体表面 常用的方法有两种 1 饱和盐水浮集法 用竹筷取黄豆粒大小的粪便置于浮集瓶 高 3 5cm 直径约 2cm 的圆形直 筒瓶 中 加入少量饱和盐水 比重约 1 18 调匀 再慢慢加入饱和盐水到液面略高于瓶口 但不溢 出为止 此时在瓶口覆盖一载玻片 静置 15min 后 将载玻片提起并迅速翻转 镜检 附 饱和盐水配制 将食盐徐徐加入盛有沸水的容器内 不断搅动 直至食盐不再溶解为止 2 硫酸锌离心浮聚法 取粪便约 1g 加 10 15 倍的水 充分搅碎 按离心沉淀法过滤 反复 离心 3 4 次 至水清为止 最后倒去上液 在沉渣中加入比重 1 18 的硫酸锌液 33 的溶液 调 匀后再加硫酸锌溶液至距管口约 1cm 处 离心 1min 用金属环取表面的粪液置于载玻片上 加碘液一 滴 镜检 4 毛蚴孵化法 毛蚴孵化法是日本血吸虫病病原学检查最常用的方法 其操作步骤如下 1 取新鲜粪便 300g 搅拌混匀后分成三份 每份 100g 2 将分好的粪便置于 40 目铜筛滤杯内 然后将该铜筛放入预先盛好水的粪杯内进行淘洗 淘 洗时三上三下 力求将血吸虫虫卵全部洗下 除去滤渣 3 将滤液倒入 260 目尼龙筛兜 用清水继续淘洗 至滤水清晰 4 将网兜内粪样捏干成团块包入纸内 放入塑料袋内保湿 在 30 温箱中孵育 24h 5 将孵育好的粪样倒入 500ml 的长颈烧瓶 或三角瓶 内 加孵化用水至瓶颈处 在烧瓶瓶 颈处塞一团脱脂棉 脱脂棉与粪水之间不能留有空气柱 再加清水至距瓶口 1 2cm 处 保持温度在 22 26 间 进行孵化 6 分别在开始孵化后 1 3 5h 各观察一次 观察时间 2min 以上 发现水面下有白色点状物直 线来回运动 即为毛蚴 判为阳性 并记录 二 血清学 免疫学 诊断 二 血清学 免疫学 诊断 近些年来已将血清学诊断法应用于生产实践 如环卵沉淀试验 间接血凝试验 胶乳凝集试验和 斑点酶联免疫吸附试验等 其检出率可在 95 以上 假阳性率在 5 以下 1 环卵沉淀试验 COPT 原理 环卵沉淀试验 circumoval precipitin test COPT 是以血吸虫全卵为抗原的特异免疫血 清学试验 卵内毛蚴或胚胎分泌排泄的抗原物质经卵壳微孔渗出与检测血清内的特异抗体结合 可在 虫卵周围形成特殊的复合物沉淀 在光镜下判读反应强度并计数反应卵的百分率称环沉率 操作步骤 1 取载玻片 在其中央横轴两侧涂两条平行蜡 蜡间距离与盖玻片宽度相同 图 20 1 日本血吸虫虫卵 2 用滴管吸取被检动物血清 1 2 滴 约 25 l 用针挑取虫卵约 100 个 放入血清中 并用 针搅拌 使虫卵散开 盖好盖玻片 四周用蜡封闭 3 将制好的玻片放入湿盒 在有盖盘中预先放置一层湿纱布 置 37 温箱中培养 4 48h 后 取出切片在显微镜下观察 记录环沉情况 并计算环沉率 判定标准 1 环沉判定标准 块状反应物大于 1 8 而小于 1 2 虫卵面积或索状反应物大于 1 3 而小于 1 2 虫卵长径 记为 或 块状反应物面积大于 1 2 虫卵面积或索状反应物大于 1 2 虫卵长径 记为 或 2 阳性判定标准 环沉率达 5 者为阳性 环沉率 全片阳性反应卵数 全片虫卵数 100 2 间接血凝试验法 原理 间接血凝试验 indirect haemagglutination test IHA 是以甲醛和鞣酸处理过的绵羊红 细胞或 O 型人红细胞为载体 将血吸虫虫卵或成虫抗原吸附于载体上 当受检动物血清中存在相 应的抗体时 红细胞会因抗原 抗体的结合而被动呈现凝集现象 IHA 操作简便 敏感性高 适于现场 使用 可作为辅助诊断病人 流行病学调查及综合查病方法 操作步骤 1 用微量移液器在血凝板左边第一孔 第二孔 第三孔内分别加入生理盐水 100 l 25 l 25 l 2 在第一孔内加入被检血清 25 l 混匀 使血清成 1 5 稀释 3 吸取 25 l 第一孔的血清液 加入第二孔 混匀 此孔血清成 1 10 稀释 4 吸取 25 l 第二孔的血清液 加入第三孔 混匀 此孔血清成 1 20 稀释 然后吸取 25 l 此孔血清液丢弃 5 如有多份样本 每个样本均按上述操作处理 6 阳性对照和阴性对照采用标准血清也按上述操作处理 另外用生理盐水设空白对照 7 用移液器吸取血吸虫病血凝抗原 在各个样本和对照的 1 10 和 1 20 的稀释孔分别加 25 l 震荡混匀 置于 37 条件下 当空白或阴性血清两孔的血球全部沉于孔底中央 即无圆形红 点或仅有小的圆形红点 时 即可判定诊断结果 判定标准 1 反应强度判定 红血球全部下沉到孔底中央 形成紧密红色圆点 周缘整齐为阴性 红血球少量沉于孔底中央 形成一较阴性小的红色圆点 周围有少量凝集红血球为弱阳性 红血球半数沉于孔底中央 形成一更小的红色圆点 周围有一层淡红色凝集红血球为阳性 红血球 75 以上散于孔底斜面 形成一层淡红色薄层为强阳性 红血球全部凝集 均匀散于孔底斜面 形成一层淡红色薄层为强阳性 2 阳性血清判定 以血清 1 10 稀释孔出现阳性 包括弱阳性 时被检血清判定为血吸虫病畜阳性 3 胶乳凝集试验 LA 原理 胶乳凝集试验 latex agglutination test 是以聚苯乙烯胶乳颗粒为载体 将血吸虫抗原联结在胶 乳颗粒上 试验时将一定量的联结有抗原的胶乳试剂加入待检血清中 如待检血清中有相应的抗体 则抗原抗体结合 胶乳颗粒发生凝集 操作步骤 1 在 12 16cm 玻璃凝集反应板的左边第一孔中加 PBS 液 100 l 第二孔加 PBS 液 25 l 2 在第一孔中加待检血清 25 l 混匀 使第一孔成 1 5 稀释 3 在第二孔中加第一孔稀释血清液 25 l 混匀 使第二孔成 1 10 稀释 4 在每孔中加 PAPS 快诊液 25 l 混匀 10min 后观察结果 判定标准 1 反应强度判定 1 2min 内胶乳全部凝集出现粗颗粒 并且四周形成一白色框边 液体清亮 记为 3 4min 内胶乳全部凝集出现粗颗粒 四周白色框边不太明显 液体较清亮 记为 5 6min 内 70 80 胶乳出现凝集颗粒 液体微浑浊 记为 8 10min 内 40 50 胶乳出现凝集颗粒 液体微浑浊 记为 不出现凝集颗粒 呈白色均匀浑浊状 记为 2 阳性血清判定 1 10 第二孔 血清稀释孔出现 即判为阳性 4 斑点酶联免疫吸附试验 Dot ELISA 原理 斑点 ELISA dot ELISA 是在 ELISA 技术基础上发展起来的一种技术 选用对蛋白质有 很强吸附能力的硝酸纤维素薄膜作固相载体 底物经酶促反应后形成有色沉淀物使薄膜着色 然后目 测或用光密度扫描仪定量 dot ELISA 可用来检测抗体 也可用来检测抗原 由于该法检测抗原时操 作较其他免疫学试验简便 故目前多用于抗原检测 试剂准备 本实验采用三联斑点酶联免疫吸附诊断试剂盒 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所 试剂盒内有试剂 1 2 3 4 5 试剂 6 7 8 9 10 需现配现用 配置方法如下 试剂 6 1 包试剂 1 配 500ml 生理盐水 溶解后加入 2ml 吐温 20 混匀 试剂 7 1 包试剂 2 配 500ml 生理盐水 溶解后即成 试剂 8 量取 25ml 试剂 6 倒入烧杯中 将试剂 3 纸片浸入即成 试剂 9 吸取 5ml 试剂 6 加入试剂 4 中 待溶解后倒入烧杯中 再量取 20ml 试剂 6 洗试剂 4 瓶 3 次 倒入烧杯中 混匀即成 试剂 10 量取 40ml 试剂 7 倒入烧杯中 将试剂 5 加入 置 37 温箱避光溶解后 取出在室温下 置于避光容器 棕色瓶 中待用 操作步骤 1 用记号笔在试管上标好待检血清号码 用铅笔在诊膜右端遍上待检血清号码 用剪刀将膜条 剪下 放入相应试管中 2 分别在每个试管中加入 1 5ml 的试剂 6 3 分别在各个试管中加 4 l 相应编号的待检血清 轻轻摇匀 4 将摇匀的试管置于 37 温箱中孵育 50 60 分钟 每隔 20 分钟轻轻摇动试管一次 5 取烧杯一只 加入约 40ml 试剂 6 用镊子将每支试管中膜夹出 放入盛有试剂 6 的烧杯中 每隔 2 分钟 轻轻摇动洗涤 1 次 共计三次 6 洗涤好的膜用镊子夹出 放在滤纸上吸去膜表面水后 放入盛有试剂 8 的烧杯中 用镊子翻 动膜 使其充分接触液体 然后 置于 37 温箱中反应 50 60min 隔 25min 用镊子翻动膜 1 次 7 反应结束后洗涤膜三次 方法同 5 8 用滤纸吸去膜表面水后 将膜放入盛有试剂 9 的烧杯中 用镊子翻动膜 使膜浸在液体中 置于 37 温箱中反应 40 分钟 隔 25 分钟用镊子翻动膜 1 次 9 反应结束后洗涤膜三次 方法同 5 和 7 10 用可调微量移液器吸取 30 过氧化氢 40 l 加入盛有试剂 10 的烧杯中摇匀后 迅速用滤纸 吸去膜表面水 放入烧杯中 轻轻摇动 待有任一清晰斑点出现后终止反应 11 将烧杯中的反应液弃去 用自来水充分洗涤至水清为止 然后判定结果 判定标准 1 反应强度判定 深棕色为 浅棕色为 黄色为 浅黄色为 稍有 黄色为 无色为 2 阳性血清判定 凡出现 即判为阳性血清 5 免疫印迹试验 原理 免疫印迹试验 immunoblot 或 Western blot 是由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳 SDS PAGE 电泳转印及标记免疫试验三项技术结合而成的一种新型的免疫探针技术 immuno probing technique 是用于分析蛋白抗原和鉴别生物学活性抗原组分的有效方法 近年 来已应用于检测寄生虫感染宿主体液内针对某分子量抗原的相应循环抗体成分或谱型 是一项高敏感 和高特异的诊断方法 具有很大发展潜力 用于诊断的免疫印迹试验以采用酶标记的探针 即二抗及 其标记结合物 为安全方便 称酶免疫转移印迹试验 enzyme immuno transfer blotting EITB 操作程序 样本分离 取日本血吸虫新鲜成虫按 5 10 对 1 5ml 比例加样本缓冲液 匀浆 置沸水浴 2 分钟 离心 10000g 30min 取上清液备用 上述成虫抗原样本进行单梳 SDS PAGE 电泳分离 左侧梳孔加标准分子量蛋白 梳孔右侧样槽 加抗原液 电压控制在 160 180V 之间 电泳转印 从电泳板中取出已完成电泳的凝胶片浸泡于盛有转印缓冲液 TB 的搪瓷盘内 在 TB 液内组成转印夹心板层 取相应大小的硝酸纤维 NC 薄膜 徐徐浸泡在 TB 液 将凝胶 片与薄膜光面紧贴 两面各放置浸湿滤纸两层而后海绵垫 厚 0 5 1cm 一层 做好方位标记 最后 夹于二层有孔塑料衬板之间 绝对避免各层之间留有气泡 将 TB 倒入转印槽中 然后插入转印板 使凝胶片位于阴极侧 NC 薄膜位于阳极侧 置转印槽于 4 冰箱内 通电转印数小时或过夜 电流控制在 250mA 上下 约 40 50V 探针检测 取出转印好的 NC 薄膜 水平地放入猝火剂中 室温摇动 1h 以封闭未吸附蛋白质的区域 然后 用洗涤缓冲液选 2 3 次 每次 30min 以除去变性剂 使蛋白质的天然状态和生物学特性得以恢复 平置 NC 薄膜于浸有 Tris 缓冲盐水 TBS 的滤纸上 用刀片将薄膜按电泳方向分割为宽约 0 5cm 的直